Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse af Shear Flow-induceret Migration af Murine Marginal Zone B-celler In Vitro

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58759
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry and Cell Biology, OVGU University of Magdeburg

Summary

Marginal zone B celler (MZBs) reagere på kraften af shear flow ved re orientere deres overflytningssti op for strømmen. Denne protokol viser, hvordan man registrere og analysere migration ved hjælp af en fluidics enhed, pumpe, mikroskop billedbehandlingssystem og fri software.

Abstract

Marginal zone B celler (MZBs) er en befolkning af B-celler, der findes i de mus milt marginale zoner, at indhylle follikler. For at nå follikler, skal MZBs overflytte op shear kraften af blodgennemstrømningen. Vi præsenterer her en metode til at analysere dette flow-induceret MZB migration in vitro. Første er MZBs isoleret fra mus milten. Det andet er MZBs fast på integrin ligander i flow kammer dias, udsat for shear flow, og afbildet under et mikroskop under overflytning. Tredje, billeder af de overfører MZBs behandles ved hjælp af den MTrack2 automatiske celle tracking plugin for ImageJ, og de resulterende celle spor er kvantificeret ved hjælp af værktøjet Ibidi chemotaxis. Overførselsdataene afsløre hvor hurtigt cellerne bevæger sig, hvor ofte de skifter retning, om shear flow vektor påvirker deres migration retning og hvilken integrin ligander er involveret. Selv om vi bruger MZBs, kan metoden let tilpasses til at analysere migration af enhver leukocyt, der reagerer på kraften af shear flow.

Introduction

Immunceller er de mest motile celler i den menneskelige krop og ofte skal slås med shear kraft fra blod og lymfe flow. Men der er forholdsvis få undersøgelser på shear kraft-induceret migration af leukocytter1,2,3,4,5. Her præsenterer vi en pålidelig og kvantitative protokol for at analysere svar af en immun celle til flow in vitro. Udfører analysen kræver ikke fabrikation af komponenter, og alt udstyr og forbrugsmaterialer er kommercielt tilgængelige. Protokollen, herunder celle rensning og migration analyse, kan udføres på en enkelt dag. Endelig, selv om vi beskrive migration af marginale zone B-celler (MZBs), protokollen kan tilpasses for at analysere migration mod strømmen af andre typer af immunceller. Derfor er det muligt at bruge denne analyse til systematisk analysere en bred vifte af leukocytter med en omfattende panel af betingelser.

MZBs er en befolkning af B-celler, der i musen, findes kun i milt og transport mellem indre af follikler og marginale zoner6,7,8,9. Den marginale zone er et lag af immunceller ca 5-10 celler tykke. Cellelag indhyller hårsækken og består primært af MZBs og makrofager, men også invariante natural killer T (iNKT) celler, dendritiske celler (DCs) og neutrofiler, blandt andre10. Cellerne i den marginale zone er udsat for ensrettet blodgennemstrømning med oprindelse fra milt arterier, der afsluttes i en marginale sinus omkring hårsækken. Blodet løber fra huller i den marginale sinus gennem den marginale zone og derefter indsamlet i venøse bihuler i den røde papirmasse og restaureret til omsætning11. Gratis strømmen af blod vasker over MZBs og udsætter dem for antigener transporteres i blodet. MZBs bære antigenet i hårsækken af shuttling automatisk mellem den marginale zone og inde i hårsækken, som ikke er udsat for blod. Således som MZBs lufthavnstransport mod hårsækken, skal de overflytte op shear kraften af blod flow12 (figur 1A).

