Summary
여기에서, 우리는 화학요법 유도한 점막염의 모형을 사용하여 소장 상해 및 보상 과증식의 중요한 종점 그리고 증식 마커를 설치하는 프로토콜을 제시합니다. 우리는 세포 주기 특정 마커를 사용하여 작은 장 무게, 토굴 깊이 및 융모 높이를 엔드포인트로 사용하여 증식 세포의 검출을 입증합니다.
Abstract
장 적응은 외상으로 인해 창자를 잃을 때 발생하는 자연적인 보상 메커니즘입니다. 토굴 세포 증식 및 증가된 영양소 흡수와 같은 적응 반응은 회복에 매우 중요하지만 제대로 이해되지 않습니다. 적응 반응 뒤에 분자 기계장치를 이해하는 것은 적응을 강화하기 위하여 양분 또는 약의 확인을 촉진하기 위하여 중요합니다. 문헌 전반에 걸쳐 다양한 접근법과 모델이 설명되었지만, 재현 가능한 데이터를 얻기 위해서는 절차를 본질적으로 수행하는 상세한 설명 방법이 필요합니다. 여기서, 우리는 마우스에서 화학요법 유도 점막염의 모형을 사용하여 소장 상해 및 보상 과증식의 중요한 종점 및 증식 마커를 추정하는 방법을 기술합니다. 우리는 세포 주기 특정 마커를 사용하여 증식 세포의 검출뿐만 아니라, 엔드 포인트로 소장 무게, 토굴 깊이 및 융모 높이를 사용하여 보여줍니다. 설명된 방법 내의 중요한 단계 중 일부는 소장의 제거 및 계량과 이 기술의 측정을 위해 제안된 다소 복잡한 소프트웨어 시스템입니다. 이러한 방법은 시간이 많이 걸리지 않으며 비용 효율적이고 수행하기 쉽고 측정하기 쉽다는 장점이 있습니다.
Introduction
장 적응은 질병 이나 수술로 인해 창 자를 잃었을 때 발생 하는자연 보상 메커니즘 1,2. 외상 후, 창자는 세포 증식 및 증가 된 영양소 흡수를 특징으로하는형태 및 기능적 적응 반응을 겪습니다 3. 이 단계는 복구에 중요 하지만 제대로 이해. 장 적응 반응의 실험 연구는 마우스, 쥐 및 돼지에서 작은 창자 절제 후 발생하는 변화에 초점을 맞추고 있지만, 다른 종류의 부상 (예 : 화학적)에서 적응 반응 뒤에 분자 메커니즘을 이해 또는 세균)은 적응을 향상시키기 위해 영양소 또는 약물의 식별을 용이하게하는 데 중요합니다. 실험적으로, 다른 접근은 조직 병리학 적인 점수를 포함하여 소장 병리학의 복잡한 분자 및 세포 색인을 기술하기 위하여 이용되었습니다 상해의 결과를 측정하. 그럼에도 불구하고, 문헌에서 없는 것은 재현 가능한 데이터를 얻는 데 필요한 절차를 수행하는 방법에 대한 자세한 설명입니다. 창자 호르몬과 같은 적응에 관여하는 요인을 식별할 때, 쉽고, 저렴한 비용, 그리고 재현 가능한 동물 모형은 보증되고 여기에서 우리는 화학요법 유도한 장 점막염 (CIM)의 모형을 사용하여 건의합니다.
부상과 적응의 가장 간단하고 매우 유익한 끝점 중 하나는 소장 (SI)의 질량을 측정하는 것입니다. 우리는 점막염의 특징이 장세포의 세포증, 시간에 의존하는 융모 위축 및 감소 된 유사분열이라는 것을 알고 있습니다. 따라서 장 형태를 검사하는 것은 전임상 모델4,5에서매우 관련이 있습니다. 인간에서, 플라즈마 시트룰린의 감소, 기능 장세포의 마커, 독성 점수및 염증 마커와 상관 관계6 흡수 용량 이외에7, 이 아미노산은 우수한 바이오 마커제안 점막염. 시트룰린은 마우스와 래트 둘 다에서 측정될 수 있으며, 융모 길이8,토굴 생존9, 및 방사선 유도 점막염10과우수한 상관관계를 나타내고 있다.
플라즈마 시트룰린 측정의 주요 장점은 한 동물에게서 반복측정을 수집하는 능력입니다. 그러나, 마우스에 있는 다중 혈액 샘플링은 6 μL/g/week의 총 혈액 양으로 제한되고 전신 마취를 요구합니다. 이것은 불행하게도 또한 마우스에 있는 시트룰린 측정의 사용을 제한합니다. 또한, 시트룰린의 측정은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리는 고성능 액체 크로마토그래피11,12를필요로 합니다. 최근, 우리는 쥐의 시트룰린 수준이 SI 중량 (p < 0.001)(미공개 데이터)과 유의하게 상관 관계가 있음을 보여주었으며, 시트룰린은 장세포 질량을 반영하는 직접 측정을 합니다. SI 중량의 측정에 대한 제한은 마우스가 희생될 필요성이며 따라서 동일한 마우스 내에서 반복된 측정이 불가능합니다. 여전히 이 방법은 연구 질문에 대한 다양한 다른 조직 분석을 수행할 수 있는 가능성을 제공하며, 이러한 사실은 동물의 추가 사용을 만회할 수 있습니다. 따라서 우리는 SI 무게를 마우스의 부상과 적응의 쉽고 저렴한 비용으로 빠른 바이오마커로 사용하는 것이 좋습니다. 재현성과 허용 가능한 분석 적 변화를 보장하기 위해 내장은 동물에서 조심스럽게 제거하고 식염수로 씻어 내고 비우고 계량하기 전에 건조해야합니다. 이 문서에서는 이 절차가 수행되는 방법을 정확하게 보여 주시겠습니다.
점막염의 또 다른 특징은 토굴에서 증식 세포의 손실과 재생 기간 동안 보상 과증식3입니다. 세포 마커 Ki67은 면역 조직 화학13에의해 빠른 증식 세포를 결정하기 위해 자주 사용되어 왔다. Ki67은 증식의 단순한 마커이지만, Ki67이 세포 주기(G1, S, G2 및 M)의 모든 활성 단계동안 존재하기 때문에 부정확성(14)을 갖는다. 특정 라벨링은 복제 세포를 검출하는 데 필수적이며, 이는 우리가 S 상15에서복제 세포로 크게 제한되기 때문에 티미딘의 합성 유사체인 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU)의 situ 혼입에 제안하는 이유입니다. BrdU는 희생하기 150분 전에 동물에 주입되고 세포는 BrdU 특이적 항체를 사용하여 면역히스토화학으로 이후에 검출될 수 있다. 이 방법 문서에서는, 우리는 자유 이미지 소프트웨어를 사용하여 토굴 내의 BrdU 면역 양성 세포의 면적을 측정하는 방법을 정확하게 보여줍니다.
형태학적 및 기능적 변화는 종종 5-FU 유도 점막염 모델에서 연구되며, 장 적응은 융모 높이와 토굴 깊이에 의해 평가됩니다. 이 연구 기간 동안, 우리는 상해 단계와 동일한 점막염의 급성 기 동안 BrdU 통합으로 측정 된 증식이 토굴 깊이와 상관되지 않는다는 것을 발견했습니다. 이와 는 대조적으로, 토굴 깊이는 점막염의 수리 단계에서 볼 수있는 증식과 크게 상관 관계가 있으며, 유도 후 3 ~ 5 일. 이것은 점막염의 급성 단계가 혼자 토굴 깊이에 의해 측정할 수 없다는 것을 건의합니다. 우리는 점막염 마우스의 급성 단계에서 종점으로 증식을 사용하는 경우, BrdU 통합이 바람직하게는 사용되어야하지만, 재생 단계 동안 후기 단계에서 과확산을 정량화 할 때, 토굴 깊이는 합리적인 것이 좋습니다 BrdU 설립에 대한 대안. 이 연구의 목표는 종양학 분야뿐만 아니라 특히 장 손상 모델에 익숙하지 않은 모든 연구자에 의해 사용될 수있는 방식으로이 모델을 설명하는 것이었습니다.
