Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Betydelig sluttpunkt og proliferativ markører å vurdere liten intestinal skaden og tilpasning benytter en musen modell av kjemoterapi-indusert mukositt

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/59236
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Novo Nordisk Foundation Center of Basic Metabolic Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å etablere viktige endepunkter og proliferativ markører for små tarm skader og kompenserende hyperproliferation ved hjelp av en modell av kjemoterapi-indusert mukositt. Vi viser påvisning av voksende celler ved hjelp av en celle syklus spesifikk markør og ved hjelp av små tarm vekt, krypten dybde og villus høyde som endepunkter.

Abstract

Intestinal tilpasning er den naturlige kompenserende mekanismen som oppstår når tarmen er tapt på grunn av traumer. De adaptive responser, slik som krypten celle spredning og økt nærings absorpsjon, er avgjørende i utvinningen, men dårlig forstått. Forstå molekyl mekanismen bak adaptive svarene er avgjørende for å lette identifisering av næringsstoffer eller medikamenter for å forbedre tilpasningen. Ulike tilnærminger og modeller har blitt beskrevet gjennom hele litteraturen, men en detaljert beskrivende måte å i hovedsak utføre prosedyrene er nødvendig for å få reproduserbar data. Her beskriver vi en metode for å anslå viktige endepunkter og proliferativ markører for små tarm skader og kompenserende hyperproliferation ved hjelp av en modell av kjemoterapi-indusert mukositt i mus. Vi viser påvisning av voksende celler ved hjelp av en celle syklus spesifikk markør, samt bruk av små tarm vekt, krypten dybde og villus høyde som endepunkter. Noen av de kritiske skritt innenfor den beskrevne metoden er fjerning og veiing av tynntarmen og ganske komplekst programvaresystem foreslått for måling av denne teknikken. Disse metodene har fordelene at de ikke er tidkrevende, og at de er kostnadseffektive og enkle å gjennomføre og måle.

Introduction

Intestinal tilpasning er den naturlige kompenserende mekanisme som oppstår når tarmen er tapt på grunn av sykdom eller kirurgi1,2. Etter traumer gjennomgår tarmen en morphometric og funksjonell adaptiv respons, karakterisert ved krypten celle spredning og økt nærings absorpsjon3. Dette trinnet er kritisk i utvinningen, men dårlig forstått. Eksperimentelle studier av intestinal adaptive responsen har fokusert på endringene som oppstår etter liten tarm reseksjon i mus, rotter og griser, men forstå den molekylære mekanismen bak adaptiv respons i andre typer skader (f. eks kjemiske eller bakteriell) er avgjørende for å lette identifisering av næringsstoffer eller medikamenter for å forbedre tilpasningen. Eksperimentelt, ulike tilnærminger har blitt brukt for å beskrive komplekse molekylær og cellulær indeks av liten intestinal patologi, inkludert histopathological scoring og måle utfallet av skaden. Til tross for dette, hva er fraværende fra litteraturen er en detaljert beskrivelse av hvordan du utfører prosedyrer som er nødvendig for å få reproduserbar data. Når identifisere faktorer involvert i tilpasning, for eksempel gut hormoner, en enkel, lav kostnad, og reproduserbar dyremodell er garantert, og her foreslår vi at du bruker en modell av kjemoterapi-indusert intestinal mukositt (CIM).

En av de enkleste og svært informative endepunktene på både skade og tilpasning er å måle massen av tynntarmen (SI). Vi vet at et kjennetegn på mukositt er apoptose av enterocytes, tidsavhengig villus atrofi og redusert mitose. Derfor undersøker intestinal morfologi er svært relevant i prekliniske modeller4,5. Hos mennesker, en nedgang i plasma citrulline, en markør for fungerende enterocytes, samsvarer med toksisitet score og inflammatoriske markører6 i tillegg til absorberende kapasitet7, antyder denne aminosyren er en utmerket biomarkør av mukositt. Citrulline kan måles i både mus og rotter, og har vist gode sammenhenger med villus lengde8, Crypt overlevelse9, og stråling-indusert mukositt10.