I denne protokol, vi beskriver, hvordan at bestemme kvantitativt, hvordan immun celler som MZBs reagere på enten ingen flow eller højt flow in vitro-, for at afsløre, hvordan de er programmeret til at overflytte in vivo. I det første trin, er MZBs renset fra en mus milten ved hjælp af magnetiske perler koblet til antistoffer fra kommercielt tilgængelige kits. De frisk isolerede MZBs er indført i brønden af et flow kammer dias, lov til at bosætte sig på integrin ligander og udsat for strømmen af migration buffer ved hjælp af en pumpesystem (figur 2A). Cellerne er afbildet ved hjælp af en time-lapse video mikroskopi. Billeder behandles derefter til analyse med en gratis ImageJ plugin, MTrack213,14, til automatisk at spore celler. Spor kan derefter kvantificeres med gratis Ibidi Chemotaxis værktøj15 til at bestemme forskellige parametre, herunder hastighed, rethed og migration indeks. Disse værdier kan bruges til at fastslå virkningerne af migration hæmmere, celle Stimulatorer, kemokiner og andre kemikalier, der berører migration for shear-flow induceret migration for at forstå de kræfter, der styrer immun celle bevægelse in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter, der involverer brugen af dyr har tidligere godkendt Landesverwaltungsamt Halle (Sachsen-Anhalt), Tyskland, i overensstemmelse med alle retningslinjer for det medicinske fakultet på OVGU Universitet af Magdeburg.

1. MZB celle rensning

  1. Isolere leukocytter.
    1. Ofrer et 8 til 16 uger gamle mus og fjerne milten16. Adskille milten i 5 mL iskold celle buffer [fosfatbufferet saltopløsning (PBS) + 0,5% fedtsyre-fri bovint serumalbumin (BSA)], af enten ved hjælp af en væv-dissociator eller forsigtigt mase milt gennem en 70 µm celle si mesh i en brønd på en 6-godt plade med stemplet fra en 5 mL sprøjte.
    2. Overfør celler i celle buffer ind i en 15 mL konisk rør. Indsamle yderligere celler ved at tilføje en anden 5 mL iskold celle buffer til væv dissociator tube eller nylon mesh i brønden. Overføre de yderligere 5 mL celle buffer plus celler til den koniske rør. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved stuetemperatur (RT, 20 ° C) og supernatanten.
  2. Udføre røde blodlegemer lysering.
    1. Genopslæmmes celle pellet i 1 mL af røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA), som er pre varmede på RT. Føj en ekstra 1,5 mL af RBC lysisbuffer og slyng for at blande. Der inkuberes ved RT (20 ° C) i alt 2 min, herunder den tid, der kræves til genopslæmmes pellet.
    2. Tilsættes 7,5 mL af iskold celle buffer til cellesuspension til at stoppe lysering. Der centrifugeres ved 300 x g og 4 ° C i 10 min og supernatanten.
    3. Genopslæmmes celle pellet i 1 mL af celle buffer og tilføje en yderligere 9 mL celle buffer. Der afpipetteres 10 mL cellesuspension gennem en 30 µm før adskillelse filter i en ny 15 mL konisk slange til at fjerne celle debris.
    4. Centrifugeres celler på 300 x g og 4 ° C i 10 min og supernatanten. Genopslæmmes celle pellet i 500 µL af celle buffer. Hold celler koldt på alle efterfølgende trin i proceduren indtil inkubation i flow kammer dias.
  3. Rense MZBs.
    1. Tilføje 50 µL af biotin-kombineret antistoffer fra et kommercielt tilgængeligt kit mod alle uønskede celler, herunder CD43 (på ikke-B-celler), CD4 (på T-celler), CD93 (på umodne B-celler) og Ter119 (på erytrocytter), til cellesuspension i en konisk slange. Ryste eller svirp rør forsigtigt for at blande, men gør ikke vortex cellerne. Lægge den koniske rør på en seng af is i en næsten flad vinkel og rock på 25 rpm i 15 min.
    2. Tilføje magnetiske perler koblet til anti-biotin antistoffer i en samlet maengde paa 100 µL til cellesuspension. Fortsætte med at klippe cellesuspension ved 25 rpm på isen i 20 min. Skyl cellerne ved at tilføje 5 mL af celle buffer, centrifugering ved 300 x g og 4 ° C i 10 min og udsmid supernatanten. Genopslæmmes celler i 1 mL af celle buffer.
    3. Nedbryder cellesuspension af magnetisk koblede perle cellerne ved at beholde dem på en magnetisk kolonne. Kassér mærket celler (alle ikke-B-celler og umodne B-celler). Indsamle ikke-mærket celler (modne B-celler) i en 15 mL konisk slange, der har været præ-coatede med en kortfattet ansøgning af 5 mL af celle buffer, for at forhindre ikke-specifikke vedhæftning af MZBs.
    4. Vask cellesuspension med 5 mL af celle buffer. Der centrifugeres ved 300 x g og 4 ° C i 10 min og supernatanten. Genopslæmmes celler i 90 µL af celle buffer og tilsæt 10 µL af anti-CD23-kombineret perler. Rock cellesuspension forsigtigt på isen i 20 min. på 25 rpm.
    5. Vask cellesuspension med 5 mL af celle buffer. Der centrifugeres ved 300 x g og 4 ° C i 10 min og supernatanten. Genopslæmmes celler i 1 mL af celle buffer.
    6. Nedbryder cellesuspension af magnetisk koblede perle cellerne ved at beholde dem på en magnetisk kolonne. Kassér de mærket celler (follikulært B-celler). Indsamle ikke-mærket celler (MZBs), i en 15 mL konisk slange, der har været overfladebelagt med en kortfattet ansøgning af 5 mL af celle buffer. Fjerne 50 µL af celler til optælling og kontrol af renhed.
  4. Plette de sorterede MZBs at tjekke for renhed.
    1. Tilføje 10% volumen (5 µL) af Fc blok til 10.000 celler i 50 µL og inkuberes ved 4 ° C i 5 min. tilsættes 50 µL af celle buffer indeholdende 0,3 µL af B220-FITC (0,15 µg), CD21-PE (0,06 µg), og CD23-APC (0,06 µg) i en samlet maengde paa 105 µL (hver antistof fortyndet 1:350) , eller enhver anden kombination af fluorophores for at skelne mellem follikulært B-celler og MZBs. pletten celler ved 4 ° C i mørke i 15 min.
    2. Vask de farvede celler en gang med 1 mL af celle buffer. Der centrifugeres ved 300 x g og 4 ° C i 5 min og supernatanten. Resuspend i 300 µL af celle buffer og erhverve prøver ved hjælp af en flow forskellige og standardmetoder. Gate på live lymfocytter, derefter på B220+ -celler, og endelig på CD23lav CD21høj celler (figur 1B).
      Bemærk: Proceduren typisk udbytter 500.000 MZBs pr. milt fra en C57B/6 mus.
  5. Forberede MZBs for flow migration.
    1. Vask renset MZBs en gang i 1-2 mL af kolde migration buffer [Hanks' afbalanceret saltopløsning (HBSS) indeholdende kationer, 10 mM Hepes, 0,2% fedtsyre-fri BSA] at sikre, at kation-holdige migration buffer ikke udvandes af resterende kation-fri PBS buffer. Der centrifugeres ved 300 x g og 4 ° C i 10 min og supernatanten. Genopslæmmes MZBs i kolde migration buffer til en koncentration af 50.000 MZBs pr. 30 µL (svarende til det beløb, der er indlæst i et godt af et flow kammer dias).
      Bemærk: De frisk isolerede MZBs bør anvendes hurtigst muligt. Men de er stadig i stand til at migrere til op til 8 h eller mere efter starten af forsøget for så længe de holdes på is. Optimale temperaturer bør testes for andre celletyper. For eksempel kan det være bedre at holde kulturperler T celler ved 37 ° C indtil starten af migration.

2. flow eksperiment

  1. Frakke dias med integrin ligand.
    1. Dagen før eksperimentet, tø en alikvot af ICAM-1 (400 µg/mL). Fortynd ICAM-1 med en faktor på 1:80 i PBS at nå frem til en endelig koncentration på 5 µg/mL. Tilføj 30 µL af ICAM-1 til én afdeling på et flow dias for hver migration film kræves. Inkuber dias i et fugtigt kammer ved 4 ° C natten over.
      Bemærk: Hvert dias indeholder 6 kamre og op til 8 film i én session kan nemt registreres.
  2. Blokere de coatede brønde.
    1. På dagen for eksperimentet, vaske kammeret ved at tilføje 100 µL af PBS til en brønd og trække 100 µL fra de andre godt for sal. Tilsættes 100 µL blokerende buffer (2% fedtsyrer-fri BSA i PBS) til et kammer og der inkuberes dias i et fugtigt kammer ved RT for 1,5 h.
    2. Vask kammeret ved at tilføje 100 µL af PBS til en brønd, trække det fra de andre godt og derefter tilføje 100 µL af migration buffer til salen. Gemme diasene i et fugtigt kammer ved RT indtil eksperimentet.
  3. Forberede fluidics enheden.
    1. Stik i en væske pumpe, vedhæfte fluidics enheden, og tænd pumpen software. Vaske slangen én gang med 5-10 mL af migration buffer, derefter tilføje 11.7 mL af migration buffer lige til begge reservoirer og fjerne luftboblerne.
    2. Klemme slange omkring 10 cm fra stik stykke. Sted det fluidic enhed i opvarmet inkubation salen på mikroskopet.
    3. Sæt dias valg til "µ-dias VI 0,4" og slange til "hvid" i softwaren. Angiv den ønskede shear stress (fx 4 dyn cm-2). Indstille tidspunktet for billeddannelse til 30 min.
    4. Angiv kalibreringsfaktoren slangen ved at bestemme strømningshastigheden gennem slangen i mL/min. foranstaltning den tid, det tager for 2 mL buffer til at flyde fra et reservoir af den anden og dividerer med 2. Foretage mindst 4 målinger for nøjagtighed. Bruge den faktiske flow til at indstille den ønskede strømningshastighed og shear stress ved at indtaste værdierne i pumpen software.
  4. Forberede imaging systemet.
    1. Pre varm mikroskop inkubation afdeling, fluidics enhed og migration buffer delprøver til 37 ° C (figur 2B). Test fluidic pumpen ved at sikre, at migration buffer løber frem og tilbage i reservoirerne, og at der ingen luft bobler i systemet.
  5. Indlæse celler på diaset.
    1. Rense bunden af dias med en ethanol-dæmpet væv. Tilføj 30 µL af cellesuspension i en brønd i salen og trække 30 µL fra de andre godt. Inkuber dias med en dækning på at forhindre fordampning ved 37 ° C i 30 min at tillade cellerne til at vedhæfte.
    2. Langsomt tilføje pre varmede migration buffer til hver brønd af flow kammer dias, indtil en positiv menisk stiger ud af brønden og fjerner eventuelle luftbobler med pipette spids.
  6. Lægger diasset på fluidics enhed.
    1. Klemme dias til mikroskop fase. Fjerne den umarkerede side af fluidic slangen fra stik stykke og fylde ende med migration buffer, indtil en positiv menisk uden luftbobler stiger ud af udgangen.
    2. Flip slutningen af slanger over og indsætte det i den øverste godt flow kammer, rydning af spildt buffer med en væv. Samtidig med at slangen fastspændt, Gentag proceduren for den markerede slutningen af slangen.
  7. Billede af celler.
    1. Skifte til imaging system til "Live" til at sætte fokus på cellerne. Vælg en synsfelt, der er i midten af diaset. Nedtrapning fokus celler lidt for at forbedre den sort kontur af cellen og producerer en hvid interiør, som derefter kan thresholded til en runde sorte celle figur på en hvid baggrund til brug med en automatiseret sporing program.
    2. Starte programmet imaging sekvens og post 1 billede hvert 5 s til 30 min ved hjælp af 10 x tør mål. Fjerne klemmen fra slangen og tænde pumpen, så ikke-tilhænger celler vil vaske og vedhængende celler vil begynde at migrere. Billede for 30 min eller længere ved hjælp af en 10 x mål eller højere, som ønsket. Etiket og gemme filmen.
  8. Fjern det fluidic enhed fra diaset.
    1. For enden af billedbehandlingsprogrammet nulstille pumpe til det næste forsøg: Re-vedhæfte klemme til slangen, Fjern slangen fra diaset, Re-vedhæfte stik stykke, åbne klemmen og bruge den manuelle kontrol af pumpen til at skubbe flere mL buffer fra én reserv oir til den anden at fjerne luftbobler. Re-vedhæfte klemmen og lå fastspændt slangen på mikroskop fase til den næste film.
      Bemærk: Protokollen kan her være pause på ubestemt tid. Hvis bruger en inhibitor eller modifier celle migration, afhængigt af dets virkemåde, føje det til enten cellesuspension før afvikling i salen, migration eller migration buffer i fluidic enhed.

3. migration spor analyse

Bemærk: Celler kan spores automatisk ved hjælp af MTrack2 plugin eller ved hånden ved hjælp af manuel sporing plugin17. Automatisk sporing fungerer godt med MZBs, da disse celler er hovedsagelig runde og forbliver således under overflytning, gør det nemt at tærsklen billedet af cellerne til sorte objekter på en hvid baggrund. Automatisk sporing er vanskeligere, hvis andre celletyper der anvendes, såsom kulturperler, aktiveres CD8 + T celler, fordi disse celler strække ud under migration og blive lidt gennemsigtig, hvilket gør det vanskeligt at definere kanterne. I dette tilfælde kan enten (1) celler farves med en intra vitale fluorescerende farvestof til at producere billeder, der kan være thresholded at vise sorte objekter på en hvid baggrund, eller (2) andre programmer til at skitsere cellerne som billede segmentering og/eller edge detection kan være anvendes. Manuel sporing er en nyttig mulighed når producere en høj kontrast billede af celle konturer ikke er muligt.

  1. Udføre manuel sporing ved hjælp af plugin.
    1. Oprette "Manuel sporing" stik i ImageJ og Åbn filmen i ImageJ. Under menuen "Manual Tracking", vælge "Tilføj nyt spor". Klik på midten af en celle som film forskud automatisk frame-by-frame. Når cellen er blevet valgt i hver ramme, Vælg "Tilføj nyt spor" til at starte efter en ny celle.
    2. Når sporene er blevet registreret, skal du kopiere outputresultater i en data-regneark. Ændre formatet for decimal display for alle regnearkets celler til nul steder efter decimaltegnet. Gem filen som en "stop-adskilt".txt-fil til efterfølgende analyse.
      Bemærk: Typisk er 50 – 100 celler sporet, som tager ca 1 time at fuldføre for en 20 min film omkring 240 frames.
  2. Udføre automatiske sporing ved hjælp af MTrack2 plugin. Hent og Installer MTrack2 kt plugin ifølge vejledningen i filen (Se supplerende kodning fil).
    1. Tærskel billeder fra celle migration film. Åbn billedstak i ImageJ. Processen billeder i ImageJ til at konvertere video fra farve til høj kontrast billeder viser cellerne som sorte objekter på en hvid baggrund (figur 3A).
      1. Sharpen billeder to gange, Pletfjerning billeder og konvertere billeder til 8 bit. Vælg den "billede | justere lysstyrke/kontrast"sub-menu og læg skyderen kontrast på maksimal kontrast, så cellerne vises som hvide objekter på en sort baggrund. Vælg den "billede | justere tærskel"sub-menu til at sikre, at cellerne vises som sorte objekter på en hvid baggrund.
    2. Køre cellen automatisk sporing plugin "MTrack2 kt" (Se Supplerende kodning fil). Angiv følgende parametre på skærmen indstillinger.
      1. Indstille partikelstørrelse minimum på 1 pixel og partikelstørrelse maksimum på 30 pixel for MZBs.
      2. For hastighed (maksimal afstand mellem 2 partikler på hinanden følgende frames i filmen), hvis cellen tæthed på diaset er høj, placere indeværende værdi lav at undgå at have sporet "hoppe" fra én celle til en anden. For MZBs, skal du angive denne værdi på 10 pixel til at fange outliers, selvom MZBs generelt ikke overstiger 2 pixels på hinanden følgende frames, der er 5 s apart.
      3. For det mindste antal rammer, som en partikel er til stede kan spores, angive denne værdi på antallet af frames i filmen for MZBs (f.eks., 240) for en 20 min film med 12 rammer/min. Men, hvis cellerne er hurtig nok til at forlade synsfelt inden udgangen af imaging, derefter indstille det minimum antal rammer på mindre end filmens varighed. For eksempel, med hurtige T celler, indstille minimumsantallet på svarende til 5-10 min af billedbehandling.
        Bemærk: Indspiller en makro på disse trin (tærskel og MTrack2-kt) til at automatisere denne del af proceduren, og spare tid (Se Supplerende kodning fil). Ved hjælp af makroen til automatisk for at spore en film i ImageJ tager mindre end et minut.
    3. Kopier output resultaterne i en data-regneark. Ændre formatet for decimal display for alle regnearkets celler til nul steder efter decimaltegnet. Tilføje en tom række øverst i de celle spor i regnearket og slette kolonnen "D". Gem filen som en "stop-adskilt".txt-fil til efterfølgende analyse i værktøjet Ibidi Chemotaxis.
      Bemærk: MTrack2 plugin udgange celle spor i rækker af 75 parallelle kolonner. Analyse i værktøjet Ibidi chemotaxis skal celle spor i en enkelt kolonne. For at konvertere outputtet, MTrack2 plugin blev ændret for at udgang enten i det oprindelige format eller som en enkelt kolonne (figur 3B) (Se Supplerende kodning fil "MTrack2 kt", som er skrevet i Java). Kopier filen .java ImageJ plugins mappe. ImageJ, Vælg "Plugins > kompilere og køre". Genstart ImageJ, og den modificerede udgave af MTrack2 skal vises i menuen Plugins.
  3. For at analysere celle spor med værktøjet Ibidi Chemotaxis, dataoverføre Ibidi Chemotaxis og Migration Tool v2.0 ("stand alone") og åbne programmet.
    1. Vælg "Importer data" og navigere til .txt celle spor filer. Flere filer kan vælges på samme tid. Importerede filer vises i ruden "Datasæt" i rød. Vælg dem alle og angive de korrekte værdier i menuen "Initialisering" nedenfor for at anvende følgende indstillinger.
    2. Angiv enten det nøjagtige antal eller en vifte af antallet af skiver (antallet af frames i filmen).
    3. I menuen Calibration (X / Y kalibrering), Angiv størrelsen på en pixel. Find oplysningerne i filen egenskaber af filmen. For MZBs, blev en 10 x mål brugt, giver en pixelstørrelse på 1,14 µm. I "kalibrering menu | Gang interval", angiver længden af tid mellem frames i filmen.
    4. Anvende indstillingerne. Vælg "Afbilde data" at se spor plots og bekræfte, at spor-filer åbnes. Fra dette punkt er mange muligheder tilgængelige, som er beskrevet i dokumentationen til programmet, herunder mærkning sporene med forskellige farver baseret på forskellige egenskaber og visning af de individuelle eller gennemsnitlige værdier for hastighed, videresende overførsel indeks, ligefremhed og mere (figur 3B).
      Bemærk: MZBs tager ca 10 min til at opdage og reagere på strømmen, formentlig af polariserende deres integrin komplekser til flow-forward punkt af cellen. En graf over migration indeks over tid vil vise en indledende drop under nul, svarer til de første par minutter, at cellen er udsat for at flyde, efterfulgt af en gradvis stigning opad indtil fremad migration indeksværdier er positive. Det kan således være optimalt at udelukke disse første minutter i de endelige beregninger, medmindre denne proces er af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi brugte den protokol, der er skitseret ovenfor for at sammenligne migration af MZBs på ICAM-1-belagt dias uden flow (0 dyn/cm2) og udsat for at vride flow (4 dyn/cm2). Celler blev sporet automatisk med MTrack2, og den resulterende spor filer blev overlejret på celle migration film af ingen flow (0 dyn/cm2) og (4 dyn/cm2) for at vise fordelingen og form af spor (figur 4A). Celle spor blev derefter importeres til værktøjet Ibidi Chemotaxis (IKT) til at generere spor parceller af hver film (figur 4B). Gennemsnitlige migration indeks (kaldet "FMIy" i IKT), hastighed, rethed (kaldet "direkthed" i IKT) og lineær afstand (kaldet "Euklidisk afstand" i IKT) celle numre fra 4 film hver for begge betingelser blev beregnet i den Chemotaxis værktøj ved hjælp af kommandoen "målte værdier". Disse gennemsnitsvaerdier blev derefter kopieres til GraphPad prisme til at skabe grafer og beregning af Statistisk signifikans (figur 4 c).

Figure 1
Figur 1: MZB shuttling. (A) Model af MZB shuttling mellem den marginale zone og follikel i milten. MZBs kræver internalisering af S1PR1, en receptor for S1P og funktionelle CXCR5, en receptor for CXCL13 chemokine, for at indtaste hårsækken. Derudover skal MZBs for at nå folliklen, overflytte mod kraften af blod flow fra porer i den marginale sinus, der indhyller hårsækken. Hvis en MZB mister vedhæftning til ICAM-1, ligand til LFA-1 integrin, er det skubbet ind i den røde papirmasse af kraften fra strømmen, hvor større mængder af VCAM-1, ligand for VLA-4, ikke ville støtte migration. (B) flowcytometri gating strategi for at teste renhed af sorteret MZBs ved hjælp af antistoffer mod B220, CD23 og CD21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Opsætning af det fluidics system, pumpe, mikroskop og inkubation kammer. (A) billede af pumpesystem (Ibidi18) bestående af en pumpe med tilsluttede fluidics enhed og bærbare computer kører software til at styre pumpen. Højere forstørrelse billede: flow kammer dias med 6 flow kamre, hvoraf først er knyttet til slanger af fluidics enhed. (B) typisk opsætning for måling in vitro-migration af MZBs mod strømmen. Et mikroskop udstyret med en varme kammer (sort boks) indeholdende fluidics enhed tilsluttet en pumpe (blå firkantede objekt til det nederste højre hjørne af mikroskop) uden for mikroskopet. Højere forstørrelse billede: fluidics enheden inde i mikroskopet varme kammer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kvantificering af imaging data. (A) repræsentative billeder af et billede fra en film ved at migrere MZBs før (venstre) og efter (højre) tærskel image konvertere cellerne til sorte objekter på en hvid baggrund. Skalere barer i både lav og høj forstørrelse billeder = 100 µm. (B) venstre panel: billede af typiske resultater output fra MTrack2 (enkelt kolonne output) plugin. Højre panel: billede af værktøjet Ibidi Chemotaxis og Migration 2.0 efter input af MTrack2 resultater viser et spor plot med overførsel af MZBs og en "målt værdier" display vindue, der viser et gennemsnit af parametre, herunder hastighed, migration indeks og ligefremhed ( grønne kasser), blandt andre. Kalibrering indstillinger vist omfatter 1,14 µm per pixel pixel opløsning og et tidsinterval på 5 s (0.083 min) pr. filmrammen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: eksempel på resultater ved hjælp af protokollen til at måle MZB shuttling. (A) repræsentant stills af overflytter MZBs med en overlejring af spor fra ImageJ plugin "MTrack2 kt". Bemærk: sporet farver blev vilkårligt fastsat ved "Manuel sporing" plugin for ImageJ. Skalere barer i både lav og høj forstørrelse mellemværker = 100 µm. (B) repræsentative spor parceller med overførsel af MZBs fra værktøjet Ibidi Chemotaxis og Migration 2.0. Røde linjer og sorte linjer repræsenterer celle spor, at opsige under eller over den vandrette akse, henholdsvis. I (A) og (B): venstre, MZBs overfører med ingen flow (0 dyn/cm2); højre, MZBs overflytning til en 4 dyn/cm2 flow. (C) Migration index (FMIy), hastighed, rethed (direkthed) og afstand til MZBs migrere uden flow (0 dyn/cm2) eller flow (4 dyn/cm2) (n = 4 mus i 4 separate eksperimenter). Fejllinjer = gennemsnit ± SD; Student's t -test, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1: MTrack2_kt.java. Venligst klik her for at downloade denne fil.  

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver her en metode til at analysere migration af celler, der registrerer kraften af shear flow og reagere ved at ændre deres migration. En analyse af MZBs viste, at MZBs vandrer spontant på ICAM-1 og flow, vil overflytte op for strømmen. I vores tidligere arbejde viste vi at MZBs Overfør ikke op for strømmen på VCAM-1 men i stedet have en fast på plads. Den murine milt marginale zone indeholder hovedsageligt ICAM-1, mens den røde papirmasse indeholder både ICAM-1 og VCAM-1. Fra disse data kunne det udledes, at MZBs ville overføre op for strømmen mens i den marginale zone, men ikke i den røde papirmasse. Analysen blev valideret i vivo ved hjælp af MZBs med defekt vedhæftning, der var mislocalized til milt rød papirmasse af kraften fra flow12. Af disse grunde udgør MZBs en god positiv kontrol til at teste flow overførselssystemet beskrevet her, selvom systemet bruges til at studere en anden celletype.

Det mest kritiske aspekt af proceduren er at sikre sammenhængen i celle håndtering på diaset. Fordi de kvantificerbare aspekter af celle migration afhænger graden som cellerne overholder dias, ville et fald i cellulære vedhæftning vanskeliggøre reproducerbare resultater. Nedsat cellulær vedhæftning kunne skyldes uoverensstemmelse i flere faktorer, herunder temperaturer på migration buffer eller boksen opvarmet inkubation (kolde reducerer friktion), niveauer af kationer i cellesuspension (kationer påvirker integrin bindende), Skub håndtering (trykke eller nedbøjning diaset kunne løsne celler), og celle tæthed (kollisioner mellem celler kan påvirke migration parametre). Andre følsomme punkter under proceduren omfatter ikke pipettering bufferen til dias brøndene med for meget kraft, vedhæfter slangen (som dette kunne reducere celle vedhæftning) og holde den nødvendige tid til protokollen trin konsekvent i hvert eksperiment ( celle bilægge tid kunne påvirke vedhæftning). I Resumé, skal enhver mulig indflydelse på celle vedhæftning holdes konsekvent i hele gentagelser at producere pålidelige celle migration data.

Denne metode er nem at sætte op, da det bruger kommercielt tilgængelige udstyr og forsyninger, og ingen af trinene kræver avancerede instruktion. Analyse af MZB samt andre celletyper såsom kulturperler CD8+ T celler, belægning slides med forskellige integrin ligander er tilstrækkelig til at observere migration op for strømmen. At studere flow-induceret migration svar på forskellige integrin ligander fører til direkte identifikation af aktive integriner på celleoverfladen, muligvis afsløre mekanismer, der er relevante for in vivo funktioner som med MZB migration op for strømmen på ICAM-1, men ikke VCAM-1. Det er dog også muligt at tilføje en endotel cellelag flow fordeling mellem afdelingerne. Et eksempel på immun celle migration, der er berørt af shear flow er T-celle ekstravasation gennem endotel lag3. Denne procedure blev brugt til at optrævle aktiveringen af T-celle vedhæftning via integriner, selectins og kemokiner og model lymfocyt migration gennem blod - hjerne barrieren. Den eneste begrænsning til de celler, der kan analyseres med denne metode er, at de skal kunne fornemme kraften af flow som en retningsbestemt signal.

Selv om metoden beskrevet her er anvendt til at karakterisere cellulære adfærd såsom hastighed og drejning, kan det også udvides til analyse af de molekylære aspekter af migration. Molekylære komplekser relevante til flow-induceret migration, herunder integriner LFA-1 og deres cytoskeletal adaptere, ville være beliggende inden for 200 nM af overfladen af det dias, imødekommenhed over for visualisering med JOHANNAS mikroskopi. Denne tilføjelse til metoden, der ville være ideelt til at studere celler fra mus med mutationer i integrin - eller cytoskeleton-relaterede proteiner. Som mange immun celler vandrer på forskellige stadier i deres udvikling gennem blod eller lymfe flow, kan in vitro-migration beskrevet bruges til systematisk afprøve mange former for kulturperler eller primære leukocytter for svar på flow og afsløre, hvordan cellerne er programmeret til at migrere i en in vivo immunrespons. Afslutningsvis giver analysen beskrives her en pålidelig og enkel metode til at analysere flow-induceret migration af MZBs, kan også udvides til andre celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra "Deutsche Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 til K. D.F.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
  3. Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
  4. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
  5. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  6. Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
  7. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
  8. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
  9. Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
  10. Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
  11. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
  12. Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
  13. ImageJ. MTrack2. , Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018).
  14. MTrack2. , Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018).
  15. ibidi. Chemotaxis and Migration Tool. , Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018).
  16. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , Chapter 1 (Unit 1.9) (2001).
  17. ImageJ. Manual Tracking. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018).
  18. ibidi. ibidi Pump System. , Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. (2018).

Tags

Immunologi og infektion sag 141 B-celler marginale zone migration shear flow integriner vedhæftning intercellulære vedhæftning molekyle-1 (ICAM-1) vaskulære celle vedhæftning molekyle-1 (VCAM-1)
Analyse af Shear Flow-induceret Migration af Murine Marginal Zone B-celler In Vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M.,… More

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. D. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter