Summary
Ex vivo kulturen av bein planter kan være et verdifullt verktøy for studiet av bein fysiologi og den potensielle evalueringen av legemidler i bein remodeling og bein sykdommer. Den presenterte protokollen beskriver forberedelsen og kulturen til calvarias isolert fra nyfødte mus hodeskaller, samt dens applikasjoner.
Abstract
Bone er et bindevev som består av osteoblaster, osteocytter og osteoklaster og en mineralisert ekstracellulær matrise, noe som gir den sin styrke og fleksibilitet og gjør det mulig å oppfylle sine funksjoner. Bein er kontinuerlig utsatt for en rekke stimuli, som under patologiske forhold kan deregulere beinremodellering. For å studere beinbiologi og sykdommer og evaluere potensielle terapeutiske midler, har det vært nødvendig å utvikle in vitro- og in vivo-modeller.
Dette manuskriptet beskriver disseksjonsprosessen og kulturforholdene til calvariaer isolert fra nyfødte mus for å studere beindannelse og mikromiljøet av beinsvulsten. I motsetning til in vitro- og in vivo-modeller, tillater denne ex vivo-modellen bevaring av det tredimensjonale miljøet i vevet, samt det cellulære mangfoldet av beinet mens det er under definerte forhold for å simulere ønsket mikromiljø. Derfor er det mulig å undersøke beinremodeling og dets mekanismer, samt interaksjoner med andre celletyper, for eksempel interaksjoner mellom kreftceller og bein.
Analysene som er rapportert her, bruker calvarias fra 5-7 dager gamle BALB/C-mus. De hemi-calvarias oppnådd er kultivert i nærvær av insulin, brystkreftceller (MDA-MB-231), eller betinget medium fra brystkreft celle kulturer. Etter analyse ble det fastslått at insulin induserte ny beindannelse, mens kreftceller og deres betingede medium induserte beinresorpsjon. Den kaloribaserte modellen har blitt brukt i grunnleggende og anvendt forskning for å studere beinutvikling og kreftinduserte beinsykdommer. Samlet sett er det et utmerket alternativ for en enkel, informativ og rimelig analyse.
Introduction
Bone er et dynamisk bindevev som har flere funksjoner, inkludert å støtte musklene, beskytte indre organer og benmarg, og lagre og frigjøre kalsium- og vekstfaktorer1,2. For å opprettholde sin integritet og riktig funksjon, er beinvev kontinuerlig under prosessen med ombygging. Generelt sett kan en syklus av beinremodeling deles inn i beinresorpsjon og bendannelse1. En ubalanse mellom disse to fasene av beinremodeling kan føre til utvikling av beinpatologier. Også sykdommer som brystkreft påvirker ofte beinintegritet; omtrent 70 % av pasientene i avanserte stadier har eller vil ha beinmetastaser. Når brystkreftceller kommer inn i bein, påvirker de beinmetabolismen, noe som resulterer i overdreven resorpsjon (osteoklastiske lesjoner) og / eller dannelse (osteoblastiske lesjoner)3.
For å forstå biologien til beinsykdommer og utvikle nye behandlinger, er det nødvendig å forstå mekanismene som er involvert i beinremodellering. I kreftforskning er det viktig å undersøke beinmetastaseprosessen og dens forhold til det metastatiske mikromiljøet. I 1889, Stephen Paget hypotetisk at metastaser oppstår når det er kompatibilitet mellom tumorceller og målet vev, og foreslo at metastatisk området avhenger av affiniteten av svulsten for mikromiljøet4. I 1997 introduserte Mundy og Guise begrepet "ond syklus av beinmetastaser" for å forklare hvordan tumorceller endrer beinmikromiljøet for å oppnå overlevelse og vekst, og hvordan beinmikromiljøet fremmer veksten ved å gi kalsium- og vekstfaktorer5,6,7.
For å karakterisere mekanismene som er involvert i beinremodellering og beinmetastase og for å evaluere molekyler med mulig terapeutisk potensial, har det vært nødvendig å utvikle in vitro og in vivo-modeller. Disse modellene presenterer imidlertid for tiden mange begrensninger, for eksempel forenklet representasjon av beinmikromiljøet, og deres kostnad8,9. Kulturen av bein ex planter ex vivo har fordelen av å opprettholde den tredimensjonale organisasjonen samt mangfoldet av beinceller. I tillegg kan eksperimentelle forhold kontrolleres. Explant-modellene inkluderer kulturen av metatarsal bein, lårben, calvarias, og mandibulær eller trabecular kjerner10. Fordelene med ex vivo-modellene har blitt demonstrert i ulike studier. I 2009 rapporterte Nordstrand og samarbeidspartnere etableringen av en kokulturmodell basert på samspillet mellom ben- og prostatakreftceller11. Også i 2012 rapporterte Curtin og samarbeidspartnere utviklingen av en tredimensjonal modell ved hjelp av ex vivo cocultures12. Formålet med slike ex vivo-modeller er å gjenskape tilstandene i beinmikromiljøet så nøyaktig som mulig for å kunne karakterisere mekanismene som er involvert i normal eller patologisk beinremodellering og evaluere effekten av nye terapeutiske midler.
Den nåværende protokollen er basert på prosedyrene publisert av Garrett13 og Mohammad et al.14. Neonatal mus calvaria kulturer har blitt brukt som en eksperimentell modell, som de beholder tredimensjonal arkitektur av beinet under utvikling og bein celler, inkludert celler i alle stadier av differensiering (dvs. osteoblaster, osteoklaster, osteocytter, stromal celler) som fører til modne osteoklaster og osteoblaster, samt mineralisert matrise14. Ex vivo-modellen representerer ikke den patologiske prosessen med beinsykdommer helt. Effekter på beinremodellering eller kreftindusert beinosteokse kan imidlertid måles nøyaktig.
Kort sagt består denne protokollen av følgende trinn: disseksjon av calvarias fra 5-7 dagers gamle mus, calvaria preculture, calvaria kultur applikasjoner (f.eks kultur i nærvær av insulin, kreftceller eller betinget medium, og til og med midler med terapeutisk potensial, i henhold til målet med undersøkelsen), bein fiksering og calvaria avkalkning, vevbehandling, histologisk analyse, og resultattolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus som brukes i disse analyser ble hentet fra BALB / c mus stammer, ved hjelp av mannlige og kvinnelige mus ukritisk. Tidligere kultureksperimenter har også blitt utført ved hjelp av andre stammer, for eksempel FVB, sveitsiske mus, CD-1 og CsA mus11,,12,14. Alle mus ble plassert i henhold til National Institutes of Health (NIH) retningslinjer, Vedlegg Q. Prosedyrer som involverer dyreforsøk har blitt godkjent av Institutional Animals Care and Use Committee (IACUC) ved Center for Scientific Research and Higher Education ved Ensenada (CICESE).
1. Kaloridisseksjon
- Steriliser disseksjonsinstrumenter (f.eks. 1 x 2 tenner vevtang, rett kirurgisk saks, dissekerende saks, fintippede pinsett, finbuet spiss dissekering tang, dissekering tang, skalpell). Sterilt destillert vann kan brukes til å rengjøre kirurgiske verktøy mellom hver disseksjon, og steril 1x PBS kan brukes til rengjøring av hver hemi-calvaria.
- Plasser de sterile disseksjonsinstrumentene, vann, 1x PBS, og nødvendige materialer for å utføre prosedyren (f.eks. mikropipetter, utfellingsglass, sterile Petri-retter) i en lamitarstrømningshette.
MERK: Utfør hele prosedyren under sterile forhold. - Tilsett 12 ml steril 1x PBS i to 10 cm Petri-retter.
- Velg valpene og plasser dem i nærheten av panseret.
MERK: Dissekere calvarias fra 5-7 dagers gamle valper. - Velg og hold musen forsiktig ved hjelp av dissekering tang.
- Decapitate musen ved hjelp av dissekering saks og legg hodet i en Petri skål med PBS.
MERK: Halshugging er ikke egnet for eldre mus. Hvis eksperimentet må gjøres med eldre mus, bør metoden for eutanasi endres i henhold til dyreforsøksreglene. - Hold hodet godt av neseområdet med 1 x 2 tenner vev tang og fjern huden over skallen til calvaria er synlig.
- Identifiser suturene (dvs. sagittal, koronar og lambdoid) av skallen på den eksponerte calvaria.
- Tren med spissen av mikrosaksen ca 2 mm bak lambdoid sutur og gjør et rett kutt langs den.
- Sett inn spissen av mikrosaksen på baksiden av skallen. Lag et rett kutt langs den distale siden av lambdoid suturen mot koronarsuturen. Fortsett på samme måte med den andre lambdoid sutur.
- Gjør et nytt kutt (i en 45° vinkel) for å koble enden av kuttet laget med kuttet av den anterior fontanel.
- Gjenta trinn 1,10 og 1,11 med den andre lambdoid sutur.
MERK: Det er viktig å identifisere suturene for å gjøre passende kutt og å kunne utføre tilstrekkelig innebygging og dataanalyse. - Bruk fine-tip tang for å fjerne calvaria og plassere den i en Petri skål. Med en skalpell, gjør et rett kutt fra bakre fontanel langs sagittal sutur gjennom koronar sutur og slutter i den fremre fontanel for å få to hemi-calvarias.
- Plukk opp hver av hemi-calvarias med de fintippede pinsettene og legg dem i en ny Petri-tallerken som inneholder PBS.
2. Calvaria kultur
- Tilsett 1 ml høyglukose DMEM medium supplert med 0,1% storfe serum albumin (BSA) og 1% antibiotika / antimykotisk (dvs. penicillin og streptomycin) i brønnene på en 24 brønnplate. Med fine-tip tang, plukke opp hver hemi-calvaria og plassere den i en brønn.
MERK: Legg hemi-calvarias konkave siden ned. - Inkuber hemi-calvarias i 24 timer ved 37 °C med 5 % CO2.
- Fjern kulturmediet fra hver brønn og legg til 1 ml friske medier som inneholder forbindelsen for å teste eller betingede medier fra andre celler.
MERK: Bruk minst tre hemi-calvarias for hver behandlingsgruppe og bruk negative og positive kontroller. - Inkuber hemi-calvarias i 7 dager, endre media hver 2-3 dager.
3. Kultur med kreftceller
- Velg en Petri skål med kreftceller på 80-90% samløpet og trypsinize dem. For å prøve, vask kreftcellene 1x ved hjelp av PBS (5 ml per 75 cm2 kolbe) etterfulgt av inkubasjon i en HBSS-løsning som inneholder 0,05% trypsin og 0,53 mM EDTA (2 ml per 75 cm2 kolbe).
- Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml konisk rør og sentrifuge ved 800 x g i 5 min ved romtemperatur (RT).
- Fjern og kast supernatanten.
- Resuspender pelleten i 2 ml DMEM som inneholder 2% føtal storfe serum (FBS) og 1% antibiotika / antimykotisk. Tell levende celler.
- Tilordne hemi-calvarias til hver studiegruppe (dvs. den negative kontroll- og kokulturgruppen for RNA eller histologianalyse).
- Fjern kulturmediene fra hemi-calvarias og legg til 1 ml DMEM som inneholder 2% FBS og 1% antibiotika / antimykotisk supplert eller ikke supplert med kreftceller.
MERK: Mengden celler som skal legges til, kan endres avhengig av cellelinjen som er testet. Med kreftceller som MDA-MB-231 eller PC-3 fungerer 500 000 celler per brønn på riktig måte. - Inkuber i 24 timer ved 37 °C med 5 % CO2. Send hver hemi-calvaria til en ny brønn for å beholde bare kreftceller som holdt seg til beinvevet.
- Inkuber i 7 dager ved 37 °C med 5 % CO2 og bytt media hver 2-3 dag.
4. Fiksering
- Kutt firkanter av vevpapir for å vikle hemi-calvarias.
MERK: Biopsiskumputer eller stålkapsler for små biopsier kan også brukes. - Bruk rette fine-tip pinsett for å plukke opp hver hemi-calvaria fra sagittal sutur, legg på et vev papir, og pakk.
- Plasser den innpakkede hemi-calvaria inne i en merket innebyggingskassett.
- Plasser kassetten i en beholder med 10 % fosfatbufret formalin.
- Fest i 24 timer ved 4 °C.
5. Avkalking
- Fjern formalin, tilsett 1x PBS, og agiter vevet i 30 minutter for å skylle hemi-calvarias.
- Fjern PBS og tilsett 10 % EDTA (pH = 8, 0,34 M).
MERK: Kontroller at løsningen dekker vevet helt. - Avkalk vevet i 48 timer ved 4 °C.
- Kast EDTA-oppløsningen og tilsett 1x PBS for å skylle vevet.
- Oppbevar hemi-calvarias i 70% etanol til histologibehandling.
6. Vevbehandling
- Dehydrer vevet med runder på 96% etanol, 60 min (3x), etterfulgt av 100% etanol, 60 min (3x).
- Skift ut etanolmed 100% xylen, 60 min (3x).
- Inkuber kasettene i parafinvoks, 60 min (2x).
7. Innebygging
- Åpne kassettene, fjern forsiktig vevspapiret og pakk ut calvaria.
- Plukk opp hver calvaria nøye og stable alle hemi-calvarias fra samme gruppe i samme retning.
- Sett litt parafin i en mugg.
- Plukk opp alle hemi-calvarias med tang og plasser dem inne i formen med sagittal sutur ned mot bunnen av formen.
MERK: Orientering av hemi-calvarias i formen under inkludering er avgjørende for å oppnå konsekvente histologiske seksjoner og reproduserbare resultater fordi denne orienteringen vil tillate bakre identifisering av front- og parietalbein fra calvarias og koronarsuen som tilrettelegger for den kvantitative vurderingen. - Slipp pinsettene og kontroller at hemi-calvarias forblir på plass.
- Plasser den merkede kassetten på toppen av formen og fyll den med mer parafin for å dekke hemi-calvarias.
- Flytt formene til den kalde overflaten.
8. Snitting
- Trim 500-600 μm av sagittal sutur med mikrotomet.
- Klipp 4 μm tykke seksjoner, og samle de delene som trengs.
- Trim ytterligere 300 μm.
- Klipp og samle ytterligere seks 4 μm tykke seksjoner.
- Trim blokken 300 μm videre og samle flere seksjoner.
- Monter seksjonene på glassmikroskoplysbilder.
- Tørk lysbildene på RT.
9. Befaring
- Senk seksjonene i 100% xylen i 3 min.
- Senk i 100% etanol i 1 min.
- Slå sammen i 96% etanol i 1 min.
- Dypp i 80% etanol i 1 min.
- Senk i 70% etanol i 1 min.
- Skyll i vann i 3 min.
- Nedsenket i hematoksylin i 3 min.
- Skyll i vann til seksjonen er klar.
- Senk i en mettet litiumkarbonatløsning i 10 sek.
- Skyll i vann i 3 min.
- Senk i 96% etanol i 1 min.
- Nedsenket i eosin i 3 min.
- Dypp i 96% etanol i 1 min.
- Senk i 100% etanol i 1 min.
- Senk i 100% xylen i 3 min.
- Tilsett litt per monteringsmedium på lysbildet og beskytt det med en dekselslip.
MERK: Du kan utfylle hematoksysin og eosin (H&E) farging med tartatresistent syrefosfatase (TRAP) farging for å evaluere osteoklast og osteovis.
10. Kvantitativ vurdering: definere areal for analyse
- Undersøk seksjonene under lavt strømnivå (dvs. 4x) for å identifisere retningen og suturene.
- Definer koronarsutur og identifisere den lange beinoverflaten på den ene siden og den korte overflaten på den andre.
- Identifiser koronarsuturen under 40x forstørrelse, og flytt to eller tre optiske felt bort fra suturen langs den lange overflaten. Ta bilder av dette området for analyse.
- Definer det gamle beinområdet og det nye beinområdet. Eosin Y med oransje G flekker det gamle beinet mørkere og den nye beinlighteren.
- Mål det totale beinarealet av det gamle og nye benet med Bilde J-programvaren ved hjelp av fargeterskelverktøyet. Uttrykk resultatene som μm2.
11. Dataanalyse
- Analyser resultatene ved hjelp av statistisk programvare. Betydelige forskjeller mellom grupper kan bestemmes ved hjelp av passende tester (f.eks. ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test som er gjort herel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å evaluere beindannelse i kalorimodellen dyrket vi hemi-calvarias i media med eller uten 50 μg/ml insulin. Vevsseksjoner ble tilberedt og farget med H&E. Under disse forholdene viste histologien at den strukturelle integriteten til calvarialbenet ble opprettholdt, slik at identifiseringen av de ulike komponentene (figur 1). Calvarias behandlet med insulin ga en økning i mengden beinvev sammenlignet med kontrollen (figur 2A). Kvantitativ histomorfoometrisk analyse for tykkelsen og beinområdet av hemi-calvaria bekreftet en betydelig økning for begge parametrene i insulinbehandlede vev sammenlignet med kontrollen (Figur 2B). Disse dataene indikerer muligheten for ex vivo-modellprotokollen for å reprodusere benformasjonsforhold.
I tillegg kan calvarial ex vivo-modellen brukes til å reprodusere kreft- og benmikromiljøforhold. Protokollen ble brukt til å evaluere effekten av brystkreftcellene MDA-MB-231 på murine calvarias. For å utføre dette ble calvarial bein direkte kokulturert med kreftcellene eller dyrket bare med de betingede mediene til kreftcellene. Etter 7 dager med kultur ble calvariaene innebygd i parafin, og H&E-farging ble utført. Kokulturen med MDA-MB-231 brystkreftceller syntes å øke osteolysen, som vist ved reduksjon i bein og skader på kaloristrukturen sammenlignet med kontrollen calvarias dyrket bare med media (Figur 2A). Kvantifisering av beinareal av calvarias viste en signifikant reduksjon i det totale beinområdet i calvarias dyrket med MDA-MB-231 kreftceller sammenlignet med kontrollen (Figur 2B). Disse resultatene viste at kokulturer av kreftceller med kalorivev kan gjenskape kreft og bein mikromiljø og kan brukes til å undersøke mekanismene for osteolytisk bein metastase eller for å evaluere mulige hemmere av denne prosessen.
Figur 1: Histologisk struktur av calvarial benet. Representativ tvetdel av hemi-calvaria etter H&E farging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Insulin økte beinområdet og tykkelsen på hemi-calvarias ex vivo mens kokultur av hemi-calvarias med MDA-MB-231 brystkreftceller indusert osteolyse. For beinformasjonsmodellen ble hemi-calvariaene dyrket i nærvær eller fravær av insulin (50 μg/ml), mens for kokulturen med kreftceller ble hemi-calvariaer dyrket i nærvær eller fravær av 5 x 105 MDA-MB-231 celler i 7 dager og histomorfometrisk analyse ble utført på H&E fargede seksjoner. (A) Representative vev seksjoner. (B) Histomorfometrisk analyse av beinområdet. Resultatene er representert som gjennomsnittet ± SEM (n = 3). *P < 0,05, ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi protokollen for en calvarial ex vivo-modell for å evaluere beindannelse eller resorpsjon og for å studere interaksjoner mellom kreftceller med calvarial musebein. De kritiske trinnene i denne teknikken er disseksjon, kultur, innebygging og histomorfometrisk analyse av calvarias. Under disseksjon av calvarias er det avgjørende å kutte hemi-calvarias i en trapes, da det sterkt vil lette orienteringen under parafininkluderingen. Når du studerer kreftcelleinteraksjoner med calvarias, er det viktig å bruke multiwell plater som ikke behandles for cellekultur for å hindre kreftceller fra å følge og vokse på plast i stedet for beinet. Under vevinkluderingen er det viktig å nøye orientere hver hemi-calvaria. De må plasseres vertikalt med sagittalgrensen på yttersiden av parafinblokken. Orienteringen av beinet er avgjørende for å oppnå konsekvente histologiske seksjoner og reproduserbare resultater. På samme måte er det avgjørende for konsistens under histomorfometrisk analyse for å definere en bestemt region i calvaria for å måle beinremodellering. Her identifiserte vi først koronarsuturen og deretter den lange beinoverflaten der bildene ble tatt og målingene gjort.
For å oppnå standardisering og utvikle protokollene som er beskrevet, endret vi noen etablerte metoder litt. Under disseksjon av hemi-calvarias ble PBS brukt til å skylle musehodene i stedet for kulturmedier. For å bestemme antall celler som er nødvendige for å produsere en effekt på calvarias, ble vevet inkubert med forskjellige antall brystkreftceller. Generelt fungerer 5 x 105 kreftceller godt for en 7 dagers analyse. Også under fiksering ble vevpapir brukt i stedet for svamper for å beskytte calvarias. Vevet var godt bevart i papiret.
Den beskrevne modellen har noen begrensninger. Calvarias fra neonatal mus mangler noen av komponentene i bein som er mottaker av metastaser, enten strukturelle (dvs. trabekulære bein) eller cellulære komponenter som immunceller eller andre celler i benmargen, inkludert hematopoietiske stamceller som kreftceller samhandler med. Kulturen i calvarias in vitro kan ikke simulere fullstendig fysiopatologi. Også, når det gjelder bein metastaser, brystkreftceller sjelden metastaserer til calvaria, og har en tendens til å favorisere bein med mer aktiv bein remodeling, som ryggvirvlene, hoften, eller de lange bein ene og bena. Dessuten representerer kokulturen av hemi-calvarias med kreftceller bare de siste trinnene i metastatisk kaskade: koloniseringen av beinet og veksten av metastase. Videre er antall prøver begrenset av antall valper per kull. Det anbefales å bruke ett kull per eksperiment og ikke blande kull for å unngå variasjoner i resultatene. Vi oppnådde lignende resultater i beinremodeling ved bruk av calvarias fra BALB /c eller FVB-mus, men om belastningen påvirker tidsresponsen til beinremodeling i denne analysen gjenstår å bli bestemt.
De viktigste fordelene med calvarial ex vivo-modellen sammenlignet med in vivo-modeller inkluderer lavere kostnader, enkelhet i analysen, og kortere eksperimentell tid for å få en beinremodeling respons. Kokulturen av kreftceller og calvarias gjør det mulig å studere cellekontaktavhengige interaksjoner samt effekten av utskillede faktorer på beinremodellering, mens bruk av betingede medier gjør det mulig å fokusere på effekten av løselige faktorer. I tillegg kan den direkte kontaktmodellen lette karakteriseringen av intercellulære interaksjoner og molekylære mekanismer i beinmetastasemikromiljøet, samt studier og evaluering av nye legemidler for behandling av skjelettkomplikasjoner av maligniteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Mario Nomura, MD og Rodolfo Díaz for deres hjelp med histologien, og Pierrick Fournier, Ph.D. for hans verdifulle kommentarer for å forbedre kvaliteten på papiret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, Jones & Bartlett Learning. (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. Heymann, D. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R.
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana press. Totowa, New Jersey. 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