En stor fordel med å måle plasma citrulline er evnen til å samle gjentatte målinger fra ett dyr. Flere blodprøver hos mus er imidlertid begrenset til et totalt blod volum på 6 μL/g/uke og krever generell anestesi. Dette begrenser dessverre også bruken av citrulline målinger hos mus. Videre er måling av citrulline krever høy ytelse flytende kromatografi11,12, som er kostbart og tidkrevende. Nylig viste vi at citrulline nivåer hos mus samsvarer betydelig med SI-vekt (p < 0,001) (upubliserte data), noe som gjør citrulline til en direkte måling som reflekterer enterocyte masse. En begrensning til måling av SI-vekt er nødvendigheten av at musene skal bli ofret, og dermed er det ikke mulig med gjentatte målinger innenfor samme mus. Fortsatt metoden gir mulighet til å utføre en rekke andre vev analyser rettet mot forskningen spørsmålet, og disse fakta kan tenkes gjøre opp for ytterligere bruk av dyr. Vi foreslår derfor å bruke SI-vekt som en enkel, rimelig og rask biomarkør av skader og tilpasning hos mus. For å sikre reproduserbarhet og akseptabel analytisk variasjon, bør tarmen fjernes forsiktig fra dyret, spyles med saltvann, tømt og tørket før veiing. I denne artikkelen viser vi nøyaktig hvordan denne prosedyren utføres.

Et annet kjennetegn på mukositt er tapet av voksende celler i Krypter og en kompenserende hyperproliferation under regenererende periode3. Den cellulære markør Ki67 har blitt hyppig brukt til å bestemme rask proliferativ celler ved hjelp av immunhistokjemi13. Selv om Ki67 er en enkel markør for spredning, har den en tendens til upresisjonsverdier som Ki67 er til stede under alle aktive faser av cellesyklusen (G1, S, G2 og M)14. Spesifikk merking er viktig for å oppdage replikere celler, og det er derfor vi foreslår in situ innlemmelse av 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU), en syntetisk analog av tymidin, som det i stor grad er begrenset til å kopiere celler i S-Phase15. BrdU injiseres i dyrene 150 minutter før ofring og celler kan senere oppdages med immunhistokjemi bruker BrdU spesifikke antistoffer. I denne metoden artikkelen viser vi nøyaktig hvordan å måle arealet av BrdU immunopositive celler i en krypten ved hjelp av en gratis bildeprogramvare.

Morfologiske og funksjonelle endringer er ofte studert i 5-FU indusert mukositt modeller, der intestinal tilpasning er vurdert av villus høyde og krypten dybde. I løpet av denne studien, fant vi at i den akutte fasen av mukositt, som er lik skade fasen, spredning målt ved BrdU innlemmelse er ikke korrelert med krypten dybde. I motsetning til dette, er krypten dybde signifikant korrelert med spredning sett i reparasjons fasen av mukositt, 3 til 5 dager etter induksjon. Dette tyder på at den akutte fasen av mukositt ikke er målbar av krypten dybde alene. Vi foreslår at når du bruker spredning som et endepunkt i den akutte fasen av mukositt mus, bør BrdU innlemmelse fortrinnsvis brukes, men når kvantitere hyperproliferation i senere stadium i den regenererende fasen, er krypten dybde en rimelig alternativ til BrdU innlemmelse. Målet med denne studien var å beskrive denne modellen på en måte at den kan brukes av alle forskere, både innen onkologi, men spesielt forskerne ikke er kjent med intestinal skade modeller.

Den beskrevne modellen kan brukes til å fenotype transgene modeller i henhold til adaptiv respons ved hjelp av kroppsvekt, SI vekt og krypten dybde som endepunkter. Som et eksempel, viser vi her hvordan vi brukte modellen av 5-Fluorouracil (5-FU) indusert mukositt i en mobilnettet Knock Out modell med utilstrekkelig L-celle sekresjon16. Glukagon-som peptid-1 (GLP-1) og glukagon-lignende peptid-2 (GLP-2) er intestinal hormoner co-skilles fra enteroendocrine L-celler som svar på matinntak17,18. GLP-2 er anerkjent som en viktig faktor for intestinal helbredelse, regulering av slimhinne apoptose og forbedring av barrierefunksjon av si19,20,21,22. Basert på litteraturen, hypotetisk gjennomsnitt vi at endogene hormoner er avgjørende for kompenserende hyperproliferation forekommer i adaptiv respons etter skade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet ble gjennomført i samsvar med retningslinjene i dansk lovgivning som regulerer dyr eksperimentering (1987). Studier ble utført med tillatelse fra den danske Animal eksperimenter tilsyn (2013-15-2934-00833) og den lokale etiske komiteen.

Merk: kvinnelige C57BL/6J mus (~ 20 − 25 g) ble innhentet og plassert åtte per bur i standard 12 h lys, 12 h mørk syklus med fri tilgang til vann og standard Chow. Dyrene var igjen å akklimatisere seg for ettall uke tidligere eksperimenter begynte.

1. induksjon av mukositt med 5-Fluorouracil

  1. Skaff 5-Fluorouracil (5-FU) i en 50 mg/mL oppløsning.
  2. Veie og registrere kroppsvekten til musene. Fra kroppsvekt, beregne mengden 5-FU for injeksjon (f. eks, 400 mg/kg).
  3. Forbered en 1 mL sprøyte koblet til en 27 G x 30 mm nål og fyll sprøyten med den beregnede mengden 5-FU for injeksjon.
  4. Holde musen ved scruff metoden. For å gjøre dette, grip foten av halen med en hånd og plassere den på en tå-gripende overflate, for eksempel en wire bar lokk. Mens du plasserer halen med en hånd, hold scruff i nakken med den andre hånden.
  5. Plasser kroppen til musen over en hånd ved å forlenge pekefingeren og tommel ryggen så langt som mulig. Plasser halen mellom fingrene på den samme hånden for å feste musen.
  6. Mens du opprettholder musen i et fast, men forsiktig grep, utsett den ventrale siden av musen og sett nålen inn i intraperitoneal hulrom på nedre høyre eller venstre kvadrant av magen. Aspirer for å sikre riktig plassering og injisere 400 mg/kg 5-FU.

2. tissue samling

  1. Bedøve musen med en intraperitoneal injeksjon av ketamin/xylazine (100/10 mg/kg) fortynnet i saltoppløsning (0,9% NaCl). Overvåk dybden av anestesi ved å observere klype tilbaketrekking refleks.
    Merk: anestesi er en anestesi uten gjenvinning.
  2. Noter vekten til den anesthetized musen.
  3. Plasser musen i en liggende posisjon og utføre en laparotomy å eksponere bukhulen, etterfulgt av et snitt av brystet hulrom å innføre pneumotoraks.
  4. Ved hjelp av saks, ofre dyret ved å kutte åpne membranen.
  5. Fjern tynntarmen. Skjær overlegen til pylorus, forsiktig trekke tynntarmen bort fra slaktkroppen til cecum er nådd og gjøre et kutt like før cecum.
  6. Bruke tang, forsiktig klemme proksimale lumen lukket. Bruk en 1 mL sprøyte med en 25 G nål vedlagt, skyll tynntarmen med saltvann for å fjerne avføringen.
  7. Fjern forsiktig saltvann fra tarm lumen med Kirurgiske instrumenter.
  8. Plasser tynntarmen på rent blotting papir for å forsiktig fjerne overflødig saltvann.
  9. Registrere vekten av spyles vev.
  10. Beregn den spyles lille tarm vekten som en prosentandel av kroppsvekten.

3. tynntarmen histologi

  1. Vevs forberedelser
    1. I en avtrekks hette, bruk saks til å kutte 3 cm deler av det spyles tarm vevet fra hver mus fra tolvfingertarmen, jejunum og ileum og fixate seksjoner i 10% formalin i 24 timer ved romtemperatur.
      Merk: bindemiddel volumet skal være 5 − 10 ganger av vevs volumet.
    2. Overfør det faste vevet til et skjærebrett.
    3. Ved hjelp av en skalpell, trim vevet til ca 1 cm og overføre til en embedding kassett.
      Merk: kassetten skal merkes med eksempel identifikasjonen (ID) med blyant.
    4. Senk kassetten i 70% etanol og oppbevar ved 4 ° c inntil videre behandling.
  2. Vev som bygges inn i parafin
    1. Tørke vevet ved å plassere i stigende alkohol løsninger. Plasser kassetten i 70% etanol for 1 time, etterfulgt av 80% etanol for 1 time, 95% etanol for 1 time og 100% etanol for 1,5 h. Overfør kassetten fra 100% etanol til xylen for 1,5 h.
    2. Dypp kassetten med parafinvoks som varmes opp mellom 58 − 60 ° c. Bruk tang til å plassere vevet i en tverrgående orientering og la blokkene avkjøles mer enn 24 h til solid.
  3. Skjære vev ved hjelp av en mikrotomen
    1. Plasser blokk, vev med forsiden ned på isen i 5 min. Bruk en mikrotomen til å trimme parafinblokkene med en tykkelse på 10 − 30 μm for å avdekke vevs overflaten.
    2. Skjær tverrsnitt av vev blokken mellom 3 − 5 μm, gjør tverrgående seksjoner fra tolvfingertarmen, jejunum og ileum.
    3. Plasser para fin båndet i et vannbad sett mellom 40 − 45 ° c. Bruk tang for å skille delene.
    4. Bruk objektglass for å plukke opp seksjonene fra vannet.
    5. Lufttørke lysbildene i 30 minutter før farging.
      Merk: Oppbevar lysbildene i et kjøleskap for lagring over en lengre tidsperiode.
  4. Hematoksylin-eosin farging av vev
    1. Plasser objektglassene i en histologi vugge. Deparaffinize lysbildene i et oppvarmings skap satt til 60 ° c i 60 min.
      Merk: lysbilder direkte fra kjøleskapet bør overlates til å nå romtemperatur før du plasserer dem i et varme kabinett.
    2. I avtrekks panseret, rehydrate vevet i 3 forandringer av en clearing agent (tabell av materialer), lage 20 dips i første clearing agent jar og la dem stå i 7 − 8 min i hver av de to ekstra clearing agent krukker. Overfør lysbildene til synkende alkohol løsninger, Start med 3 endringer av 99% etanol, etterfulgt av 2 endringer av 96% etanol og 70% etanol. Lag minst 20 dips i hver krukke. Overfør til rennende vann og la lysbildene stå i 5 min.
    3. Dypp lysbildene i filtrert Meyers hematoksylin i 1 min.
    4. Vask prøvene i rennende vann fra springen i 5 min.
    5. Dypp delene i eosin flekken i 1 − 2 min, og skyll deretter i vann fra springen.
    6. Tørke vevet ved å plassere i stigende alkohol løsninger. Start med 70% etanol, etterfulgt av 96% etanol, 96% etanol, og 4 ganger 99% etanol. Lag et minimum av 20 dips i hver krukke, og la holderen stå i 99% etanol til de er montert.
    7. Monter coverslips ved å påføre en liten mengde festemiddelet på overflaten av lysbildene. Sett dekkglass på toppen av monterings mediet uten å lage bobler under dekkglass. La det tørke i 24 timer.
    8. Undersøk vevet ved hjelp av et lett mikroskop som er koblet til et kamera for å få histologiske bilder. Bruk et 10x mål å ta øyeblikksbilder til en full dekning av vevet lysbildet er nådd.

4. måling av krypten dybde og/eller villus høyde

  1. Last ned og Installer analyseprogramvaren (for eksempel Zen lite, tabell over materialer).
  2. Åpne bildet i programvaren og koble til kameraet. Ta øyeblikksbilder i kameramodus med 20x objektiv.
  3. Åpne øyeblikksbildet i behandlingsmodus.
  4. For å måle krypten dybde: i 2D-visningen, Velg linjeverktøyet fra grafikk fanen. Velg en godt orientert krypten og start linjen nederst på en villus og finish på bunnen av krypten. Gjenta denne handlingen for 20 godt orienterte Krypter (supplerende figur 1).
  5. For å måle villus høyde: i 2D-visningen, Velg linjeverktøyet fra grafikk fanen. Velg en godt orientert villus og start linjen på slutten av luminal projeksjon og finish ved starten av krypten. Gjenta denne handlingen for 20 godt orienterte Villi (supplerende figur 1).
  6. Bytt fra 2D-visning til mål-visningen for å vise målingene.
  7. Eksportere målingene og beregne gjennomsnittet av krypten dybde og villus høyde.

5. BrdU kvantifisering (spredning) ved immunhistokjemi

  1. Injeksjon av BrdU-løsningen
    1. Veie og registrere kroppsvekten til musene.
    2. I en avtrekks hette, utarbeide en representativ mengde 0,5% w/v bromodeoxyuridine (BrdU) oppløsning i fosfat bufret saltvann (PBS).
    3. I avtrekks panseret, Injiser 50 mg/kg av BrdU ved intraperitoneal injeksjon.
      Merk: for å sikre at hver mus er euthanized på nøyaktig 150 min innlegg BrdU injeksjon, injisere hver enkelt mus i rekkefølge med 10 − 20 min intervall i mellom for å kunne utføre vevet samlingen.
    4. Registrer injeksjons tidspunktet.
    5. Vent 150 min, deretter bedøve mus og samle vevet som beskrevet i trinn 2.1 − 2.7. Utfør BrdU-immunhistokjemi som beskrevet i avsnitt 5,2.
  2. BrdU immunhistokjemi
    1. Klargjør vevet som beskrevet i trinn 3.1.1 − 3.3.4.
    2. For antigen gjenfinning, plassere et lysbilde vugge med delene i et glass histologi jar og fyll den med EDTA buffer (pH 9) i en mikrobølgeovn i 1 min på 750 W etterfulgt av 9 min ved 350 W. Gjenta syklus.
      Merk: Pass på at vevet ikke tørker ut, noe som kan kreve å legge mer buffer til glassene mellom oppvarming.
    3. Vask seksjoner 2 − 3 ganger i Tris-bufret saltvann og polysorbat 20 (TBS-T) buffer for 3 min hver.
    4. Påfør 5 dråper peroxide blokk (tabell av materialer) i 10 − 15 min ved romtemperatur for å blokkere endogene peroksidase aktivitet. Vask seksjoner 2 − 3 ganger i TBS-T buffer for 3 min hver.
    5. Påfør 5 dråper gnager blokk buffer (tabell av materialer) i 30 min ved romtemperatur, for å blokkere ikke-spesifikk binding. Vask seksjoner 2 − 3 ganger i TBS-T buffer for 3 min hver.
    6. Ruge delene med en monoklonale mus anti-BrdU antistoff fortynnet 1:500 for 1 time ved romtemperatur. Vask seksjoner 2 − 3 ganger i TBS-T buffer for 3 min hver.
    7. Visualiser immunopositivity ved hjelp av 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) ved å påføre 5 dråper pepperrot peroksidase på hvert lysbilde og ruge i 15 min ved romtemperatur. Overfør delene til en avtrekksvifte, tilsett 150 μL av DAB og ruge i 5 minutter.
      Merk: Bruk alltid hansker når du håndterer DAB og kast avfallet på riktig måte.
    8. Skyll delene i deionisert vann.
    9. Tørke vevet og Monter en dekkglass som beskrevet i trinn 3.4.6 og 3.4.7.
  3. Visualisering av immunoreactions
    1. Visualiser vevsprøven med et lett mikroskop koblet til et kamera.
    2. Bruk analyseprogramvaren til å få mikroskop bilder ved hjelp av en 20x målsetting av alle seksjoner og lagre filer i. JPG-format.
    3. Ta et øyeblikksbilde av en scene mikrometer ved hjelp av en 20x objektiv, som vil bli brukt som et kalibreringsverktøy i ImageJ programvare.
  4. Måle arealet av BrdU immunoreactive celler
    1. Installere ImageJ-programvare (tabell med materialer).
    2. Tilordne skala til et bilde i ImageJ: åpne scenen mikrometer bildet ved hjelp av ImageJ fil | Åpne menykommandoen. Velg det lineære markeringsverktøyet.
    3. Velg det rette verktøyet, og tegn en rett linje på det mikrometer bildet for å definere en kjent avstand.
    4. Velg Angi skalering under analyse -menyen.
    5. Skriv inn en verdi i kjent avstand -boksen, og Definer lengden på enheten i boksen enhet . Velg global , slik at denne kalibreringen gjelder for alle bilder som er åpnet i denne ImageJ-økten.
    6. Åpne et bilde av interesse ved hjelp av ImageJ -filen | Åpne menykommandoen for å måle arealet av BrdU immunoreactive celler per krypten.
    7. Angi fargegrafikk til 8-biters under bilde/type- menyen.
    8. Øk kontrasten i bildet under Process/forbedre kontrasten og sette mettet piksler til 0,4%.
    9. Bruk en terskel på bildet for å segmentere immunopositivity. Velg bilde/Juster undermeny, deretter terskel og Velg fargen rød (mørkt område vist i rødt). Velg en terskel på rundt 10 − 20% ved å flytte terskel linjen.
      Merk: Velg en terskel som inkluderer alle BrdU positive celler med så lite bakgrunn som mulig. Den valgte prosenten bør gjelde for alle inndelinger.
    10. Velg et godt orientert krypten, det vil si en fullstendig krypten fra intakt vev, og Velg verktøyet for fri hånds markering for å markere området rundt.
    11. Hvis du vil måle terskel området, velger du analyse -fanen, etterfulgt av analyse partikler. I vinduet analyse partikkel angir du størrelse til 20-uendelig, klikk på boks piksel enhetene, sett sirkularitet til 0,00 − 1,00, og sett Vis til disposisjoner. Klikk boksene vise resultater, oppsummereog inkludere hull.
      Merk: verdiene for BrdU positive celler genereres automatisk i et resultat vindu som viser de individuelle målingene for hver BrdU-positive celle. Videre genereres et Oppsummerings vindu automatisk, viser antall tellinger, totalareal, gjennomsnittlig størrelse og prosentandel av området med BrdU positive celler.
    12. Gjenta trinn 5.4.10 og 5.4.11 for å måle en ny krypten. Resultatene av alle målte Krypter vil bli vist i Oppsummerings vinduet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I det første eksperimentet, induserte vi mukositt i mus på dag 0 og ofret en gruppe av mus hver dag i 5 sammenhengende dager. Ved måling av SI vekt, fant vi at denne parameteren gikk ned fra dag 2 til dag 4 antyder et tap i enterocyte massen. Vi fant også at på dag 5, var SI vekten ikke signifikant forskjellig fra dag 0 (ubehandlede mus) (figur 1). Spredningen målt ved inkorporering av BrdU ble nesten avskaffet på dag 1 og dag 2, men på dag 4 og dag 5 var det omtrent fire ganger og fem ganger økning i spredning, henholdsvis (figur 2). Denne hyperproliferation ble også illustrert ved måling av krypten dybden (Figur 3). Hva er ikke illustrert ved å måle krypten dybden er tapet i voksende celler på dag 1 og dag 2, der krypten dybden ble redusert med ca 13%, men var ikke signifikant forskjellig fra sunne mus. Vi kan vise at i den regenererende fase av mukositt var det en sterk sammenheng mellom BrdU innlemmelse og krypten dybde, men dette gjorde ikke telle for den akutte fasen som indikerer at krypten dybde som et endepunkt kan ikke være egnet i den akutte fasen av mukositt (Figur 4).

I den andre studien, undersøkte vi mucostis i vår transgene Mouse-modell med utilstrekkelig L celle sekresjon. Mus med mangelfull GLP-1 og GLP-2 viste et alvorlig tap av kroppsvekt (BW) og en reduksjon i SI-vekt i gjenopprettings fasen, som var svært signifikant sammenlignet med den ville typen (WT) 5-FU-mus (p < 0,01) (figur 5a, B). Videre klarte ikke transgene musene å vise kompenserende hyperproliferation; Krypter var betydelig kortere enn i både WT mus og sunne kontroller. I motsetning til dette viste WT mus en økning i krypten dybde som et tegn på hyperproliferation (figur 5c).

Figure 1
Figur 1: liten tarm vekt. Mus ble ofret 1 til 5 dager etter 5-FU injeksjon på dag 0 og tarm vekten ble målt som beskrevet. Resultatene er vist som gjennomsnittet ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). n = 13. Dette tallet er blitt modifisert fra Hytting-Andreasen et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: BrdU immunopositive celler per krypten for tolvfingertarmen, jejunum, og ileum av si. Mus ble ofret 1 til 5 dager etter 5-FU injeksjon på dag 0 og BrdU innlemmelse ble kvantifisert av immunhistokjemi som beskrevet. Resultatene vises som gjennomsnittet ± SEM. n = 13. * p < 0,05, * * * p < 0,001 sammenlignet med dag 0 (analyse av varians [ANOVA] etterfulgt av Dunnett flere sammenligning test). p < 0,001 sammenlignet med dag 0 (ANOVA etterfulgt av Dunnett flere sammenligning test). Dette tallet er blitt modifisert fra Hytting-Andreasen et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: måling av krypten dybde. Mus ble ofret 1 til 5 dager etter 5-FU injeksjon på dag 0 og Crypt dybde ble målt som beskrevet. Resultatene vises som gjennomsnittet ± SEM. n = 13. * p < 0,05, * * * p < 0,001 sammenlignet med dag 0 (ANOVA etterfulgt av Dunnett flere sammenligning test). Dette tallet er blitt modifisert fra Hytting-Andreasen et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: korrelasjon av krypten dybde og BrdU. Crypt dybde (i tolvfingertarmen, jejunum, og ileum) er korrelert til BrdU innlemmelse på hver dag av offer ved hjelp av tosidige Pearson korrelasjon test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: GLP-1-og GLP-2-mus kan ikke regenerere etter akutte mukositt. (A) endring i BW (%), (B) si vekt (g), og (C) Crypt dybde i ileum (μm). Resultatene vises som gjennomsnittet ± SEM. TG = transgene mus; WT = vill type mus; 5-FU = 5-Fluorouracil. n = 4 − 8. * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 sammenlignet med sunn kontroll (WT saltvann), a = p < 0,05, AA = p < 0,01, AAA = p < 0,001 sammenlignet med WT 5-FU (toveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni flere sammenlignings tester [BW] eller ANOVA etterfulgt av Dunnett flere comparis på test). Dette tallet er blitt modifisert fra Hytting-Andreasen et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1: liten tarm vev før induksjon av mukositt, under den akutte fase og utvinning fase av mukositt. (A) Haemotoxylin og Eosin (H & E) farging og (D) BrdU farging i ubehandlede mus. Den svarte stiplede linjen i panel A er et eksempel på et godt orientert krypten, mens den prikkete grønne linjen demonstrerer et godt orientert villus. (B) H & E farging og (E) BrdU farging under den akutte fasen av mukositt. (C) H & E farging og (F) BrdU farging under gjenopprettings fasen etter induksjon av mukositt. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi en allment tilgjengelig metode for å studere SI skade og regenerering i en musemodell. Et bredt utvalg av prekliniske dyr modeller av intestinal skade eksisterer, men det er viktig vi forstår at hver modell er unik og at endepunktene må være hensiktsmessig å svare på spørsmålet om forskning. Denne modellen er utmerket til å studere adaptiv respons på skade, men endepunktene bør endres når du bruker modellen som en pre-klinisk modell av mukositt. Imidlertid er oversettelse fra dyremodeller til pasienter utfordrende23. Våre foreslåtte endepunkter av SI vekt og spredning bør begrenses til studiet av adaptive respons bare. Studiet av endogene faktorer krever ofte bruk av transgene mus, og selv om små tarm reseksjon er mulig i mus1, kan denne modellen være et alternativ for å unngå post-operative dødelighet. Ved anvendelse av denne modellen til transgene mus, er det viktig å se på musene nøye og overvåke vekten hver dag. Under denne studien opplevde noen av musene et vekttap på opptil 30%, noe som er ganske betydelig. For å unngå høy dødelighet i følsomme fenotyper, foreslår vi at du utfører pilotstudier i transgene mus, siden Dosejustering kan være nødvendig.

Et kritisk trinn i den beskrevne metoden er fjerning og veiing av SI. Det er viktig at fjerning og håndtering utføres på samme måte og av samme forsker hver gang for å unngå store Inter-analysen variasjoner.

Konsistensen av krypten og villus utvalg er viktig for å unngå varians og bias når du måler krypten dybde og villus høyde. Ved innebygging av vevet i parafin, er tarmen posisjonert i oppreist stilling for å gjøre tverrgående kutt, og dermed øke muligheten for intakt Villi og Krypter. Etter klipping av vevet, er en godt orientert krypten og/eller villus valgt. Utvalget er basert på den fulle visualisering av hele krypten og villus i samme plan og tilstedeværelsen av klare grenser av celler i krypten og villus. En begrensning på denne metoden er noe subjektiv tilnærming når du velger en godt orientert krypten siden valg av en godt orientert krypten og/eller Villi er laget etter å kutte vevet. En tidligere studie24 har presentert en alternativ metode for å overvinne denne begrensningen, der de bruker microdissection. I denne metoden, Villi og Krypter er valgt mens observere under et mikroskop, før vevet blir kuttet, og dermed gjør det mulig å sikre at en intakt krypten og Villi blir dissekert fra vevet.

I motsetning til tidligere metoder som brukes til kvantitet BrdU positive celler25,26, denne protokollen beskriver området BrdU positive celler per krypten, som gir en rask måte å quantitate proliferativ celler innenfor hver krypten. Denne teknikken, men kan være noe restriktiv siden det krever en mer inngående kjennskap til programvaren foreslått for måling av denne teknikken. En fremtidig anvendelse av denne protokollen kan være å lage en mer automatisk generert metode for å kvantifisere og måle BrdU positive celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en ubegrenset bevilgning fra Novo nordisk Center for Basic metabolsk Research og Lundbeck Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Fluorouracil Hospira Nordic AB, Sweden 137853
Ketaminol®Vet Merck, New Jersey, USA 511485
Rompun®Vet Xylazine Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. 148999
10% nautral formalin buffer Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom BAF-5000-08A
HistoClear National Diagnostics, United Kingdom HS-200
Pertex HistoLab®, Sweden 840
BrdU Sigma-Aldrich, Germany. B5002
Tris/EDTA pH 9 buffer Thermofisher scientific, Denmark TA-125-PM4X
Peroxide Block Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Rodent Block buffer Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody Thermofisher Scientific, Denmark. MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto Thermofisher Scientific, Denmark. TA-125-ADQ
Horseradish peroxidase Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition) Carl Zeiss A/S https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software LOCI, University of Wisconsin https://imagej.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
  2. Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
  3. Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
  4. Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
  5. Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
  6. Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
  7. Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
  8. Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
  9. Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
  10. Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
  11. Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
  12. van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
  13. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  14. Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
  15. Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
  16. Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046 (2018).
  17. Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
  18. Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
  19. Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
  20. Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
  21. Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
  22. Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
  23. Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
  24. Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
  25. Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).
  26. Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).

Tags

Kreftforskning små intestinal skade proliferativ markører BrdU krypten dybde villus høyde kompenserende hyperproliferation
Betydelig sluttpunkt og proliferativ markører å vurdere liten intestinal skaden og tilpasning benytter en musen modell av kjemoterapi-indusert mukositt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Billeschou, A., Hunt, J., Kissow, H. … More

Billeschou, A., Hunt, J., Kissow, H. Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis. J. Vis. Exp. (147), e59236, doi:10.3791/59236 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter