Integrering af visuelle psykofysiske assays i en Y-labyrint for at isolere den rolle, som visuelle funktioner spiller i navigationsbeslutninger

Summary

Her præsenterer vi en protokol for at demonstrere en adfærdsmæssig analyse, der kvantificerer, hvordan alternative visuelle funktioner, såsom bevægelses signaler, påvirker retningsbestemte beslutninger i fisk. Repræsentative data præsenteres for hastigheden og nøjagtigheden, hvor Golden Shiner (Notemigonus crysoleucas) følger virtuelle fiske bevægelser.

Abstract

Kollektiv dyrs adfærd opstår fra individuelle motivationer og sociale interaktioner, der er afgørende for individuel fitness. Fisk har længe inspireret undersøgelser i kollektive bevægelse, specifikt, deres evne til at integrere miljømæssige og sociale oplysninger på tværs af økologiske sammenhænge. Denne demonstration illustrerer teknikker, der anvendes til at kvantificere adfærdsmæssige responser af fisk, i dette tilfælde Golden Shiner (Notemigonus crysoleucas), til visuelle stimuli ved hjælp af computer visualisering og digital billedanalyse. Nylige fremskridt i computer visualisering giver mulighed for empirisk testning i laboratoriet, hvor visuelle funktioner kan styres og fint manipuleres for at isolere mekanismerne i sociale interaktioner. Formålet med denne metode er at isolere visuelle funktioner, der kan påvirke den enkeltes retningsbestemte beslutninger, uanset om de er ensomme eller med grupper. Denne protokol indeholder specifikke oplysninger om det fysiske Y-labyrint domæne, optagelsesudstyr, indstillinger og kalibreringer af projektoren og animationen, eksperimentelle trin og dataanalyser. Disse teknikker viser, at computer animation kan fremkalde biologisk meningsfulde svar. Desuden er de teknikker er let at tilpasse til at teste alternative hypoteser, domæner, og arter for en bred vifte af eksperimentelle applikationer. Brugen af virtuelle stimuli giver mulighed for reduktion og udskiftning af antallet af levende dyr, der kræves, og dermed reducerer laboratorie omkostninger.

Denne demonstration tester hypotesen om, at små relative forskelle i bevægelses hastighederne (2 krops længder pr. sekund) af virtuelle conspecificer vil forbedre hastigheden og nøjagtigheden, hvormed shiners følger de retningsbestemte signaler, der leveres af den virtuelle Silhuetter. Resultater viser, at shiners retningsbestemte beslutninger er væsentligt påvirket af stigninger i hastigheden af de visuelle signaler, selv i nærværelse af baggrundsstøj (67% billed kohærens). I mangel af nogen bevægelse cues, valgte deres retninger tilfældigt. Forholdet mellem beslutning hastighed og cue hastighed var variabel og stigninger i cue hastighed havde en beskedent uforholdsmæssig indflydelse på retningsbestemt nøjagtighed.

Introduction

Dyrene fornemmer og fortolker deres levesteder kontinuerligt for at træffe informerede beslutninger, når de interagerer med andre og navigerer i støjende omgivelser. Enkeltpersoner kan forbedre deres situationsbevidsthed og beslutningstagning ved at integrere sociale oplysninger i deres handlinger. Sociale oplysninger, men, i vid udstrækning stammer fra følgeslutning gennem utilsigtede signaler (dvs. pludselige manøvrer for at undgå en rovdyr), som kan være upålidelige, snarere end gennem direkte signaler, der har udviklet sig til at kommunikere specifikke budskaber (f. eks. den waggle dans i honningbier)¹. Identificering af, hvordan enkeltpersoner hurtigt vurderer værdien af sociale signaler eller sensoriske oplysninger, kan være en udfordrende opgave for undersøgere, især når enkeltpersoner rejser i grupper. Vision spiller en vigtig rolle i at styre sociale interaktioner^2,3,4 og undersøgelser har udledt de interaktions netværk, der kan opstå i fiskeskoler baseret på hver enkelt persons synsfelt^{5, 6}. Fiskeskoler er dynamiske systemer, men gør det vanskeligt at isolere individuelle svar på bestemte funktioner, eller nabo adfærd, på grund af de iboende collineariteter og forstyrrende faktorer, der opstår som følge af samspillet mellem gruppens medlemmer. Formålet med denne protokol er at supplere det nuværende arbejde ved at isolere, hvordan alternative visuelle funktioner kan påvirke de retningsbestemte beslutninger af enkeltpersoner, der rejser alene eller i grupper.

Fordelen ved den nuværende protokol er at kombinere en manipulerende eksperiment med computer visualisering teknikker til at isolere de elementære visuelle funktioner en person kan opleve i naturen. Specifikt, Y-labyrint (figur 1) bruges til at skjule retningsbestemt valg til en binær reaktion og introducere Computeranimerede billeder designet til at efterligne svømning adfærd virtuelle naboer. Disse billeder er projiceret op fra neden for labyrinten til at efterligne silhuetterne af condetaljerne svømning under et eller flere. De visuelle egenskaber af disse silhuetter, såsom deres morfologi, hastighed, sammenhæng og svømning adfærd er let skræddersyet til at teste alternative hypoteser⁷.

Dette papir demonstrerer nytten af denne tilgang ved at isolere, hvordan individer af en model sociale fiskearter, den gyldne Shiner (Notemigonus crysoleucas), reagere på den relative hastighed virtuelle naboer. Protokollen fokus, her, er på, om den retningsbestemte indflydelse af virtuelle naboer ændre med deres hastighed og, hvis ja, kvantificere form af det observerede forhold. Især er den retningsbestemte cue genereret ved at have en fast andel af silhuetterne fungere som ledere og bevæge sig ballisistisk mod en arm eller en anden. De resterende silhuetter fungerer som distraktorer ved at bevæge sig tilfældigt for at give baggrundsstøj, der kan justeres ved at justere Leader/distraktor forholdet. Forholdet mellem ledere til distraktorer fanger sammenhængen i de retningsbestemte signaler og kan justeres i overensstemmelse hermed. Distraktor silhuetter forbliver begrænset til beslutningsområdet ("DA", figur 1a) ved at have silhuetterne reflekterer ud af grænsen. Leader silhuetter, dog, får lov til at forlade DA regionen og indtaste deres udpegede arm, før langsomt falmer væk, når silhuetterne krydser 1/3 længden af armen. Som ledere forlader DA, nye leder silhuetter tage deres plads og spore deres nøjagtige vej for at sikre, at lederen/distraktoren forholdet forbliver konstant i DA hele eksperimentet.

Brugen af virtuelle fisk giver mulighed for kontrol af de visuelle sensoriske oplysninger, mens overvågning af retningsbestemt respons af emnet, som kan afsløre nye funktioner i social navigation, bevægelse, eller beslutningstagning i grupper. Den fremgangsmåde, der anvendes her, kan anvendes på en bred vifte af spørgsmål, såsom virkningerne af subletale stress eller prædation på sociale interaktioner, ved at manipulere computer animation til at producere adfærdsmæssige mønstre af varierende kompleksitet.

Protocol

Alle forsøgsprotokoller blev godkendt af det institutionelle dyrepleje-og anvendelses udvalg under miljø laboratoriet, US Army Engineer og Research and Development Center, Vicksburg, MS, USA (IACUC # 2013-3284-01).

1. sensorisk labyrint design

1. Udfør eksperimentet i en vandtæt poly methylmethacrylat Y-labyrint platform (lavet in-House) sæt på toppen af en gennemsigtig støtteplatform i et dedikeret rum. Her platformen er 1,9 cm tyk og understøttes af 4 7,62 cm stråler af ekstruderet aluminium, der er 1,3 m i bredden, 1,3 m i længden, og 0,19 m i højden.
2. Konstruere bedriften og beslutningsområderne til at være identiske i byggeriet (figur 1a). Her, Y-labyrint arme er 46 cm i længden, 23 cm i bredden, og 20 cm i dybden med en central beslutning område ca 46 cm i diameter.
3. Overholde hvid projekt-gennem teater skærm i bunden af Y-labyrinten for projicere visuelle stimuli ind i domænet.
4. Coat siderne af Y-labyrinten med hvid vinyl for at begrænse eksterne visuelle stimuli.
5. Installer en fjernstyret Clear Gate (via klar Monofilament) for at opdele Holding området fra det centrale beslutningsområde for at frigive emner til labyrinten efter akklikalering.
6. Placer yderligere persienner for at forhindre fiskene i at se lys, boliger og udstyr, såsom lysblokerende persienner, der når gulvet i dørkarme for at minimere lyseffekter og skygge bevægelser fra det udvendige rum eller gangen.

2. kontrolapparat

1. Vælg en overhead kamera (sort og hvid) baseret på den kontrast, der er nødvendig mellem baggrundsbilleder, virtuel fisk og emne fisk.
2. Installer en overhead kamera til at optage labyrinten ovenfra og til at registrere opførsel af fiskene og de visuelle fremskrivninger.
   1. Til denne demonstration skal du bruge b/w Gigabyte Ethernet (GigE)-kameraer, så 9 m IP-kabler blev tilsluttet en computer med et 1 GB Ethernet-kort i et kontrolrum.
3. Tilslut kameraet til en computer i et tilstødende rum, hvor observatøren kan fjernstyre porten, visuelle stimuli program, og kamera optagelse software.
4. Sørg for, at kameraets indstillinger er ved prøveudtagning og frekvens hastigheder, der forhindrer flimrende effekter, som opstår, når kameraet og softwaren er ude af fase med rummet lys.
   1. Kontroller den elektriske frekvens af lokationen; forskyde kameraets samplingfrekvens (billeder pr. sekund, FPS) for at forhindre flimren ved at multiplicere eller dividere VEKSELSTRØMS frekvensen med et helt tal.
5. Indstil kameraets indstillinger, så billedets klarhed optimeres ved hjælp af softwaren og computeren for at visualisere de relevante funktionsmåder.
   1. Til denne demonstration udføres prøveudtagning ved 30 fps med en rumlig opløsning på 1280 pixels x 1024 pixels.

3. Kalibrer indstillinger for belysning, projektor og kamera

1. Installer fire overhead track belysningssystemer langs væggene i forsøgsrummet.
2. Installer justerbare kontrol afbrydere, så lysene giver større fleksibilitet til at opnå det korrekte rum omgivende lys.
3. Placer lysene for at undgå refleksioner på labyrinten (figur 1b).
4. Fastgør en kort kast (ST) projektor til den nederste kant af Labyrintens støttestruktur (figur 1c).
   1. Vælg projektion opløsning (sat til 1440 pixels x 900 pixels for denne demonstration).
5. Justér omgivende lysniveauer, der er skabt af ovenlys og projektor, så de passer til lysforholdene i motiverne (her sat til 134 ± 5 lux under demonstrations eksperimentet, hvilket svarer til naturlig belysning på en overskyet dag).
   1. Lås eller marker placeringen af lysdæmper kontakten for lethed og konsistens under eksperimentelle forsøg.
6. Brug et kamera fremviserprogram til at konfigurere kameraet (erne) til at styre eksponerings tilstand, Gain og hvidbalance kontrol.
   1. I denne demonstration skal du indstille Pylon-fremviseren til "kontinuerlig optagelse", 8000 μs eksponeringstid, 0 Gain og 96 hvidbalance, som giver kontrol over videooptagelsen.

4. Kalibrer visuel projektion program: baggrund

1. Projicer en homogen baggrund op på bunden af labyrinten og måle enhver lys forvrængning fra projektoren. Her blev baggrunden skabt ved hjælp af Processing (v. 3), som er en Tractable og veldokumenteret platform til at oprette tilpassede visualiseringer til videnskabelige projekter (https://Processing.org/examples/).
   1. Opret et program, der vil køre et behandlings vindue til at blive projiceret på bunden af labyrinten. Tilpasning af baggrundsfarven i vinduet sker med kommandoen baggrund, som accepterer en RGB-farvekode. Flere små eksempler programmer findes i behandlingen tutorials (https://Processing.org/Tutorials/).
   2. Brug baggrundsfarve programmet til at kalibrere projektoren og de eksterne lysforhold.
2. Mål enhver lysforvrængning, som er oprettet af projektoren ved hjælp af et billedbehandlingsprogram, for at identificere eventuelle afvigelser fra den forventede homogene baggrund, som er oprettet. Følgende trin gælder for brug af ImageJ (v. 1.52 h; https://ImageJ.NIH.gov/IJ/).
   1. Fang et stillbillede af den oplyste Y-labyrint med en ensartet baggrundsfarve, og Åbn i ImageJ.
   2. Ved hjælp af det lige, segmenterede eller frihåndslinje værktøj tegnes en lige lodret linje fra den lyseste placering i midten af hotspottet til toppen af Y-labyrinten (figur 2a).
   3. Vælg afbildnings profil i menuen Analysér for at oprette en graf over gråskala værdier kontra afstand i pixel.
   4. Gem pixeldata som en kommasepareret fil (filtypenavnet. csv), der består af en indekskolonne og en pixelværdi kolonne.
3. Juster projektionsområdet med labyrinten (figur 2b) og modellere enhver uønsket lysforvrængning for at reducere enhver farveforvrængning, der kan være skabt af projektoren (figur 2c). I det følgende skitseres de trin, der er taget i den aktuelle demonstration.
   1. Importer datafilen ImageJ pixel intensitet ved hjælp af den relevante tabulatorsepareret læsefunktion (f. eks. read_csv fra bl-pakken for at læse i kommaseparerede filer).
   2. Variabiliteten i lysintensitet beregnes på tværs af prøve transect, såsom med en variationskoefficient, for at tilvejebringe en reference for det niveau af forvrængning, der er skabt i baggrunden.
   3. Transformér de rå pixelværdier for at afspejle en relativ ændring i intensitet fra lyseste til dimmest, hvor den mindste pixel intensitet vil nærme sig den ønskede baggrundsfarve værdi valgt i billedprogrammet.
   4. Plot de omdanne pixel intensitet værdier begynder ved den lyseste del af anomalien generelt giver en rådnende tendens i intensitet værdier som en funktion af afstanden fra kilden. Brug ikke-lineære mindste kvadrater (Function NLS) til at estimere de parameterværdier, der passer bedst til dataene (her en Gaussian henfalds funktion).
4. Opret tælleren gradient ved hjælp af samme program, der er vedtaget for at generere baggrunden Counter billede (behandling v. 3) for at reducere enhver farveforvrængning, som kan være skabt af projektoren ved hjælp af R (v. 3.5.1).
   NOTER: gradient funktionen genererer en række koncentriske cirkler centreret på det lyseste sted i billedet, der ændrer i pixel intensitet som en funktion af afstanden fra midten. Farven på hver ring defineres ved at fratrække den ændring i pixel intensitet, som modellen forudsiger, fra baggrundsfarven. Tilsvarende øges ring radius også med afstand fra kilden. Den bedste pasform model bør reducere, hvis ikke fjerne, enhver pixel intensitet på tværs af gradient til at give en baggrund ensartethed.
   1. Opret en Gaussian gradient () ved hjælp af den visuelle stimulus program ved at justere de nødvendige parametre.
      1. Parameter a påvirker lysstyrken/mørket i det gaussia-distributions forløb. Jo højere værdi, jo mørkere gradient.
      2. Parameter b påvirker farveforløbets varians. Jo større værdi, jo bredere gradient vil strække sig før nivellering ud til den ønskede baggrund pixel intensitet, c.
      3. Parameter c indstiller den ønskede baggrundspixel intensitet. Jo større værdi, jo mørkere baggrund.
   2. Gem billedet i en mappe ved hjælp af funktionen Saveframe , så et fast baggrundsbillede kan uploades under eksperimenterne for at minimere hukommelses belastningen ved gengivelse af stimuli under et eksperimentelt forsøg.
   3. Kør baggrunds generatorprogrammet igen, og Undersøg resultaterne visuelt, som vist i figur 2c. Gentag trin 4,3 for at kvantificere eventuelle observerede forbedringer med hensyn til at reducere graden af variabilitet i lysintensitet på tværs af prøve transect.
5. Empirisk justerer belysnings niveauerne, model parametrene eller den afstand, der er dækket af transect (f. eks. den udvendige radius af tælleren gradient) for at foretage yderligere manuelle justeringer, indtil RGB-værdierne i akklikalerings zonen svarer til beslutningsområdet. Model parametrene i denne test var: a = 215, b = 800 og c = 4.
6. Føj det endelige filter til programmet eksperiment visuel stimuli.

5. Kalibrer visuel projektion program: visuelle stimuli

Bemærk: rendering og animere de visuelle stimuli kan også gøres i behandling ved hjælp af trinene nedenfor som guider sammen med platformens tutorials. En skematisk af det nuværende programlogik er angivet i (figur 3) og yderligere detaljer kan findes i lemasson et al. (2018)⁷. Følgende trin indeholder eksempler på de kalibreringstrin, der er taget i det aktuelle eksperiment.

1. Åbn det visuelle projektions program Vfish. PDE for at centrere projektionen inden for Labyrintens beslutningsområde (figur 1a), og Kalibrer de visuelle projektioner baseret på de hypoteser, der testes (f. eks. kalibrere silhuetterne på størrelse og hastighed, så de passer til forsøgspersonerne). Kalibreringer er hånd indstillede i hovedprogrammets header (Vfish. PDE) ved hjælp af forhånds valgte fejlfindingsflag. I fejlfindingstilstand (DEBUG = TRUE) trinvist gennem hvert DEBUGGING_LEVEL_ # flag (tal 0-2) for at foretage de nødvendige justeringer
   1. Indstil flaget DEBUGGING_LEVEL_0 til ' true ', og Kør programmet ved at trykke på afspilningsikonet i tegningsvinduet. Ændre x-og y-positions værdierne (henholdsvis domæne parametrene DX og dy), indtil projektionen er centreret.
   2. Indstil DEBUGGING_LEVEL_1 til ' true ' for at skalere størrelsen på fiske silhuetten (gengivet som en ellipse). Kør programmet, og Juster i gentagne bredde (eW) og længde (eL) af ellipsen, indtil det svarer til den gennemsnitlige størrelse af testpersonerne. Derefter indstilles DEBUGGING_LEVEL_2 til ' true ' for at justere den grundlæggende hastighed af silhuetterne (SS).
   3. Angiv DEBUG = FALSE for at afslutte fejlfindingstilstand.
2. Kontrollér, at distraktor silhuetter fortsat er afgrænset til Beslutningsområdet (DA, figur 1a), at Leader-silhuet forløbskurver er korrekt justeret med begge arme, og at Leader/distraktor forholdet i da forbliver konstant.
3. Trin gennem programmets GUI for at sikre funktionaliteten af mulighederne.
4. Kontroller, at data bliver korrekt skrevet ud til fil.
5. Sørg for, at optagelses softwaren kan spore emnet fisk med visuelle fremskrivninger på plads. Trin til at spore fisk er tidligere blevet beskrevet i Kaidanovich-Berlin et al. (2011)⁸, Holcomb et al. (2014)⁹, Way et al. (2016)¹⁰ og Zhang et al. (2018)¹¹.

6. tilberedning af dyr

1. Vælg emne arter baseret på forskning spørgsmål og ansøgning, herunder køn, alder, genotype. Tildel forsøgspersonerne til forsøgs holdningstankene og Registrer biometriske database line (f. eks. kropslængde og-masse).
2. Sæt miljøforholdene i labyrinten i forhold til Holding systemets. Vandkvalitet betingelser for baseline eksperimenter med adfærd er ofte holdt på optimal for arterne og for den eksperimentelle domæne opsætning.
   1. I denne demonstration skal du bruge følgende betingelser: 12 h lys/12 h mørk cyklus, overhead flimmer-fri halogenlamper sat til 134 ± 5 Lux, 22 ± 0,3 °C, 97,4 ± 1,3% opløst ilt, og pH på 7,8 ± 0,1.
3. Habituate dyrene ved at overføre dem til domænet for op til 30 min pr. dag i 5 dage uden de computer-genererede visuelle stimuli (f. eks fisk silhuetter) før starten af eksperimentelle forsøg.
4. Sørg for, at emnet fisk på det tidspunkt er valgt, tildelt, vejet, målt og overført til eksperimentelle tanke.
   Bemærk: her, gyldne shiners standard længde og våd vægt var 63,4 ± 3,5 mm SL og 1,8 ± 0,3 g WW, hhv.
5. Brug en vand-til-vandoverførsel, når du flytter fisk mellem tanke og labyrinten for at reducere stress fra håndtering og luft eksponering.
6. Udfør eksperimenter i en regulær, fast lys cyklus, der afspejler motiverne ' naturlige biologiske rytme. Dette gør det muligt for emnerne at blive fodret i slutningen af hver dags eksperimentelle forsøg for at begrænse fordøjelsen virkninger på adfærd.

7. eksperimentel procedure

1. Tænd for værelse projektor og LED lys track systemer til forudbestemt niveau af lysstyrke (i denne demonstration 134 ± 5 lux) gør det muligt for pærer til at varme (ca. 10 minutter).
2. Åbn kamera fremviser programmet og indlæse indstillingerne for blænde, farve og optagelse gemt fra setup for at sikre den bedste kvalitet video kan opnås.
   1. Åbn Pylon-fremviseren, og aktivér det kamera, der skal bruges til optagelse.
   2. Vælg Indlæs funktioner i kameraets rullemenu, og Naviger til mappen gemte kameraindstillinger.
   3. Åbn de gemte indstillinger (her mærket som camerasettings_20181001) for at sikre videokvalitet og klik på kontinuerlig shot.
   4. Luk Pylon-fremviseren.
3. Åbn Visual Projection program Vfish. PDE og kontrollere, at projektion forbliver centreret i labyrinten, at DataOut mappen er tom, og at programmet fungerer som forventet
   1. Kontroller, at kalibrerings ringen er centreret i DA ved hjælp af trin 5.1.1.
   2. Åbn mappen DataOut for at sikre, at den er tom for dagen.
   3. Kør Visual stimuli program ved at trykke på Play i skitse vinduet af Vfish. PDE og bruge dummy variabler for at sikre programmets funktionalitet.
      1. Indtast fiske-id-nummer (1-16), tryk på Enter, og bekræft derefter valget ved at trykke på Y eller N for ja eller nej.
      2. Indtast gruppe størrelse (fast her på 1) og Bekræft valg.
      3. Indtast den ønskede silhuet hastighed (0-10 BL/s), og bekræft valget.
      4. Tryk på Enter for at flytte forbi akklimatiserings perioden og kontrollere projektionen af den virtuelle fisk i beslutningsområdet.
      5. Tryk på pause for at sætte programmet på pause, og Indtast dukkens resultat valg, dvs venstre (1) eller højre (2).
      6. Tryk på stop for at afslutte programmet og skrive dataene ud til filen.
   4. Kontroller, at data er korrekt skrevet til fil i DataOut mappe og log filen som en testkørsel i Lab noter, før fiskene er placeret i domænet for akkliation.
4. Brug klokkeslæt og et stopur til at logge start-og stoptidspunkter for prøveversionen i lab-notesbog for at supplere de forløbne tider, der senere kan udvindes fra videoafspilning på grund af den korte varighed af nogle replikat forsøg.
5. Gennemføre en vand ændring (f. eks. 30%) ved hjælp af Holding systemet sumpvand før overførsel af et emne til labyrinten.
6. Bekræft, at vandkvaliteten er den samme mellem labyrinten og holde systemet, og kontrollér, at lågen fungerer, for at sikre, at den glider jævnt til lige over vandhøjden.
7. Ved hjælp af den forudbestemte eksperimentelle tidsplan, som har randomiseret genstand-behandling eksponeringer i løbet af eksperimentet, skal du indtaste de værdier, der er valgt for det aktuelle prøveabonnement (stopper ved akklimatiserings skærmen, trin 7.3.3.1-7.3.3.3).
   1. Optag behandlings kombinationdata i laboratorie notesbogen.
8. Overfør emnet til Y-Maze Holding-området i en 10-minutters akklikalerings periode.
9. Start videooptagelsen, og tryk derefter på Returtasten i vfish. PDE-vinduet i slutningen af akklikalationsperioden. Dette vil starte de visuelle projektioner.
10. Når den virtuelle fisk vises i domænet, log uret tid, og løft holde porten (figur 4a).
11. Afslut forsøget, når 50% af legemets krop bevæger sig ind i en valg arm (figur 4b), eller når den angivne tidsperiode forløber (f. eks. 5 min.).
    1. Log klokkeslæt, start-og stoptider fra stopur, og emnerne ' valg (dvs. venstre (1), højre (2), eller intet valg (0)).
    2. Stop videooptagelsen og tryk pause i Visual stimuli program, som vil bede brugeren om Trial udfald data (arm nummer valgt eller en 0 for at indikere, at der ikke er foretaget noget valg). Når du bekræfter udvælgelsen, vil programmet vende tilbage til det første skærmbillede og afvente de værdier, som forventes for det næste eksperimentelle forsøg.
12. Saml emnet og returnere det til den respektive bedrift tank. Gentag trin 7.7-7.13 for hvert forsøg.
13. Ved afslutningen af en session (AM eller PM) Tryk på stop i programmet, når den sidste fisk i sessionen har truffet en beslutning. Tryk på stop vil skrive sessionens data ud til fil.
14. Gentag vandudvekslingen ved afslutningen af morgen sessionen for at sikre vandkvaliteten stabilitet.
15. Efter den sidste retssag af dagen, gennemgå lab notesbog og gøre eventuelle nødvendige noter.
    1. Tryk stop i Visual stimuli program til at output de indsamlede data til dataout mappe, efter den sidste retssag af dagen.
16. Bekræft antallet, navnet og placeringen af de datafiler, som visualiserings programmet har gemt.
17. Log vandkvalitet, sammen med lys niveauer i labyrinten værelse til at sammenligne med morgen indstillingerne. Placer beluftning systemet og varmeapparater i Y-labyrinten.
18. Sluk projektoren og den eksperimentelle rumsporings belysning.
19. Foder fisk den forudberegnede daglige ration.

8. data analyse

1. Sørg for, at forsøgsdataene indeholder de nødvendige variabler (f. eks. dato, prøveversion, emne-id, arm udvalgt af programmet, testede visuelle faktorer, emne valg, start-og stoptidspunkter og kommentarer).
2. Check for eventuelle optagelsesfejl (human eller program induceret).
3. Tabulere respons og kontrollere for tegn på eventuelle retningsbestemte bias på den del af emnerne (f. eks binomial test på arm valg i kontroltilstand)⁷.
4. Når eksperimentet er konstrueret ved hjælp af gentagne målinger på de samme individer, som i tilfældet her, anbefales det at anvende modeller med blandede effekter.

Representative Results

Hypotese og design

For at demonstrere nytten af dette eksperimentelle system testede vi hypotesen om, at den nøjagtighed, hvormed Golden Shiner følger en visuel cue vil forbedre med hastigheden af denne cue. Wild type gylden Shiner blev brugt (N = 16, krops LÆNGDER, bl, og våd vægte, WW, var 63,4 ± 3,5 mm og 1,8 ± 0,3 g, respektfuldt). Sammenhængen mellem de visuelle stimuli (Leader/distraktor ratio) blev fastsat til 0,67, mens vi manipulerede den hastighed, hvormed vores bevægelses signaler (dvs. lederne) flyttede med hensyn til deres distraktorer. Hastigheds niveauerne for Leader-silhuetterne, der giver retningsbestemte stikord, varierede fra 0-10 BL/s (i intervaller på 2), som spænder over den række af hastigheder, som typisk anses for at afspejle vedvarende, langvarige eller burst-svømme former for aktivitet i fisk¹². På kontrolniveau, 0, var Leader-silhuetterne orienteret mod en destinations arm blandt de tilfældigt orienterede distraktorer, men ingen af silhuetterne bevægede sig. Destinations armen blev valgt tilfældigt for hvert forsøg af programmet. Afstandsenheder er i kropslængde, som blev defineret af den gennemsnitlige standard længde af vores, og tiden er i sekunder. Den aktuelle repræsentative analyse fokuserer på måling af primære responsvariabler (beslutnings hastighed og nøjagtighed), men eksperimentets design gør det også muligt for undersøgere at udtrække yderligere oplysninger ved at spore emne bevægelser og analysere deres Kinematik.

Vores fiske emner blev opstaldet efter afsnit 6 i protokollen. Hvert emne blev udsat for et niveau af behandlingen pr. dag. Vi randomiserede både inden for emne behandling niveau (cue hastighed) på tværs af dage og den rækkefølge, som blev testet på hver dag. Lineære og generelle lineære blandingseffekter modeller (henholdsvis LMM og GLMM) blev brugt til at teste virkningerne af Leader Silhouette hastighed på den hastighed og nøjagtighed, hvormed forsøgspersonerne fulgte de visuelle stimuli. Emne-id blev inkluderet som den tilfældige effekt i begge modeller.

Data og resultater

I mangel af nogen bevægelse cues gyldne Shiner fungerede som forventet og valgte deres retning tilfældigt (stimulus hastighed = 0, binomial test, n_venstre= 33, n_højre= 40, = 0,45, P = 0,483). Mens de fleste viste ingen tegn på stressende adfærd inden for domænet og truffet en afgørende beslutning inden for den tildelte tid (5 min), 22% af de viste en modvilje mod at forlade bedriften område eller komme ind i beslutningsområdet. Data fra disse ubeslutsomme fisk indgik ikke i analysen. De resterende 78% af vores viste en signifikant forbedring i den nøjagtighed, hvormed de fulgte de retningsbestemte stimuli, da hastigheden af disse stimuli steg (GLMM, z = 1,937, P = 0,053). Figur 5a viser karakteren af dette forhold, hvor vi finder en 1,2-fold stigning i retningsbestemt nøjagtighed for hver stigning i stimulus hastighed niveau. Dette forhold er kun beskedent uforholdsmæssigt og er ikke i sig selv udtryk for en tærskel reaktion på ændringer i cue-hastigheden. Stigninger i stimulans hastigheden medførte også en signifikant stigning i beslutnings hastigheden (LMM, F_{1, 56}= 4,774, P = 0,033). Men som det fremgår af figur 5b , var tendensen i beslutnings hastigheden inkonsekvent og meget variabel på tværs af stimulerings hastighedniveauerne. Hvad der er tydeligt i disse beslutning hastighed data er, at det tog emner, i gennemsnit, hvor som helst fra 5-20x længere at træffe deres beslutning, når stimuli bevægede sig, end da de ikke var (beslutning hastigheder på 4,6 ± 2,3 s og 81,4 ± 74,7 s for stimulus hastigheder på henholdsvis 0 og 8, ± standardafvigelse, SD). Faktisk, uden kontrolniveau fandt vi ingen væsentlig ændring i beslutningsprocessen hastighed som en funktion af stimulus hastighed.

Figur 1. Y-Maze domæne. A. billede af Y-Maze-apparatet til beslutnings test. Anmærkninger repræsenterer følgende: Holding område (HA, grøn), beslutningsområde (DA, blå), venstre beslutnings arm (LDA) og højre beslutnings arm (RDA). B. billede af Y-labyrinten og rummet med overhead justerbar track belysning og GigE kamera placering (kun en af de fire generalomkostninger lys strimler er synlige). C. billede af Y-labyrinten (sidevisning), herunder projektorens placering, som er låst af glide vognen for at eliminere bevægelser under eller mellem forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Baggrund og stimulus kalibrering. A. billede af den oplyste Y-labyrint med en ensartet baggrundsfarve og en pixel intensitet transect (grøn linje) mellem Holding området og beslutningsområdet, da (gennemsnitlig pixel intensitet 112 ± 1278). Den lysgradient, der genereres af projektorens pære (hotspot), er tydeligt synlig. B. billede, der viser justeringen af fremskrivningerne med da. C. billede af labyrinten med den filtrerede baggrund og en ensom silhuet projiceret i midten af da til kalibrering (størrelse, hastighed). Tilføjelsen af tælleren gradient baggrund i (C) resulterer i en mørkere baggrund (gennemsnitlig pixel intensitet 143,1 ± 5,5) og langt mindre rumlig variabilitet (variationskoefficient falder fra 11,4 (A.) til 0,03 (C.). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Skematisk af den generelle strøm af operationer i visualiserings programmet, der anvendes i forsøgene. For yderligere proceduremæssige detaljer se⁷. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Eksperimentel retssag med både ægte og virtuelle fisk silhuetter. A. billede a (levende) gylden Shiner, der forlader Holding området (grøn cirkel). B. billede af en (levende) gylden Shiner i beslutningsområdet (grøn cirkel) blandt de virtuelle fisk silhuetter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Nøjagtighed og hastighed af retningsbestemte responser på ændringer i bevægelses stikord relative hastighed. A. graf af fisk beslutning nøjagtighed med hvilken gyldne Shiner fulgte ' Leader ' silhuetter plottet mod stimulus hastighed (bl/s). B. graf overfiske beslutningen hastighed plottet mod stimulus hastighed (bl/s). Data er betyder ± standardfejl, SE. grupper på 15 virtuelle silhuetter blev tilfældigt fordelt i hele beslutnings zonen med et 67% sammenhængende niveau (10 af de 15 silhuetter fungerede som ledere, de resterende 5 silhuetter fungerede som distraktorer), og vi varierede hastigheden af lederne fra 0-10 BL/s. Distraktor hastigheden forblev fast ved 1 BL/s ved alle hastighedsniveauer, bortset fra den kontrol, hvor ingen af silhuetterne bevægede sig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Visuelle signaler er kendt for at udløse en optomotor respons i fisk udsat for sort og hvid riste¹³ og der er stigende teoretiske og empiriske beviser for, at nabo hastighed spiller en indflydelsesrig rolle i at styre de dynamiske interaktioner observeret i fiskeskoler^{7,14,15,16,17}. Kontrasterende hypoteser findes for at forklare, hvordan individer i grupper integrerer nabo bevægelser, såsom at reagere proportionalt på alle mærkbare tegn¹⁴, vedtage en bevægelses tærskel respons¹⁷eller overvåge kollisions tider ¹⁸. et første skridt i afprøvningen af disse alternative hypoteser er at validere deres underliggende antagelser. Her demonstrerede vi nytten af vores protokol i at identificere den rolle, som en bestemt sensorisk funktion kan have på at vejlede retningsbestemte beslutninger.

Vi isolerede hvordan individer af en social fiskeart, Golden Shiner, reagerede på ændringer i den relative hastighed af visuelle stimuli designet til at efterligne conspecificitet i en skole. Gyldne Shiner retningsbestemt nøjagtighed blev forbedret med stigninger i den relative hastighed af de visuelle stimuli, men det funktionelle forhold mellem disse variabler var kun marginalt uforholdsmæssig. Forholdet mellem beslutnings hastigheden og stimulans hastigheden var meget varierende og inkonsekvent, mens den var betydelig. Resultaterne viser imidlertid, at en hastighedsforskel, der findes i billeder spredt på tværs af synsfeltet af disse fisk spiller en vigtig rolle i at udløse et svar og vejlede deres åbenlys opmærksomhed. Drilleri fra hinanden, hvordan enkeltpersoner vælger blandt handlinger af specifikke naboer kunne blive probed med det nuværende design ved at indføre modstridende retninger i stimuli.

I et nyligt eksperiment med Zebrafish, Danio rerio, fandt vi ingen tegn på ubeslutsomhed i ensomme forsøg⁷, men Golden Shiner i denne demonstration viste en større modvilje mod at forlade Holding området. Forskellene mellem disse to arter kan forklares ved deres livshistorie strategier og den relative styrke af deres sociale tendenser (eller afhængighed). Zebrafish synes at vise mere variabel social sammenhæng end gyldne shiners (f. eks, fakultative vs. forpligte skolefolk³). Det er sandsynligt, at den stærkere sociale sammenhæng i Golden Shiner kan have bidraget til emner, der viser højere niveauer af generthed, eller tøven inden for domænet end deres Zebra modparter.

Rækkefølgen af trinene er subtil endnu kritisk i protokollen. Processen med at afbalancere lysene, projektoren og program filteret kan tage mere tid, end det ofte forventes for nye domæner. I denne protokol er der blevet taget hensyn til de indhøstede erfaringer for at reducere tiden for opsætning og lysbalance, såsom brug af spor lygter, som reflekterer væggen (ikke på domænet), justerbare lysstyringer og program genererede filtre til projektoren. Overvej også, at hvad der kan synes at være visuelt acceptabelt for det menneskelige øje vil ikke blive set af kameraet og software på samme måde, således at dine lysforhold kan kræve yderligere justeringer. Selv små ændringer i skærmvinkler vil resultere i baggrunds gradient ændringer. Således vil detaljerede notat tage og gemme fil indstillinger i høj grad reducere sandsynligheden for ændringer, der opstår under eksperimentet. Bevæger sig gennem processen fra fysisk til filtrering, som præsenteres her, giver de hurtigste trin til succes.

Brugen af en ST-projektor giver større rumlig fleksibilitet over en skærm, men denne tilgang skaber en uønsket visuel anomali kaldet et "Hotspot". Et hotspot er et lyst sted på projektionsoverfladen skabt af nærheden af projektorens pære. I protokollen, afsnit 4 var dedikeret til skabelsen af baggrunds filtre og kontrol for homogene lyn på tværs af domænet. De trin, der gives her, vil hjælpe brugerne med at undgå eller minimere de uønskede virkninger af hotspottet ved at modellere enhver uønsket gradient og bruge modellen til at reproducere et omvendt forløb for at imødegå effekterne. Endelig kan ST projektor modellen variere, men billedjusteringer (Roter, flip, forreste eller bageste skærm projektion) og trapezkorrektion (± 3-5 grader) er nyttige funktioner til at sikre, at Desire billedet passer til domænet og kan justeres for forvrængning.

Over tid, de eksperimentelle værelser blev opdateret for lethed ved ændringer i hardware (dvs. kameraer, kabler, grafikkort, skærme). Det er bemærkelsesværdigt at nævne, at hardwareændringer sandsynligvis vil resultere i yderligere opstart tid til at afbalancere belysning og arbejde gennem alle potentielle programproblemer. Derfor anbefales det, at enhver hardware er dedikeret til et system, indtil afslutningen af de ønskede eksperimenter. De fleste udfordringer har været knyttet til præstationsforskelle mellem skærme, grafikkort og kameraer, hvilket nogle gange har medført ændring af programmeringskoden. Siden tidspunktet for dette arbejde er der udviklet nye domæner, hvor det indre testdomæne kan fjernes og skiftes til andre testdomæner. Vi anbefaler, at denne fleksibilitet tages i betragtning ved udformningen af forsøgs domæner og støttestrukturer.

Den nuværende protokol gør det muligt for undersøgere at isolere og manipulere visuelle funktioner på en måde, der både afspejler det visuelle miljø, der forventes inden for en skole, samtidig med at de kontrollerer for forstyrrende faktorer, som ledsager eksponering for ægte konspecificitet (f. eks. , sult, fortrolighed, aggression)⁷. Generelt, computer animation (ca) af virtuelle fisk (dvs., silhuetter) er en praksis, der bliver mere almindeligt sted på grund af sine forskellige fordele i at stimulere adfærdsmæssige svar^19,20,21. CA tillader en at tilpasse visuelle signaler (retning, hastighed, sammenhæng, eller morfologi), samtidig med at indføre et niveau af standardisering og repeterbarhed i den ønskede stimulus, der overstiger, hvad der kan opnås, når du bruger levende dyr som stimulans. Brugen af Virtual Reality i adfærdsmæssige undersøgelser, på både dyr²² og mennesker²³, er også støt stigende og lover at blive en kraftfuld empirisk værktøj som teknologien bliver mere tilgængelig og Tractable. Tilsammen, disse virtuelle tilgange også erstatte og reducere de levende dyr krav Dyreetik inden for videnskab (f. eks IACUC, AAALAC, og ACURO)²⁴, samtidig med samtidig sænke laboratorie omkostninger og byrder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black and white IP camera	Noldus, Leesburg, VA, USA		https://www.noldus.com/
Extruded aluminum	80/20 Inc., Columbia City, IN, USA	3030-S	https://www.8020.net 3.00" X 3.00" Smooth T-Slotted Profile, Eight Open T-Slots
Finfish Starter with Vpak, 1.5 mm extruded pellets	Zeigler Bros. Inc., Gardners, PA, USA		http://www.zeiglerfeed.com/
Golden shiners	Saul Minnow Farm, AR, USA		http://saulminnow.com/
ImageJ (v 1.52h) freeware	National Institute for Health (NIH), USA		https://imagej.nih.gov/ij/
LED track lighting	Lithonia Lightening, Conyers, GA, USA	BR20MW-M4	https://lithonia.acuitybrands.com/residential-track
Oracle 651 white cut vinyl	651Vinyl, Louisville, KY, USA	651-010M-12:5ft	http://www.651vinyl.com. Can order various sizes.
PowerLite 570 overhead projector	Epson, Long Beach CA, USA	V11H605020	https://epson.com/For-Work/Projectors/Classroom/PowerLite-570-XGA-3LCD-Projector/p/V11H605020
Processing (v 3) freeware	Processing Foundation		https://processing.org/
R (3.5.1) freeware	The R Project for Statistical Computing		https://www.r-project.org/
Ultra-white 360 theater screen	Alternative Screen Solutions, Clinton, MI, USA	1950	https://www.gooscreen.com. Must call for special cut size
Z-Hab system	Pentair Aquatic Ecosystems, Apopka, FL, USA		https://pentairaes.com/. Call for details and sizing.