기재된 모델은 체중, SI 중량 및 토굴 깊이를 엔드포인트로 사용하는 적응반응에 따라 형질전환 모델을 표현하기 위해 사용될 수 있다. 일례로, 우리는 5-플루오로라실(5-FU)의 유도 점막염의 모델을 세포에서 부족한 L 세포 분비(16)를 가진 모델을 노크하는 방법을 보여준다. 글루카곤형 펩타이드-1(GLP-1) 및 글루카곤형 펩티드-2(GLP-2)는 음식 섭취량에 반응하여 장내 내분비 L세포로부터 공동 분비되는 장호르몬이다(17,18). GLP-2는 장 치유, 점막 세포자멸의 조절 및 SI19,20,21,22의장벽 기능 의 개선을위한 중요한 요소로 인식되고 있습니다. 문헌에 근거하여, 우리는 내인성 호르몬이 상해 후에 적응 반응에서 일어나는 보상 과증식을 위해 필수적이다는 것을 가설을 세워.
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Protocol
기재된 모든 방법은 동물 실험을 관장하는 덴마크 법률의 지침에 따라 수행되었다(1987). 연구는 덴마크 동물 실험 검사 (2013-15-2934-00833)와 지역 윤리위원회의 허가로 수행되었습니다.
참고 : 여성 C57BL / 6J 마우스 (~ 20−25g)를 획득하고 물과 표준 차우에 무료로 액세스 할 수있는 표준 12 시간 빛, 12 시간 다크 사이클에서 케이지 당 8 개 보관했습니다. 동물들은 실험이 시작되기 1주일 전에 적응하도록 방치하였다.
1. 5-플루오로라실을 이용한 점막염 유도
- 50 mg/mL 용액에 5-플루오로라실(5-FU)을 구하십시오.
- 마우스의 체중을 계량하고 기록합니다. 체중에서 주사를 위한 5-FU의 양을 계산합니다(예: 400 mg/kg).
- 27G x 30mm 바늘에 연결된 1 mL 주사기를 준비하고 주사기를 주입을 위해 계산된 양인 5-FU로 채웁니다.
- 스크러프 방법으로 마우스를 억제합니다. 이렇게 하려면 한 손으로 꼬리의 베이스를 잡고 와이어 바 뚜껑과 같은 발가락 그립 표면에 놓습니다. 한 손으로 꼬리를 포지셔닝하는 동안, 다른 손으로 목 덜미를 잡습니다.
- 가능한 한 집게 손가락과 엄지 손가락을 뒤로 뻗어 마우스의 몸을 한 손으로 단단히 놓습니다. 이 같은 손의 손가락 사이에 꼬리를 놓아 마우스를 고정합니다.
- 단단하지만 부드러운 그립에 마우스를 유지하면서, 마우스의 복부 측면을 노출하고 복부의 오른쪽 또는 왼쪽 사분면에 복강 내 구멍에 바늘을 삽입. 적절한 배치를 보장하고 400 mg / kg 5-FU를 주입합니다.
2. 조직 수집
- 식염수 (0.9 % NaCl)에서 희석 된 케타민 / 자일라진 (100 / 10 mg / kg)의 복강 내 주사로 마우스를 마취하십시오. 핀치 철수 반사를 관찰하여 마취의 깊이를 모니터링합니다.
참고 : 마취는 비 회복 마취입니다. - 마취 된 마우스의 무게를 기록합니다.
- 마우스를 척추 위치에 놓고 복강을 노출시키기 위해 개복술을 수행하고 가슴 구멍을 절개하여 기흉을 소개합니다.
- 가위를 사용하여 다이어프램을 열어 동물을 희생하십시오.
- 소장을 제거하십시오. 유문보다 우월하게 자르고, 소골이 닿을 때까지 소장을 시체에서 조심스럽게 철회하고 장막 바로 앞에서 잘라냅니다.
- 집게를 사용하여 근위 내강을 부드럽게 고정합니다. 25G 바늘이 부착 된 1 mL 주사기를 사용하여 소장에 식염수로 씻어 대변을 제거하십시오.
- 수술 기구로 장 내강구에서 식염수를 부드럽게 제거하십시오.
- 소장을 깨끗한 블로팅 페이퍼에 놓고 여분의 식염수를 조심스럽게 제거합니다.
- 플러시 된 조직의 무게를 기록하십시오.
- 플러시된 소장 무게를 체중의 백분율로 계산합니다.
3. 소장 학장학
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조직 준비
- 연기 후드에서, 십이지장, jejunum 및 ileum에서 각 마우스에서 각 마우스에서 플러시 된 장 조직의 3cm 부분을 잘라 가위를 사용하고 실온에서 24 시간 동안 10 % 포르말린에 고정 섹션.
참고 : 고정 부피는 조직 부피의 5-10 배여야합니다. - 고정 된 조직을 도마에 옮김으로 옮김.
- 메스를 사용하여 조직을 약 1cm로 다듬고 임베딩 카세트로 옮김을 넣습니다.
참고: 카세트는 연필로 샘플 식별(ID)으로 라벨을 부착해야 합니다. - 카세트를 70% 에탄올에 담그고 추가 처리가 될 때까지 4°C에서 보관하십시오.
- 연기 후드에서, 십이지장, jejunum 및 ileum에서 각 마우스에서 각 마우스에서 플러시 된 장 조직의 3cm 부분을 잘라 가위를 사용하고 실온에서 24 시간 동안 10 % 포르말린에 고정 섹션.
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파라핀에 조직 포함
- 오름차순 알코올 솔루션에 배치하여 조직을 탈수. 카세트를 1시간 동안 70% 에탄올에 놓고, 1시간 동안 80% 에탄올, 1시간 동안 95% 에탄올, 1.5시간 동안 100% 에탄올에 1.5시간 동안 카세트를 1.5시간 동안 자일렌으로 옮김.
- 58--60 °C 사이에 가열된 파라핀 왁스로 카세트를 담그세요. 포셉을 사용하여 조직을 가로 방향으로 배치하고 블록이 단단해질 때까지 24시간 이상 식힙니다.
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마이크로토메를 사용하여 조직 절단
- 블록, 조직을 5 분 동안 얼음에 얼굴을 향하게합니다. 마이크로 토메를 사용하여 파라핀 블록을 10-30 μm 두께로 다듬어 조직 표면을 노출시다.
- 3-5 μm 사이의 조직 블록의 단면을 잘라 십이지장, 제주넘 및 장으로부터 횡절편을 만듭니다.
- 파라핀 리본을 40-45°C 사이에 놓은 수조에 놓습니다. 집게를 사용하여 섹션을 분리합니다.
- 현미경 슬라이드를 사용하여 물에서 섹션을 선택합니다.
- 얼룩이 지기 전에 슬라이드를 30분 동안 공기 건조시.
참고: 장기간 보관할 수 있도록 냉장고에 슬라이드를 보관하십시오.
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조직의 헤마톡실린 에오신 염색
- 현미경 슬라이드를 조직학 요람에 놓습니다. 60°C로 설정된 가열 캐비닛에서 슬라이드를 60분 동안 분리합니다.
참고 : 냉장고에서 직접 슬라이드는 가열 캐비닛에 배치하기 전에 실온에 도달하도록 남아 있어야합니다. - 연기 후드에서, 클리어링 에이전트(재료의표)의 3 변화에 조직을 재수화, 첫 번째 클리어링 에이전트 항아리에 20 딥을 한 다음 두 개의 추가 클리어링 에이전트 항아리의 각각에 7-8 분 동안 방치. 슬라이드를 내림차순 알코올 솔루션으로 옮기고 99 % 에탄올의 3 가지 변경으로 시작하고 96 % 에탄올과 70 % 에탄올의 2 가지 변경으로 시작합니다. 각 병에 최소 20 딥을 만드십시오. 흐르는 물로 옮기고 슬라이드를 5 분 동안 방치하십시오.
- 여과된 마이어의 헤마톡실린에 슬라이드를 1분 동안 담그십시오.
- 샘플을 흐르는 수돗물로 5 분 동안 씻으시다.
- 에오신 얼룩에 1-2 분 동안 담근 다음 수돗물로 헹구어 냅니다.
- 오름차순 알코올 솔루션에 배치하여 조직을 탈수. 70% 에탄올로 시작하여 96% 에탄올, 96% 에탄올, 4회 99% 에탄올로 시작합니다. 각 병에 최소 20 딥을 만들고 거치대는 장착 될 때까지 99 % 에탄올에 서있게하십시오.
