En simpel Migration/Invasion arbejdsgang ved hjælp af en automatiseret Live-celle Imager

Summary

Den nuværende protokol beskriver en integreret metode undersøger kræft celle migration og invasion på en enkelt platform i realtid, som giver en let gengivelig og tid-effektiv mulighed for at studere cellen mobilitet og morfologi.

Abstract

Kræft celle mobilitet er afgørende for indledningen af metastaser. Undersøgelse af celle bevægelse og invasive kapacitet er derfor af stor betydning. Migration assays give grundlæggende indsigt i celle bevægelse på en 2D plan, mens invasion assays er mere fysiologisk relevante, efterligne in vivo kræft celle dislodgment fra det oprindelige websted og invaderer gennem den ekstracellulære matrix. Den nuværende protokol giver en enkelt arbejdsgang for migration og invasion assays. Sammen med den integrerede automatiseret mikroskopiske kamera for real-time HD billeder og indbygget analyse modul giver det forskerne en tid-effektiv, simpel og reproducerbar eksperimentelle indstilling. Denne protokol omfatter også erstatninger for forbrugsstoffer og alternative analysemetoder for brugere at vælge imellem.

Introduction

Celle migration og invasion er vigtige biologiske processer, der aktiverer normale funktioner i det menneskelige legeme, såsom sår lukning, invasion af moderkagen i livmoderen og mælkekirtlen morfogenese^1,2,3. Den menneskelige krop har præcise og nøje kontrol af disse biologiske hændelser; der er dog nogle undtagelser. Maligne tumorer, for eksempel, er stand til at undslippe denne sikkerhedsforanstaltning, udstille unormale spredning og invadere i omkringliggende væv, som kaldes metastaser. Metastaser er den største årsag til cancer-relaterede dødelighed⁴.

Brystkræft er mest almindeligt diagnosticeret kræft hos kvinder, og er den næsthøjeste årsag til cancer-relaterede dødsfald blandt kvinder i udviklede lande verden over⁵. Brystkræft stammer fra kanalerne eller lobules, der består af et eller flere lag af epitelceller. I den normale bryst overholde epitelceller hinanden og basalmembranen gennem Membranproteiner som E-cadherin og integriner⁶. Men invasiv brystkræftceller har mistet deres polaritet og cell-celle vedhæftning, og klassisk gennemgå epitelial mesenchymale overgang (EMT) og få mulighed for at flytte. Efter ekstravasation, disse celler flytte på tværs af den ekstracellulære matrix (ECM) og indtaste blodkar eller lymfesystemet, derefter efterfulgt af intravasation og metastatisk vækst⁷. Forstå de mekanismer, hvormed dette sker er af stor betydning, fordi metastase er den mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødelighed og er nært beslægtet med kræft celle migration/invasion. For at visualisere bevægelse af kræftceller, er migration og invasion assays ideelle modeller at studere 2D og 3D celle bevægelse, henholdsvis. Migration vurderer direkte bevægelse af cellerne invasion indebærer interaktion med mikromiljø og evnen til at forringe biologiske barrierer. De to processer er ikke fuldstændig uafhængigt af hinanden, som migration er et krav for en invasion.

Flere metoder er blevet udviklet for at studere migration og invasion. Som gennemgået af Kramer et al., migration assays såsom sårheling, genererer hegn og mikro-carrier assays en celle-fri område at tillade celler til at flytte ind, vurdering af ændringen af område; transwell og kapillær assays er baseret på antallet af celler, der bevæger sig mod en attractant⁸. For invasion assays, en ECM miljø skal sættes op med ECM gel eller kollagen for eksempel, og 3D bevægelse kan vurderes ved at overvåge invasion område, afstand og celle tæller (f.eks. transwell assay, platypus assay)⁸. En anden type af invasion assay er at kombinere de invasive celler med non-invasiv celler og vurdere adfærd af de invasive celler (f.eks. klumpformet undersøgelser). Ovenstående metoder har deres fordele og ulemper, og en måde, der er let at tilgang, let at gentage og kombinere migration analysen og invasion assay i en lignende arbejdsproces er privilegerede i eksperimentelle design.

Denne protokol beskriver måling af celle migration og invasion ved hjælp af en live-celle imager. Det er en real-time celle overvågnings system installeret i en standard celle kultur inkubator. Det tager high definition billeder ifølge sæt scanning intervaller og målinger ved at anvende passende masker på celler eller fluorescerende mål. Modul af migration/invasion assay omfatter også brug af en 96-pin skrabeværktøj, som er egnet til at gøre homogene scratch sår på en celle éncellelag i en 96-brønd plade. Mekanismen er baseret på in vitro-sår healing assays, overvågning 2D celle bevægelse på en plastik eller coated overflade. Invasion eller 3D bevægelse på tværs af en yderligere ECM i bunden sår kan også blive vurderet. En kort workflow er illustreret i figur 1.

Protocol

Bemærk: To cellelinjer bør håndteres separat. Følgende procedurer bør være anvendes for en enkelt celle hvis det ikke er angivet.

1. Optimer celle tæthed inden såret

1. Kultur vedhængende celler i T75 cm² vævskultur flasker til ca. 80% sammenløbet i phenol-rød gratis Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 200 mM L-glutamin og 2 µg/mL insulin ved 37 ° C med 5% CO₂ ( standard inkubation betingelser for de fleste kræft cellelinjer, kultur formuleringer er cell line-afhængige).
2. Fjern kultur medier af pipettering til en spildbakken. Afpipetteres 2 mL af pre varmede 0,1% trypsin-EDTA til kortvarigt skyl celle éncellelag og pipette af. Tilføje en anden 2 mL af 0,1% trypsin-EDTA og kolben betingelser, standard inkubation ved 37 ° C i 5 min.
3. Tryk forsigtigt på kolben for at sikre udstationering af celler og derefter tilsættes 10 mL af pre varmede dyrkningsmedier til proteolytiske reaktionen standses.
4. Overføre cellesuspension i en 15 mL centrifugeglas og spin-ned på 200 x g i 5 min. ved stuetemperatur (RT). Forsigtigt fjerne supernatanten uden agiterer celle pellet og resuspend med en anden 10 mL pre varmede kultur medier.

2. optælling celle nummer ved hjælp af en automatiseret celle Counter (eller tælle metoder)

1. Fortyndet 200 µL af resuspenderede cellesuspension med 800 µL 1 x Dulbeccos phosphat bufferet saltvand (DPBS) i et 1,5 mL centrifugeglas.
2. Vedhæfte en 60 µm celle count sensor til tælleren celle, hold nede Skift og flette aflæsse i cellesuspension. Langsomt frigive Skift indtil cellesuspension er med held trukket ind i sensoren. Celle koncentration vises i celler/mL.
3. Beregne celle tal i 10 mL cellesuspension.

3. celle Plating

1. Plade celler på en række celle tætheder (40.000-90.000 celler/brønd) i tre eksemplarer i en 96-brønd plade.
2. Pladen anbringes i live-celle imager og planlægge scanning hver 2 h 24 h.
   1. I softwaren, skal du klikke på tidsplan scanner fra opgavelisten. I opsætningsruden skuffe fastlægge placeringen af pladen, klik på Tilføj fartøj og vælge den plade type. I ruden Skan opsætning vælge eller redigere scan mønster ifølge opsætningen af eksperimenterende plade og indstille Skan Type som Standard.
   2. Højreklik på tidslinjen , og vælg Sæt intervaller. Indstille Tilføje scanninger hver til 2 h på en 24-timer tidsplan. Klik på Anvend.

4. Bestem den optimale celle såning tæthed for Migration Assay

1. Stop scanning efter 24 h, gælder sammenløbet forarbejdning analyseværktøj til HD-fase kontrast billeder automatisk indsamlet, og generere en celle spredning kurve mod tiden.
   1. Bestemme 3-6 repræsentative billeder og placere dem i en ny Billedsamling.
   2. Bestemme en ordentlig maske som Forarbejdning Definition.
   3. Lancere en analyse job.
   4. Bestemme optimeret celle tæthed efter sammenløbet mod tid (ca 100% sammenløbet inden for 6 – 18 h afhængigt af Hvornår migration analysen påbegyndes).
      Bemærk: Mængden af tid, det tager for at vokse cellerne til sammenløbet varierer afhængigt af den seeding fortynding.

5. dag 1 og 2: forberedelse til Migration og Invasion Assays

1. På dag 1, pels plade til invasion assay.
   Bemærk: ECM gel bør altid håndteres på is og med tips, der har været lagt i køleskabet natten over.
   1. Fortynd ECM gel med iskold dyrkningsmedier til 100 µg/mL og tilsæt 50 µL fortyndede ECM gel/medier i udpegede brønd.
   2. Sted plade på standard inkubation vilkår overnatning.
2. På dag 2, forsigtigt Opsug den overskydende medier. Plade celler med optimeret celle tætheder i 2 96-brønd plader udpeget til migration assay (ubestrøget) og invasion assay (coated) i tre efter afsnit 1-3 i den sene eftermiddag (i den nuværende protokol, optimeret seeding tætheder for ZR75-1 og MDA-MB-231 var 90.000/brønd og 50.000/godt, henholdsvis).
3. Placer plader på standard inkubation betingelser natten over.

6. dag 3: Sår bunden

1. Spray og tør den skrabeværktøj og 2 vaske både med 70% ethanol før du placerer dem i biosikkerhed kabinet. Fyld vask båd 1 og 2 med præcis 45 mL sterilt (autoklaveres) destilleret vand og 70% ethanol henholdsvis.
2. Sterilisation, at placere skrabeværktøj pin blok (øverst) på vask båd 1 og 2 i 5 min.
3. Start med migration assay plade.
   1. Flytte pladen som indeholder celler fra rugemaskinen, og sørg for ingen godt, er tørre for at undgå beskadigelse af værktøjet scratch. Fjern dækslet til plade og indsætte i bundplade indehaveren af værktøjet scratch, og Anbring forsigtigt den øverste del på den base del ved at vejlede dyvler. Hold den sorte håndtag, og i mellemtiden løft forsigtigt pin-blok. Huller i hver brønd er normalt synlige med det blotte øje og under mikroskop.
   2. Hurtigt sættetid benene i vand; Dette er tilstrækkeligt til at rense skrabeværktøj før skrabe invasion assay plade hvis plade setup er identiske. Ellers Gentag trinene sterilisering med sterilt, destilleret vand og derefter 70% ethanol i 5 min.
4. Vask plade 1 eller 2 gange med pre varmede kultur medier at undgå fritliggende celler eller celle ark genmonteres til brønden.
5. Tilsæt 100 µL af frisk varm medier i udpegede brønd med eller uden behandlinger.
6. Yderligere skridt til invasion assay.
   1. Invasion assay pladen anbringes ved 4 ° C i 5 min til Reagensglasset og omhyggeligt Opsug den kolde medier.
   2. Fortyndes ECM gel med iskold dyrkningsmedier til 5 mg/mL, tilsættes 50 µL fortyndede ECM gel i udpegede brønde og placere under standard inkubation i 30 min.
   3. Tilsæt 100 µL af varmet op medier med eller uden prøvning forbindelser.
7. Pladen anbringes i live-celle imager og lad det Blandingen henstår i 5 min. Vælg Skibstype som imagelock plade. Indstille Skan Type som Scratch sår, vælge eller redigere Skan mønster ud fra eksperimentelle plade konfigurationen (1 billede/brønd og bred tilstand) og planlægge 24-h Gentag scanning hver 1-2 h til 72 h indtil sårene er helet.
8. For at rense den skrabeværktøj, sætte top pin-blok i hver af de følgende løsninger (45 mL i vask bådene) for 5 min: 0,5% vaskemiddel 1 (Se Tabel af materialer), 1% vaskemiddel 2 (Se Tabel af materialer), sterilt destilleret vand og 70% ethanol. Placer skrabeværktøj tilbage på sin base plade og butik i et støvfrit miljø.

7. dataanalyse

1. Stop scanning den udpegede plade, når alle sår er helet ved at vælge den eksperimentelle plade på Skuffe Setup og klikke på Fjern fartøj.
2. Indsamle 3-6 repræsentative billeder der omfatter en række sunde procenter, herunder billeder ret efter at såret er sket, sår lukning 10% og 50%.
3. For at bestemme en ordentlig behandling definition, bruge Segmentering justering, Oprydning og filtre til at anvende passende Ridse sår maske og Sammenløbet maske. Brug Preview nuværende/alle for at se nøjagtigheden af maskerne.
4. Lancere analyse job.
5. Data kan analyseres i softwaren eller eksporteret til yderligere analyse. Tre målinger af softwaren kan bruges til at evaluere de HD-fase billeder: sår bredde (µm), sår sammenløbet (%) og relative sår tæthed (%). Sammenligninger vil blive drøftet i de følgende afsnit.

Representative Results

Denne migration/invasion assay er baseret på sår healing assay, der evaluerer satsen af celler bevæger sig ind i en celle-fri område lavet af 96-pin skrabeværktøj. Forskellen mellem migration og invasion-assays er, at migration undersøgelser vedrørende foranstaltning celler bevæger sig på vævskultur behandlet plast overflade og invasion foranstaltninger celler bevæger sig på tværs af ECM gel.

Scratch-værktøj er designet til at gøre konsekvent scratch sår i de udpegede plade og live-celle imager er designet til at tage real-time højopløselige billeder med scratch sår i midten. De to bryst kræftcelle linjer, som bruges i den nuværende protokol er ZR75-1 og MDA-MB-231, kategoriseret som luminale B og triple negative undertyper henholdsvis⁹. Scratch sårene genereret af 96-pin skrabeværktøj er almindeligvis mellem 700-900 µm, men kan variere mellem forskellige cellelinjer (figur 2).

For migration assay, tre målinger leveres: (1) sår bredde (µm) er den gennemsnitlige afstand mellem celle ark ved siden af sår (figur 3). (2) sår sammenløbet (%) er sammenløbet inden for området såret (figur 3). Det ideelle første sår sammenløbet bør være tæt på 0%. (3) relative sår tæthed (%) er en algoritme, baggrunden-trækkes [% relativ sår densitet = 100 * (w(t) - w(0)) / (c(t) - w(0)), t = til tidspunktet t, w = massefylde af sår region c = massefylde af celle regionen], måling tæthed af regionen sår i forhold til tætheden af celle regionen.

Tre støtteberettigede målinger kan opnås baseret på behov. Den relative sår tæthed og sår sammenløbet indebærer hastighed af celler besætter området scratch sår, og de overlapper hinanden næsten i begge cellelinjer. Men de to cellelinjer viste meget forskellige sår healing evner, hvor på færdiggørelsen (ca. 50 h) af såret helingsproces af MDA-MB-231 celler, ZR75-1 celler havde omkring 50% sår dækning (de to målinger ovenfor) og over 400 µm resterende sår bredde, angiver en lavere migration evne til ZR75-1 celler (figur 4).

Overflytter adfærd af to celletyper blev forskellige og kan sammenlignes baseret på de optagne billeder. Lamellipodia (blebbing fremspring) blev observeret i MDA-MB-231 celler migration foran begyndelsen af migration, som var et typisk tegn på cytoskeleton omlejring, lede celle bevægelse mod celle-fri region¹⁰ (figur 5 ). ZR75-1 celler viste ingen tegn på celle migration for den samme tidspunkt (figur 5).

Den metriske Relative sår tæthed er anbefalet af fabrikanten for celle invasion, som det er en 3D assay, og sammenløbet-baseret analyse er ikke gældende. Inden for 50 h var relative sår tætheden af MDA-MB-231 celler mættet (100%), mens relative sår tætheden af ZR75-1 celler ikke ændre over tid, med angivelse af den stærkt invasive Fænotypen af MDA-MB-231 celler og ZR75-1 celler (ikke invasiv Figur 6).

MDA-MB-231 celler også opførte sig anderledes mens invaderer gennem ECM gel (figur 7). I forhold til celler med bleb forrest migration, viste invaderer celler et aflangt morfologi med førende fremspring.

Figur 1 : Workflow af migration og invasion assay i den nuværende protokol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Performance af skrabeværktøj på bryst kræftcelle linier ZR75-1 og MDA-MB-231 (øverste panel) med målte oprindelige sår bredde og indledende sår sammenløbet (nederste panel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Migration analysen illustreret af HD fase kontrast billeder og blandet tilstand med masker i MDA-MB-231. Blå, bunden sår; gul, celler omkring bunden sår; pink, celler, der flyttede ind i bunden sår på 24 h efter bunden. Skalere barer = 300 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Sammenligning af tre algoritmer (sår bredde, relative sår tæthed og sår sammenløbet af bryst kræft cellelinjer ZR75-1 (venstre) og MDA-MB-231 (til højre). Alle eksperimenter repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter, ± S.D. skala barer = 300 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5 : Migration forsiden af ZR75-1 og MDA-MB-231 celler 4 h efter bunden. Pile, lamellipodia migration foran. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6 : Kvantificering af invasion benytter metriske Relative sår tæthed (%) af breast cancer cellelinie ZR75-1 (venstre) og MDA-MB-231 (til højre). Alle eksperimenter repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter, ± S.D. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7 : Forskellige cellulære Karakteristik af MDA-MB-231 celler i migration (venstre) og invasion (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8 : Et eksempel på en skramme sår, der ikke kan analyseres af modulet integreret migration fra en 96-brønd plade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Migration og invasion er vigtige parametre til at vurdere mobilitet af kræftceller. Ved hjælp af værktøjet 96-pin scratch, er det muligt at gennemføre sårheling assays i 2D og 3D samtidigt. Ud over at lette den automatiske scanning giver en stabil celle kultur miljø med minimal forstyrrelse, scratch analysen foretaget ved hjælp af værktøjet 96-pin scratch giver konsekvent scratch sår, gør det muligt for eksperimenter, der er mere robuste og reproducerbare. 96-brønd plade format giver ekstra muligheder for enten øge antallet af cellelinjer eller forskellige medicinske behandlingsmetoder. Derudover kan morfologi celleforandringer og dynamisk bevægelse registreres for yderligere analyse.

Overflytning/invasion assay er designet til at være let anvendelig med et par forudsætninger. En sammenflydende celle éncellelag er kritisk inden såret for at sikre en styret celle bevægelse mod hullet. Det er derfor stærkt anbefales at optimere celle såning tæthed, og en tidsramme mellem 6-18 h er typisk ideel. Mulighed for de eksperimentelle celler knyttet til overfladen og spredning sats vil påvirke denne tidsramme. Længere tids inkubation tid kan føre til stærk celle-celle vedhæftning og generere skæve bilaterale celle fronter på grund af fjernelse af celle ark. En biomatrix belægning vil være behjælpelig med mindre klæbende cellelinjer, at mindske ventetiden. Celler kan være sultet før blevet såret. Sult timing er lig ridse timing, som er når sammenløbet når næsten 100%, og sult medier og varighed er celletype afhængige. Celler kan også være transfekteret, men såning tæthed har skal fastlægges for en længere tid før sårede, i betragtning af inkubationstiden Transfektion proces. Såret kan nås inden for få sekunder ved hjælp af værktøjet 96-pin scratch. Defineret mellemstore pins garanterer en præcis migration/invasion startlinjen og afstand. Vigtigere, skal de øverste og nederste dele være godt tilpasset til at fuldføre en fuld skramme på tværs af brønde, så live-celle billeder ikke omfatter enten terminal af de scratch sår. Scratch sårene kan observeres let gennem nøgne øjne på sammenflydende celle éncellelag og hurtigt kan kontrolleres under en lysfelt mikroskop. Vask af brøndene skal udføres straks og forsigtigt undgå limning af fortrængt celler og fjernelse af bilaterale celler. Hvis en vask er tilstrækkelig til at rydde op i den ønskede celle-fri zone, er der ikke behov for en ekstra vask.

Migration assays kan afsluttes ved at tilføje kultur medier med eller uden behandlinger og er klar til at scanne, et par ekstra skridt er nødvendige for at blive taget hensyn til en invasion assay. I modsætning til celle migration trænge invaderende celler gennem ECM, som mere nøje afspejler i vivo celle bevægelse bedre. Vigtigste i den nuværende protokol er at generere en ECM-omgivet miljø ved hjælp af ECM gel. Cellerne udsås på ECM gel-coatede brønde og efter sårede, ECM gel er lagdelt på cellerne og scratch såret. Når du håndterer ECM gel, er det bedre at holde alt koldt at undgå gellation. Ujævnt fordelt ECM gel kan forårsage problemer, når der fokuseres mikroskop. På grund af den tyktflydende karakter af ECM gel, det er muligt at generere bobler, men boblerne kan fjernes nemt ved sugning 70% ethanol gennem en sprayflaske. For at generere fint men ikke overdreven spray, simpelthen skrue hætten af sprayflaske og spray off overskydende 70% ethanol i halmen peger andetsteds. Ved sprøjtning på afstand over og vandret på pladen, er fine 70% ethanol spray tilstrækkelige til at fjerne boblerne.

Den første scanning bør påbegyndes så hurtigt som muligt efter såret, for at fange den oprindelige celle-fri sår område, og dette er vigtigt for at opstille kriterier for analysen. Scan mellemrum afhænger celletype, som mere invasive cellelinjer har en hurtigere sår lukning hastighed.

Denne migration/invasion ansøgning er relativt ligetil, og ved hjælp af den indbyggede analyse modul, celle bevægelse kan være grafen kinetisk med 3 målinger: sår bredde, sår sammenløbet og relative sår tæthed (figur 3). Alle tre kan bruges til at vurdere migration. Såret bredde beskriver den gennemsnitlige afstand i µm, når bilaterale celle plader flytter relativt parallelt, og er uafhængig af den oprindelige sår grænse. Såret sammenløbet og relative sår tæthed, tværtimod kræver indledende sår-grænsen i beregningen, og beskrive sammenløbet inden for området såret og celle tæthed i forhold til det unwounded område, henholdsvis. For invasion analyse anbefales relative sår tæthed, da det beregner området såret i forhold til de bilaterale celle ark. Læserne kan vælge den, der bedst repræsenterer deres behov.

Denne scratch sår migration/invasion assay kan være praktisk, men det kræver 96-pin skrabeværktøj, udpegede plader og live-celle imager med integreret migration/invasion modulet til at gengive de typiske resultater præsenteres i denne protokol, og disse kan være dyrt. Omkostningseffektiv erstatninger som en flad bund 96-brønd multiwell plade kan bruges og kan generere anstændig scratch sår (data ikke vist). Dog kunne udførelsen af den skrabeværktøj ikke så godt som når de udpegede plade blev brugt, og nogle sår kan ikke afhentes af scannetilstand (figur 8), således ikke korrekt definere området indledende sår. Derudover kan scratch-værktøj bruges til at oprette scratch sår, med analyse enten manuelt, ved billede behandlingsprogrammer, eller bruge andre end-point visualisering og analyse værktøj. De giver mere fleksibilitet for at finde de oprindelige sår, og derfor er ikke begrænset til de udpegede plader. På den anden side er indvandring/invasion analysen kombineret med live-celle imaging i den nuværende protokol mindre tidskrævende og mindre fejlbehæftet. Dette kan være særligt nyttigt for eksperimenterende sammenhæng og øget effektivitet.

Til sidst, er denne migration/invasion assay hurtig, nem og robust. Brugerne kan vælge fra vores protokol og andre baseret på deres behov og budget.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02	Dilute to 2x in DPBS
Countess II FL Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Automated cell counter
Detergent 1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	0.5% working concentration
Detergent 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		1% working concentration
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin
ECM Gel (matrigel)	Sigma-Aldrich	E6909	Growth-factor reduced, phenol red free
Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom	Essen	4379
EVE Counting slides	BioTools	EVS-50
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories	Essen	4444	Including CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte Cell migration kit	Essen	4493	Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software
IncuCyte ZOOM	Essen		Live cell analysis system
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	19278-5ML
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175