- 마운트 는 슬라이드의 표면에 장착 매체의 소량을 적용하여 입술을 커버. 커버 슬립 아래에 기포를 만들지 않고 장착 매체 위에 커버 슬립을 놓습니다. 24 시간 동안 건조시키십시오.
- 카메라에 연결된 가벼운 현미경을 사용하여 조직을 검사하여 조직학적 사진을 얻습니다. 조직 슬라이드의 전체 범위에 도달 할 때까지 스냅 샷을 찍을 10x 목표를 사용합니다.
- 현미경 슬라이드를 조직학 요람에 놓습니다. 60°C로 설정된 가열 캐비닛에서 슬라이드를 60분 동안 분리합니다.
4. 토굴 깊이 및/또는 융모 높이 측정
- 분석 소프트웨어(예: 젠 라이트, 재료 표)를다운로드하여 설치합니다.
- 소프트웨어에서 이미지를 열고 카메라에 연결합니다. 20배 의 목표카메라 모드에서 스냅샷을 찍습니다.
- 처리 모드에서 스냅샷을 엽니다.
- 토굴 깊이를 측정하려면 2D뷰에서 그래픽 탭에서 선 도구를 선택합니다. 20개의 잘 지향적인 토굴에 대해 이 작업을 반복합니다(추가그림1).
- 융모 높이를 측정하려면 2D뷰에서 그래픽 탭에서 선 도구를 선택합니다. 20 개의 잘 지향적인 융모에 대해이 작업을 반복하십시오 (추가그림1).
- 측정 뷰를 2D 뷰에서 측정 뷰로 전환하여 측정값을 표시합니다.
- 측정값을 내보내고 토굴 깊이와 융모 높이의 평균을 계산합니다.
5. 면역화학에 의한 BrdU 정량화(증식)
- BrdU 용액의 주입
- 마우스의 체중을 계량하고 기록합니다.
- 연기 후드에서, 인산염 완충식식염수(PBS)에서 0.5% w/v 브로모데옥시우리딘(BrdU) 용액의 대표적인 양을 준비한다.
- 연기 후드에 복강 내 주사로 BrdU 50 mg/kg을 주입하십시오.
참고 : 각 마우스가 BrdU 주입 후 정확히 150 분 에서 안락사되도록하려면 조직 수집을 적절하게 수행하기 위해 10-20 분 간격으로 연속적으로 각 개별 마우스를 주입하십시오. - 주입 시간을 기록합니다.
- 150분 간 기다린 다음 마우스를 마취시키고 단계 2.1-2.7에 기재된 바와 같이 조직을 수집한다. 섹션 5.2에 기재된 대로 BrdU 면역화학을 수행합니다.
- BrdU 면역화학
- 단계 3.1.1-3.3.4에 기재된 바와 같이 조직을 준비한다.
- 항원 검색의 경우, 유리 조직학 항아리에 섹션이있는 슬라이드 크래들 (slide cradle)을 놓고 전자 레인지에 EDTA 버퍼 (pH 9)를 750 W에서 1 분 동안 채우고 350 W. 반복 주기에서 9 분.
참고 : 가열 사이에 항아리에 더 많은 버퍼를 추가해야 할 수있는 조직이 건조하지 않도록하십시오. - 트리스 버퍼링 식염수 및 폴리소르베이트 20(TBS-T) 버퍼에서 각각 3분동안 2-3회 세척합니다.
- 내생 과산화 물과산화물 활성을 차단하기 위해 실온에서 10-15 분 동안 과산화수소 블록 (재료 표) 5 방울을 적용하십시오. TBS-T 버퍼에서 2-3회 세척하여 각각 3분씩 세척합니다.
- 설치류 블록 버퍼 (재료표) 5 방울을 실온에서 30 분 동안 적용하여 비 특이적 결합을 차단하십시오. TBS-T 버퍼에서 2-3회 세척하여 각각 3분씩 세척합니다.
- 단클론 마우스 항-BrdU 항체로 단면 절편을 배양하여 실온에서 1시간 동안 1:500을 희석하였다. TBS-T 버퍼에서 2-3회 세척하여 각각 3분씩 세척합니다.
- 각 슬라이드에 고추냉이 과산화아제 5 방울을 바르고 실온에서 15 분 동안 배양하여 3,3'-다미노 벤지딘 (DAB)을 사용하여 면역 세포성을 시각화하십시오. 섹션을 연기 후드로 옮기고 DAB 150 μL을 넣고 5 분 동안 배양하십시오.
참고: DAB를 취급할 때는 항상 장갑을 착용하고 폐기물을 적절히 폐기하십시오. - 탈이온수에서 절제된 부분을 헹구어 보냅니다.
- 3.4.6 단계 및 3.4.7 단계에 설명된 대로 조직을 탈수하고 커버슬립을 장착한다.
- 면역 반응의 시각화
- 카메라에 연결된 가벼운 현미경으로 조직 샘플을 시각화합니다.
- 분석 소프트웨어를 사용하여 모든 섹션의 20배 목표를 사용하여 현미경 이미지를 얻고 에 파일을 저장합니다. JPG 형식입니다.
- ImageJ 소프트웨어의 교정 도구로 사용되는 20x 대점을 사용하여 스테이지 마이크로미터의 스냅샷을 찍습니다.
- BrdU 면역 반응성 세포의 면적 측정
- ImageJ 소프트웨어설치 (재료 표).
- ImageJ의 이미지에 축척 할당: ImageJ 파일을 사용하여 스테이지 마이크로미터 이미지 열기 | 메뉴 명령을 엽니다. 직선 선택 도구를 선택합니다.
- 직선 도구를 선택하고 마이크로미터 이미지에 직선을 그려 알려진 거리를 정의합니다.
- 분석 메뉴에서 배율 설정을 선택합니다.
- 알려진 거리 상자에 값을 입력하고 길이 단위 상자에서 길이 단위를 정의합니다. 이 보정이 이 ImageJ 세션에서 열리는 모든 이미지에 적용되도록 전역을 선택합니다.
- ImageJ 파일을 사용하여 관심 있는 이미지를 엽니다 | 열림 메뉴 명령은 크립토당 BrdU 면역 반응성 세포의 면적을 측정합니다.
- 이미지/유형 메뉴에서 색상 그래픽을 8비트로 설정합니다.
- 프로세스/대비 향상에서 이미지의 대비를 늘리고 채도가 낮은 픽셀을 0.4%로 설정합니다.
- 면역편성을 분할하기 위해 이미지에 임계값을 적용합니다. 메뉴 에서 이미지/조정을 선택한 다음 임계값을 선택하고 빨간색(빨간색으로 표시된 어두운 영역)을 선택합니다. 임계값 막대를 이동하여 약 10-20%의 임계값을 선택합니다.
참고: 가능한 한 적은 배경을 가진 모든 BrdU 양성 셀을 포함하는 임계값을 선택합니다. 선택한 백분율은 모든 섹션에 적용되어야 합니다. - 잘 지향하는 지하실, 즉 손상되지 않은 조직에서 완전한 토굴을 선택하고 자유 손 선택 도구를 선택하여 주변 영역을 표시합니다.
- 임계값 영역을 측정하려면 분석 탭을 선택한 다음 파티클분석합니다. 파티클 분석 창에서 크기를 20-무한대로설정하고 상자 픽셀단위를 클릭하고 원형을 0.00-1.00으로설정하고 윤곽선으로 표시를 설정합니다. 클릭 상자 표시결과, 요약및 구멍 포함.
참고: BrdU 양성 셀의 값은 결과 창에서 자동으로 생성되어 각 BrdU 양성 셀에 대한 개별 측정값을 보여 주어집니다. 또한 요약 창이 자동으로 생성되어 BrdU 양성 셀이 있는 개수, 총 면적, 평균 크기 및 면적 의 백분율을 표시합니다. - 5.4.10 단계와 5.4.11 단계를 반복하여 새 토굴을 측정합니다. 측정된 모든 토굴의 결과가 요약 창에 표시됩니다.
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Representative Results
첫 번째 실험에서, 우리는 0일째에 마우스에서 점막염을 유도하고 5일 연속으로 매일 마우스 그룹을 희생하였다. SI 중량을 측정할 때, 우리는 이 파라미터가 2일째부터 4일째까지 감소하여 장세포 질량의 손실을 시사한다는 것을 발견했습니다. 우리는 또한 5일째에, SI 체중이 0일째(미처리 마우스)와유의한 다르지 않다는 것을 발견하였다(도 1). BrdU의 혼입에 의해 측정된 증식은 1일째와 2일째에 거의 폐지되었지만, 4일째와 5일째에는 각각 약 4배및 5배의 증식이 있었습니다(그림 2). 이러한 과확산은 또한 토굴 깊이를 측정할 때 예시되었다(도 3). 토굴 깊이를 측정하여 설명되지 않는 것은 1일째와 2일째에 증식세포의 손실이며, 여기서 토굴 깊이는 약 13% 감소되었지만 건강한 마우스와 크게 다르지 않았다. 우리는 점막염의 재생 단계에서 BrdU 통합과 토굴 깊이 사이에 강한 상관 관계가 있음을 보여줄 수 있지만, 이것은 종점으로 의 토굴 깊이가 급성 단계에서 적합하지 않을 수 있음을 나타내는 급성 단계에 포함되지 않았다 점막염 (그림4).
두 번째 연구에서는, 우리는 부족한 L 세포 분비를 가진 우리의 형질전환 마우스 모형에 있는 mucostis를 검토했습니다. 결핍된 GLP-1 및 GLP-2를 가진 마우스는 회복 단계에서 체중(BW)의 심각한 감소 및 SI 체중의 감소를 보였으며, 이는 야생형(WT) 5-FU 마우스(p< 0.01)에 비해 매우 유의하였다(도5A,B). 더욱이, 형질전환 마우스는 보상과확산을 보여주지 못하였다; WT 마우스와 건강한 대조군 모두에 비해 훨씬 짧습니다. 이와는 반대로 WT 마우스는 과식증의 징후로서토굴 깊이의 증가를 보였다(도 5C).
그림 1: 소장 무게. 마우스는 0일째에 5-FU 주사 후 1~5일 희생되었고 장 무게를 기재한 대로 측정하였다. 결과는 평균 ±표준 오차(SEM)로 나타내고 있다. n = 13. 이 그림은 하이팅-안드레아센 외16에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: SI의 십이지장, 제주눔 및 장막에 대한 토굴당 BrdU 면역양성 세포. 마우스는 0일째에 5-FU 주사 후 1~5일 희생되었고, BrdU 혼입은 기재된 바와 같이 면역히스토화학에 의해 정량화되었다. 결과는 평균 ±SEM. n = 13으로 나타내었다. *p< 0.05, ***p&0.001 일차(분산 분석 [ANOVA] 다음에 Dunnett 다중 비교 테스트). p< 0.001 일 0에 비해 (ANOVA 다음 던넷 다중 비교 테스트). 이 그림은 하이팅-안드레아센 외16에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 토굴 깊이 측정. 마우스는 0일째에 5-FU 주사 후 1~5일 희생되었고, 토굴 깊이는 설명된 바와 같이 측정하였다. 결과는 평균 ±SEM. n = 13으로 나타내었다. *p< 0.05, ***p&0.001 일차(ANOVA 다음에 Dunnett 다중 비교 테스트). 이 그림은 하이팅-안드레아센 외16에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 토굴 깊이와 BrdU의 상관 관계입니다. 십분위자 깊이(십이지장, 제주넘 및 ileum)는 두 꼬리 Pearson 상관 테스트를 사용하여 희생의 날마다 BrdU 통합과 상관관계가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: GLP-1 및 GLP-2 결핍 마우스는 급성 점막염 후에 재생되지못합니다. (A) BW (%),(B)SI 중량 (g) 및 (C) 지하실 깊이 (μm)의 변화. 결과는 평균 ±SEM. Tg=형질전환 마우스로 나타내었다; WT = 야생형 마우스; 5-FU = 5-플루오로라실. n = 4-8. * p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001 건강한 대조군 (WT 식염수) 비교, a = p < 0.05, aa = p < 0.01, aa = p < 0.001 WT 5-FU에 비해 (양방향 ANOVA 다음) 다중 비교 테스트 [BW] 테스트 중). 이 그림은 하이팅-안드레아센 외16에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1 : 점막염의 유도 전에 소장 조직, 급성 단계 및 점막염의 회복 단계동안. (a) 해모톡실린 및 에오신(H&E) 염색 및 (D) 치료되지 않은 마우스에서 BrdU 염색. 패널 A의 검은색 점선은 잘 지향적인 토굴을 예시하는 반면 점선 녹색 선은 잘 지향적인 융모를 보여 줍니다. (B) H&E 염색 및 (E) 점막염의 급성기 동안 BrdU 염색. (C) H&E 염색 및 (F) BrdU 점막염 유도 후 회복 단계 동안 염색. 배율 막대 = 100 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서, 우리는 마우스 모델에서 SI 부상 및 재생을 연구하기 위해 널리 접근 가능한 방법을 입증한다. 장 손상의 다양한 전임상 동물 모델이 존재하지만, 각 모델이 고유하고 끝점이 연구 질문에 대답하는 것이 적절해야 한다는 것을 이해하는 것이 중요합니다. 이 모델은 부상에 대한 적응 반응을 연구하는 것이 우수하지만 점막염의 전 임상 모델로 모델을 사용할 때 끝점을 수정해야합니다. 그러나 동물 모델에서 환자로의 번역은23에도전적입니다. SI 중량 및 증식의 우리의 제안된 종점은 적응 반응의 연구로만 제한되어야 합니다. 내인성 요인의 연구는 수시로 형질전환 마우스의 사용을 요구하고, 마우스 1에서 작은창자 절제술이 가능하더라도, 이 모형은 수술 후 사망을 피하기 위하여 대안일 수 있었습니다. 이 모델을 형질전환 마우스에 적용할 때, 쥐를 주의 깊게 관찰하고 매일 그들의 무게를 감시하는 것이 중요합니다. 이 연구 기간 동안, 마우스의 일부 최대 체중 감소를 경험 30%, 이는 매우 상당한. 민감한 표현형에서 높은 사망률을 피하기 위해, 우리는 형질 전환 마우스에서 파일럿 연구를 수행하는 것이 좋습니다, 용량 조정이 필요할 수 있기 때문에.
설명된 방법 내에서 중요한 단계는 SI의 제거 및 계량입니다. 제거 및 처리는 큰 분석 결과 변이를 피하기 위하여 매번 동일한 연구자에 의해 수행되는 것이 중요합니다.
토굴 깊이와 융모 높이를 측정할 때 분산과 바이어스를 피하기 위해 토굴 및 융모 선택의 일관성이 중요합니다. 파라핀에 조직을 포함시킬 때, 내장은 가로 절단을 만들기 위해 똑바로 놓인 위치에 위치하여 손상되지 않은 융모와 토굴의 가능성을 증가시킴입니다. 조직을 절단 한 후, 잘 지향적 인 토굴 및 / 또는 융모가 선택됩니다. 선택은 동일한 평면의 전체 토굴 및 융모의 전체 시각화와 토굴 및 융모 내의 셀의 명확한 테두리의 존재를 기반으로합니다. 이 방법에 대한 제한은 조직을 절단 한 후 잘 지향 된 토굴 및 / 또는 융모의 선택이 이루어지기 때문에 잘 지향적 인 토굴을 선택할 때 다소 주관적인 접근 방식입니다. 이전 연구24는 미세 해부를 사용하는 이 한계를 극복하기 위한 대체 방법을 제시했습니다. 이 방법에서는, 융모와 토굴은 현미경의 밑에 관찰하는 동안 선택됩니다, 조직이 절단되기 전에, 따라서 손상되지 않은 토굴 및 융모가 조직에서 해부되고 있다는 것을 확인하는 가능하게 하.
BrdU 양성 세포(25,26)를양량하는 데 사용되는 이전 방법과는 달리,이 프로토콜은 각 토굴 내에서 증식 세포를 정량화하는 빠른 방법을 제공하는 토굴 당 BrdU 양성 세포의 영역을 설명합니다. 그러나 이 기술은 이 기술의 측정을 위해 제안된 소프트웨어에 대한 보다 심오한 지식이 필요하기 때문에 다소 제한적일 수 있습니다. 이 프로토콜의 향후 응용은 BrdU 양성 세포를 정량화하고 측정하는 보다 자동 생성된 방법을 만드는 것일 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 기본 신진 대사 연구를위한 노보 노디스크 센터와 룬드벡 재단의 무제한 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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