Summary
Questo protocollo presenta un metodo per la decellularizzazione e la successiva formazione di idrogel di cuscinetti di grasso mammari a seguito di irradiazione ex vivo.
Abstract
La radiazione è una terapia per pazienti con carcinoma mammario triplo negativo. L'effetto della radiazione sulla matrice extracellulare (ECM) del tessuto mammario sano e il suo ruolo nella ricorrenza locale nel sito tumorale primario sono sconosciuti. Qui presentiamo un metodo per la decellularizzazione, la linfafazione e la fabbricazione di idrogel ECM derivati da cuscinetti di grasso mammari murno. I risultati sono presentati sull'efficacia del processo di decellularizzazione e sono stati valutati i parametri reologici. Le cellule del cancro al seno etichettate GFP e luciferasi incapsulate negli idrogel hanno dimostrato un aumento della proliferazione degli idrogel irradiati. Infine, la colorazione coniugata phalloidin è stata impiegata per visualizzare l'organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali incapsulate. Il nostro obiettivo è quello di presentare un metodo per la fabbricazione di idrogel per lo studio in vitro che imitano l'ambiente del tessuto mammario in vivo e la sua risposta alle radiazioni al fine di studiare il comportamento delle cellule tumorali.
Introduction
Il cancro è caratterizzato da un'eccessiva proliferazione di cellule che possono eludere l'apoptosi e anche metastasi a siti distanti1. Il cancro al seno è una delle forme più comuni tra le femmine negli Stati Uniti, con una stima di 266.000 nuovi casi e 40.000 decessi nel 20182. Un sottotipo particolarmente aggressivo e difficile da trattare è il cancro al seno triplo negativo (TNBC), che manca di recettore estrogeno (ER), recettore progesterone (PR), e fattore di crescita epidermica umana (HER2). La radioterapia è comunemente usata nel cancro al seno per eliminare le cellule tumorali residue dopo la lumpectomia, ma oltre il 13% dei pazienti TNBC sperimenta ancora recidiva nel sito tumorale primario3.
È noto che la radioterapia è efficace nel mitigare la metastasi e la recidiva perché la combinazione di lumpectomia e radiazione si traduce nella stessa sopravvivenza a lungo termine della mastectomia4. Tuttavia, recentemente è stato dimostrato che il trattamento delle radiazioni è associato alla ricorrenza locale al sito tumorale primario in impostazioni immunocompromesse5,6. Inoltre, è ben noto che la radiazione cambia la matrice extracellulare (ECM) del tessuto normale inducendo la fibrosi7. Pertanto, è importante comprendere il ruolo dei cambiamenti ECM indotti dalle radiazioni nella dettatura del comportamento delle cellule tumorali.
I tessuti decellularizzati sono stati utilizzati come modelli in vitro per studiare la malattia8,9. Questi tessuti decellularizzati conservano la composizione ECM e riassumono il complesso ECM in vivo. Questo tessuto decellularizzato ECM può essere ulteriormente elaborato e digerito per formare idrogel ECM ricostituiti che possono essere utilizzati per studiare la crescita cellulare e la funzione10,11. Ad esempio, gli idrogel iniettabili derivati dalla lipoaspirate umana decellularizzato e dal tessuto miocardico servivano come metodi non invasivi di ingegneria tissutale, e un idrogel derivato dal tessuto polmonare porcina è stato utilizzato come metodo in vitro di test pignoramento e vitalità delle cellule staminali mesenchymiche12,13,14. L'effetto dei normali danni da radiazioni tissutali sulle proprietà ECM, tuttavia, non è stato studiato.
Gli idrogel derivati dall'ECM hanno il più grande potenziale di studio in vitro dei fenomeni in vivo. Sono stati studiati diversi altri materiali, tra cui collagene, fibrina e matrigel, ma è difficile riassumere sinteticamente la composizione dell'ECM13. Un vantaggio dell'utilizzo di idrogel derivati da ECM è che l'ECM contiene le proteine e i fattori di crescita necessari per un particolare tessuto14,15. L'irradiazione del tessuto normale durante la lumpectomia provoca cambiamenti significativi all'ECM, e gli idrogel derivati da ECM possono essere utilizzati per studiare questo effetto in vitro. Questo metodo potrebbe portare a modelli di malattia più complessi e più accurati.
In questo studio, abbiamo sottoposto i cuscinetti a grasso mammario murino (MFP) alle radiazioni ex vivo. Le Unità multifunzione sono state decellularizzate e trasformate in soluzione pre-gel. Gli idrogel sono stati formati con cellule 4T1 incorporate, una linea cellulare Murine TNBC. Sono state esaminate le proprietà reologiche del materiale idrogel e sono state valutate le dinamiche delle cellule tumorali all'interno degli idrogel. Gli idrogel fabbricati da MFP irradiati hanno migliorato la proliferazione delle cellule tumorali. Studi futuri incorporeranno altri tipi di cellule per studiare le interazioni cellula-cellula nel contesto della recidiva del cancro dopo la terapia.
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Protocol
Gli studi sugli animali sono stati effettuati in conformità con le linee guida istituzionali e i protocolli approvati dal Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Preparazione ed irradiazione ex vivo di MFP
- Sacrificare i topi atimici Nu/Nu (8-10 settimane) usando l'asfissia di CO2 seguita dalla lussazione cervicale.
- Pulire la pelle con 70% di etanolo.
- Raccogliere pastiglie di grasso mammaria (MFP) da topi sacrificati utilizzando forbici pre-sterilizzate e pinze in un tubo conico da 15 mL contenente supporti RPMI completi (RPMI integrati con 1% penicillina-streptomicina e 10% siero bovino fetale) (vedi la Tabella dei Materiali) ).
- Irradiare campioni a 20 Gy utilizzando una fonte di cesio.
- Portate le Unità multifunzione irradiate e i supporti RPMI completi in un armadietto della biosicurezza. Il supporto dipenderà dalla linea cellulare da coltivare nell'idrogel finale. Riempire i piatti di 6 cm o 10 cm con supporti sufficienti per sommergere le unità multifunzione. Per piatti 6 cm, utilizzare 8 mL di supporti, e per 10 cm piatti, utilizzare 20 mL di supporti.
- Incubare in un incubatore di CO2 a 37 gradi centigradi per due giorni. Il periodo di tempo nell'incubatrice può essere regolato.
- Risciacquare i tessuti in salina (PBS), in umido l'umidità in eccesso e posizionare gli MFP in tubi conici da 15 mL per l'immagazzinamento a -80 gradi fino alla decellularizzazione. Questa fase di congelamento aiuta la fase di decellularizzazione e il campione deve essere congelato anche se i prossimi passi sono altrimenti pronti.
2. Decellularizzazione (adattata dai riferimenti12,16,17)
NOTA: Questa procedura è stata adattata da metodi precedentemente pubblicati incentrati sulla decellularizzazione adiposa, che includeva il deossicholato di sodio detergente ionico piuttosto che il solfato di dodecyl di sodio per rimuovere il DNA in modo efficiente12,16 , 17.
- Il primogiorno, rimuovere le temperature a temperature più elevate congelate a -80 gradi centigradi e scongelare a temperatura ambiente.
- Una volta scongelato, secco mFP brevemente su una delicata pulizia del compito. Pesare le unità multifunzione utilizzando una scala analitica.
- Utilizzando un paio di pinze con forbici o un bisturi, dividere il tessuto in 3 mm x 3 mm x 3 mm per 3 mm per lo studio dell'ECM intatto e del tessuto rimanente per la produzione di idrogel.
NOTA: Il numero di campioni dipende dal numero di metodi di test, ad esempio la raccolta di due campioni è descritta di seguito: uno per l'incorporamento della paraffina (passaggio 2.5) e uno per il congelamento in un mezzo di incorporamento criostatico, se lo si desidera (vedere la Tabella dei materiali e il punto 2.6). - Pesare i tessuti. Se si incorpora in paraffina per sezionare, continuare con il passaggio 2.5. Se si blocca nel mezzo di incorporamento criostat per il sezionamento, continuare con il passaggio 2.6.
- In un cofano chimico, immergere il tessuto in formalina tampocapitale neutra al 10% (NBF) (vedi la tabella dei materiali) per 24 h a 4 gradi centigradi. Lavare 3 volte in PBS per 5 min ciascuno. Immergere il tessuto nel 30% di saccarosio per 48 h a 4 gradi centigradi.
- Pesare il tessuto ora che questo pezzo è stato rimosso. Continuare con il passaggio 2.6.
- In un cofano chimico, posizionare i pezzi MFP in una cassetta etichettata preparata con mezzo di incorporamento criostat. Aggiungere più mezzo di incorporamento criostato per coprire il tessuto.
- Collocare la cassetta in un bicchiere di 2 metilbutane (vedi la tabella deimateriali) pre-raffreddato con azoto liquido. Il becher dovrebbe avere abbastanza 2-metilbutane per coprire il fondo, ma non abbastanza per immergere la cassetta perché il mezzo di incorporamento criostat non dovrebbe toccare il 2-metilbutane. Lasciare che la cassetta si sieda nel 2-metilbutane fino a quando il criostat incorporante mezzo congela e diventa opaco.
- Avvolgere le cassette in lamina, etichettare e lasciare a -80 gradi centigradi fino a quando non viene utilizzato per la sezionamento.
NOTA: I tessuti posizionati immediatamente nel mezzo di incorporamento criostato sono stati sezionati a 5 m, mentre i tessuti incubati nel saccarosio sono stati sezionati a 30 m per mantenere la morfologia degli adipociti.
- Utilizzare le pinze per massaggiare manualmente il tessuto rimanente.
NOTA: I pezzi di tessuto possono anche essere collocati in 10% NBF per 24-48 h, sciacquati in PBS e lasciati nel 70% di etanolo fino all'incorporamento in paraffina. Dopo l'incorporamento, è possibile utilizzare 5 sezioni di m per la colorazione ematossia (H & E) (vedere la sezione 7 più avanti). - Mettere le MFP in piatti da 6 cm con una soluzione EDTA da 5 mL 0,02% trypsin/0,05%. Incubare a 37 gradi centigradi per 1 h. Spruzzare i piatti con il 70% di etanolo prima di essere collocati nell'incubatrice.
- Utilizzare i colino da 0,7 mm per lavare gli MFP con acqua deionizzata (DI) versando acqua sul tessuto tre volte. Utilizzare le pinze per massaggiare manualmente il tessuto tra i fusi.
- Tessuto brevemente asciutto su un compito delicato pulire e pesare. Posizionare i tessuti in un becher pre-autoclaved contenente una barra di agitazione di dimensioni appropriate. Coprire i tessuti con 60 mL del 3% t-octylphenoxypolyethanodhanol (vedi la tabella deimateriali) per 1 g di tessuto e mescolare per 1 h a temperatura ambiente. Utilizzare un minimo di 20 mL.
- Dump di tessuto e contenuto in un colino. Sciacquare il becher con acqua DI e versare sui tessuti. Ripetere altre due volte. Utilizzare le pinze per massaggiare manualmente il tessuto tra i risciacquo.
- Tessuto brevemente asciutto su un compito delicato pulire e pesare. Posizionare i tessuti e agitare le barre nello stesso becher e coprire con 60 mL di 4% di acido deossicolico per 1 g di tessuto. Mescolare per 1 ora a temperatura ambiente. Utilizzare un minimo di 20 mL.
- Dump tessuto e contenuto in un colino mesh. Sciacquare il becher con acqua DI e versare sui tessuti. Ripetere altre due volte. Utilizzare le pinze per massaggiare manualmente il tessuto tra i risciacquo.
- Tessuto brevemente asciutto su un compito delicato pulire e pesare.
- Posizionare i tessuti nello stesso becher con acqua DI fresca integrata con 1% penicillina-streptomicina. Coprire bene con pellicola di paraffina. Lasciare peruna per una notte a 4 gradi centigradi.
- Lavare colino e becher per l'uso il giorno successivo.
- Il giorno2, scolare il contenuto del becher in un colino. Tessuto brevemente asciutto su un compito delicato pulire e pesare.
- Posizionare le unità multifunzione nello stesso becher con una barra di agitazione di dimensioni appropriate. Coprire con 60 mL 4% etanolo/0,1% soluzione di acido peracetico per 1 g di tessuto. Utilizzare un minimo di 20 mL. Mescolare per 2 ore a temperatura ambiente.
- Scaricare tessuti e contenuti in un colino da 0,7 mm. Utilizzare le pinze per massaggiare manualmente il tessuto. Rimettere il contenuto nel bicchiere. Lavare il tessuto coprendolo con 60 mL di 1x PBS per 1 g di tessuto. Utilizzare un minimo di 20 mL. Mescolare per 15 min a temperatura ambiente. Ripetere una volta.
- Scaricare tessuti e contenuti in un colino da 0,7 mm. Utilizzare le pinze per massaggiare manualmente il tessuto. Rimettere i contenuti in becher. Lavare il tessuto coprendolo con 60 mL di acqua DI per 1 g di tessuto. Utilizzare un minimo di 20 mL. Mescolare per 15 min a temperatura ambiente. Ripetere una volta.
- Tessuto brevemente asciutto su un compito delicato pulire e pesare. Dump di tessuto e contenuto in un colino. Utilizzare le pinze per massaggiare manualmente il tessuto.
- Rimettere i contenuti in becher. Coprire i tessuti con 60 mL di 100% n-propanol per 1 g di tessuto. Utilizzare un minimo di 20 mL. Mescolare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Tessuto brevemente asciutto su un compito delicato pulire e pesare. Scaricare tessuti e contenuti in un colino da 0,7 mm. Utilizzare le pinze per massaggiare manualmente il tessuto.
- Rimettere i contenuti in becher. Lavare il tessuto coprendolo con 60 mL di acqua DI per 1 g di tessuto. Utilizzare un minimo di 20 mL. Mescolare per 15 min a temperatura ambiente. Ripetere tre volte.
- Dump di tessuto e contenuto in un colino. Ripetere i passaggi da 2,3 a 2,6 per raccogliere pezzi di tessuto per l'incubazione del saccarosio e il congelamento nel mezzo di incorporamento criostato.
- Tessuto brevemente asciutto su un compito delicato pulire e pesare. Mettere in un tubo da 15 mL etichettato. Congelare a -80 gradi durante la notte.
3. La liofilizzazione
- Togliere i tubi da 15 mL da -80 gradi centigradi e metterli sul ghiaccio secco. Conservare i campioni congelati sul ghiaccio secco fino al liofilizzatore.
- Rimuovere i tappi. Utilizzare un elastico per attaccare una delicata pulizia del compito sulla parte superiore per coprire l'apertura. Mettere i campioni sul lyophilizer per almeno 2 giorni.
- Rimuovere i campioni dal liofilizzatore e posizionare i tubi sul ghiaccio secco. Rimuovere le delicate salviette di attività pesare ogni campione su una scala analitica. Attaccare i tappi e posizionarli a -80 gradi durante la notte.
4. Fresatura
- Riempire un contenitore poco profondo con azoto liquido. Togliere i campioni dal congelatore -80 . Pesare ogni MFP lofilfato.
- Mettere un campione nel mortaio. Utilizzare un guanto criogenico per tenere il mortaio nell'azoto liquido.
- Utilizzare un pestello attaccato a un trapano portatile per fresare il campione. Mulino a intervalli di 1 min per controllare i progressi e rimuovere la mano guantata dall'azoto liquido. Mulino per un minimo di 5 min.
- Ripetere l'operazione per tutti i campioni. Spruzzare e pulire il mortaio e pestello con etanolo tra ogni campione.
- Conservare i campioni in polvere in tubi da 15 mL a -80 gradi centigradi fino a quando non sono pronti per l'uso.
NOTA: I campioni possono essere utilizzati immediatamente o conservati durante la notte.
5. Formazione idrogel
- Se conservato a -80 gradi durante la notte, rimuovere e scongelare a temperatura ambiente. Durante lo scongelamento, calcolare il peso necessario della pepsina (vedi Tabella deimateriali) e il volume di acido cloridrico (HCl) necessario per ogni campione che si traduce in una soluzione con 1% w/v polvere campione e 0.1% w/v pepsina in 0.01 M HCl. Aggiungere la pepsina all'HCl per formare una soluzione pepsina-HCl.
- Aggiungere la polvere campione e la soluzione pepsina-HCl a un tubo da 15 mL. Aggiungere una piccola barra di agitazione e mescolare per 48 h.
- Posizionare i tubi sul ghiaccio per 5 min. Calcolare il volume necessario di 10x PBS necessario per ogni campione che si traduce in una soluzione con una concentrazione di 1x PBS. Aggiungere il volume appropriato di 10x PBS ad ogni tubo.
- Aggiungere 10% v/v 0.1 M NaOH a ogni soluzione per raggiungere il pH 7.4. Utilizzare una carta pH per testare individualmente.
NOTA: La soluzione Gel può essere conservata a 4 gradi centigradi per una settimana.
6. Incapsulare le cellule in idrogel
- Utilizzo di celle con etichetta GFP e luciferasi
- Utilizzando la soluzione di gel pH 7.4, resospensione pelleted GFP- e luciferase-etichettato 4T1 cellule ad una concentrazione di 500,000 o 1.000.000 cellule/mL di soluzione gel. Aggiungete 16 - L di soluzione a celle gel in ogni pozzetto di uno scivolo a 16 pozzetto. Incubare per 30 min a 37 .
- Aggiungete 100 l di supporto RPMI completo ad ogni pozzo. Proseguire l'incubazione per 48 h a 37 gradi centigradi. Le cellule etichettate GFP e luciferasi possono essere visualizzate utilizzando la microscopia a fluorescenza a 0 ore, 24 ore e 48 ore dopo la gelazione.
NOTA: La proliferazione cellulare può essere misurata per le cellule 4T1 etichettate con GFP e luciferasi utilizzate qui aggiungendo (S)-4,4,5-Dihydro-2-(6-idrossiy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acido potassium sale (vedi Tabella dei materiali) ai pozzi per 10 min ed eseguire la risonanza conto della bioluminescenza utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza (cfr. Tabella dei materiali). Dopo l'imaging della bioluminescenza, il citoscheletro può essere visualizzato (vedi sezione 10).
- Utilizzo di celle senza etichetta
- Utilizzando la soluzione di gel pH 7.4, resuspend pelleted non etichettato 4T1 cellule ad una concentrazione di 500,000 o 1,000,000 cellule / mL di soluzione gel. Aggiungete 16 l di gel-cell ad ogni pozzetto di uno scivolo a 16 pozze tsiamo e di una piastra da 96 pozze. Incubare per 30 min a 37 .
- Aggiungere 100 l di supporti ad ogni pozzo. Proseguire l'incubazione per 48 h a 37 gradi centigradi.
NOTA: La vitalità delle celle può essere misurata (cfr. sezione 11). Il vetrino a camera 16-pozzo può essere utilizzato per l'imaging, e la piastra 96-po 'può essere utilizzato per la quantificazione.
7. Colorazione H & E
- Per il tessuto incorporato in formalina, con paraffina, sommersi diapositive contenenti il doppio di 5 sezioni m in 100% xilene (5-10 min) per la deparaffinazione. Reidratare immergendo in 100%, 95%, 85% e 70% etanolo per 5 min ciascuno seguito da acqua DI per 5 min.
- Per le sezioni di tessuto congelato, prendere le sezioni immediatamente dal congelatore e immergerle in 10% NBF per 10 min. Risciacquare in acqua per 5 min.
- Nuclei macchia con ematossitale per 3 min.
- Differenziare immergendo 1-2 volte nello 0,3% di alcol acido (0,3% HCl nel 70% di etanolo). Risciacquare in acqua corrente del rubinetto per 5 min.
- Aggiungere l'agente di fard per 30 s. Risciacquare in acqua corrente del rubinetto per 5 min.
- Incubare con eosina per 90 s a temperatura ambiente. Disidrata in 3 cambi di 100% etanolo per 5 min ciascuno.
- Immergere due volte in 100% xilene per 5 min ciascuno. Aggiungere il disticerificatore-plasticiser-xylene (supporto di montaggio DPX0 alla diapositiva e aggiungere un coperchio. Lasciare curare durante la notte prima dell'imaging.
8. 1-(4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naftaia
- Preparare la soluzione 1-([4-(Xylylazo)xylyl]-2-naphthol.
- Aggiungere 0,5 g di 1-([4-(Xylylazo)xylyl]-2-naphthol in polvere a un becher con 100 mL di glicole propilene. Riscaldare a 95-100 gradi centigradi mescolando per almeno 30 minuti. Evitare che la temperatura superi i 100 gradi centigradi.
- Togliere il becher dal fuoco e lasciare raffreddare leggermente. Versare la soluzione attraverso la carta da filtro qualitativa di grado 4 per rimuovere eventuali particelle residue.
NOTA: La soluzione può essere conservata a temperatura ambiente e deve essere filtrata attraverso un filtro di siringa di 0,45 m immediatamente prima della colorazione.
- Macchie sezioni di tessuto congelato.
- Togliere i vetrini dal congelatore a -80 gradi centigradi e asciugare l'aria per 30 min. Pre-cool 10% NBF a -20 gradi centigradi per 30 min in un barattolo Coplin. Fissare i vetrini a temperatura ambiente per 10 min. Lavare in acqua DI 3 volte per 5 min ciascuno.
- Rimuovere l'acqua in eccesso con una delicata pulizia del compito prima di immergersi nel glicole propilene 2 volte per 5 min ciascuno. Rimuovere i vetrini dal glicole propilene. Non risciacquare.
- Mettere i vetrini in siringa filtrata Olio Rosso O soluzione di colorazione per 3 h a temperatura ambiente.
- Differenziare mettendo i vetrini in glicole propilene 85% per 5 min.
- Campioni di macchie con ematossilina per 30 s. Lavare in acqua corrente del rubinetto per 5 min e quindi posizionare i vetrini in acqua DI.
- Montare campioni utilizzando un supporto di montaggio a base di acquoso e consentire ai supporti di asciugarsi durante la notte prima dell'imaging.
9. Reologia
- Portare soluzioni pre-gel dal punto 5.4 al reometro sul ghiaccio.
- Attaccare un braccio e una piastra da 25 mm al reometro. Aprire il software di reologia sul computer collegato al reometro.
- Eseguire la mappatura rotazionale e determinare lo spazio zero. Sollevare il braccio quando è completo.
- Pipette 500 l di pre-gel sulla piastra. Abbassare il braccio fino a quando la soluzione pre-gel occupa completamente lo spazio tra la piastra e il braccio. Essere conservativi perché abbassare il braccio oltre questo punto si tradurrà in soluzione pre-gel fuoriuscire dal lato.
- Eseguire una sweep di frequenza sulla soluzione pre-gel da 0,1 a 100 Hz dopo che è rimasta a 37 gradi centigradi per 30 min.
- Sollevare il braccio del reometro quando è completo. Pulire il liquido con una delicata pulizia dell'attività. Risciacquare con acqua DI e pulire con una delicata pulizia del compito. Ripetere i passaggi da 9.4 a 9.6 con campioni aggiuntivi.
10. Fagliidina coniugato colorazione di F-actin
- Portare la soluzione coniugata phalloidin a temperatura ambiente. Centrifuga brevemente a bassa velocità prima dell'apertura. Soluzione sufficiente per l'alleno, e conservare il resto a -20 gradi centigradi.
- Diluire la soluzione di riserva di phalloidin 1000x in una soluzione di lavoro 1x aggiungendo una soluzione stock da 1 mL a 1 x PBS - 1% di albumina di siero bovino (BSA). Questo rende abbastanza per 10 pozze (100 l/pozzetto).
NOTA: Si può usare il semplice 1x PBS, ma è preferibile che 1x PBS e BSA si chiedano di evitare che il coniugato di phalloidin si attacchi al tubo. Non conservare questa soluzione dopo il saggio. 1 -L di colorante fluorescente blu (vedi Tabella dei materiali) soluzione di lavoro può essere aggiunto alla macchia per i nuclei. La soluzione di lavoro può essere fatta mescolando 1 luna di 20 mM di coloranti fluorescenti blu con 11,3 l1 x PBS. - Aspirati supporti da pozzi (passaggio 6.1). Sciacquare i pozzi con 1x PBS.
- Aggiungere 10% NBF. Incubare pozzi con 10% NBF per 20 min a temperatura ambiente. Rimuovere supernatante. Lavare 3 volte con PBS per 5 min ogni volta.
- Aggiungere lo 0,1% t-Octylphenoxypolyetxyethanol in PBS per 5 min. Aspirate e lavare 3 volte con PBS per 5 min ogni volta.
- Aggiungere 100 l di soluzione di lavoro dal punto 10.2 a ogni pozzo. Incubare per 1 h a temperatura ambiente. Aspirare e lavare 3 volte con PBS per 5 min ogni volta. Lasciare in PBS a 4 gradi centigradi.
- Aspirare e rimuovere i pozzi dalla guarnizione sullo scivolo della camera. Utilizzare le pinzette del naso ad ago per rimuovere la guarnizione dal vetrino. Montare e coverslip campioni utilizzando un supporto di montaggio a base aqueoso. Lasciar curare (5 min).
- Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza all'emissione/emissione di 590/618 nm.
11. Saggio di fattibilità
- Sciacquare le celle con il PBS (DPBS) di Dulbecco. Aggiungete 100 l di DPBS per un valore di 1 calcio di calceinam AM e un omodimero di etidio da 2 M a ciascuno di essi. Incubare per 30 min a temperatura ambiente.
- Immagine dello scivolo a 16 camere di microscopia a fluorescenza. L'acetoxymethyl di calceina (calcein AM) può essere osservato a eccitazione/emissione : 494/517 nm. L'ethidium homodimer può essere osservato all'esmissione di 528/645 nm.
- Leggere la piastra 96-po su un lettore di piastra utilizzando le stesse lunghezze d'onda nel passaggio 11.2.
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Representative Results
Le Unità multifunzione sono state decellularizzate in seguito all'irradiazione mediante la procedura illustrata nella figura 1A. Vengono mostrati i PFP pre-decellularizzazione (Figura 1B) e post-decellularizzazione (Figura 1C). La decellularizzazione è stata confermata utilizzando la colorazione ematossilia ed eosina (H & E) e 1-([4-(Xylylazo)xylyl]-2-naphthol colorazione è stato utilizzato per valutare il contenuto lipidico (Figura 2). Le proprietà reologiche degli idrogel ECM sono state valutate anche a 37 gradi centigradi (Figura 3). Il modulo di stoccaggio era superiore al modulo di perdita per tutte le condizioni, dimostrando una formazione stabile di idrogel.
Le cellule di carcinoma mammario etichettate GFP e luciferasi sono state incapsulate negli idrogel. La proliferazione cellulare è stata esaminata mediante microscopia a fluorescenza, misurazioni della bioluminescenza e colorazione della vitalità 48 h dopo l'incapsulamento (Figura 4). Gli idrogel irradiati mostravano una tendenza crescente nella proliferazione delle cellule tumorali. Phalloidin coniugato è stato utilizzato per visualizzare F-actin nelle cellule incapsulate (Figura 5). Questa tecnica può essere utilizzata per esaminare la morfologia cellulare e le proprietà citoscheletriche.
Figura 1: flusso di lavoro sperimentale. (A) Schematica della formazione di idrogel. Sono state scattate immagini di telecamere digitali di MFP pre- (B) e post-decellularizzazione (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Conferma della decellularizzazione e de-lipidazione nelle unità multifunzione. La colorazione ematossina ed eosina (H & E) di MFP non irradiati incorporati in paraffina e sezionati a 5 m (A) è stata confrontata con gli MFP congelati nel mezzo di incorporazione criostatista (5 sezioni m) prima (B) e dopo la decellularizzazione (C), incubato con saccarosio prima del congelamento nel mezzo di incorporazione criostatta e sezionato a 30 m (D). 1-([4-(Xylylazo)xylyl]-2-naphthol colorazione è stato fatto per visualizzare la ritenzione di lipidi in MFP congelati in criostat incorporare mezzo (5 sezioni m) prima (E) e dopo la decellulare (F) e incubato con saccarosio prima di in criostat incorporante medio e sezionato a 30 sezioni m (G). Le barre della scala rappresentano 50 m. Decell - decellularizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Conferma della formazione di idrogel. La reologia è stata utilizzata per determinare il modulo di archiviazione e perdita del modulo di controllo (A) e la soluzione pre-gel irradiata (B) fatta con MFP a 37 e 0,5% di ceppo. Le barre di errore mostrano la deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Proliferazione delle cellule tumorali negli idrogel ECM irradiati. La proliferazione cellulare 4T1 48 h dopo l'inoculazione è mostrata con pre-gel derivato dal controllo (A) e irradiato (B) il segnale di bioluminescenza da 4T1 cellule incorporate all'interno del controllo e degli idrogel irradiati. Le cellule vive colorate di Calcein AM e le cellule morte colorate ethidium homodimer sono state valutate in controllo (D) e idrogel irradiati (E),e il rapporto vivo/morto è stato quantificato (F). Le barre della scala rappresentano 200 m. Le barre di errore mostrano un errore standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Proprietà citoscheletriche negli idrogel ECM. Le cellule all'interno del controllo (A) e gli idrogel ECM irradiati (B) sono macchiate di coniugato di phalloidin per visualizzare il colorante fluoreinoF (rosso) e blu per visualizzare i nuclei (blu) in MFP irradiati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Peso del tessuto (g) | controllo (0 Gy) |
Irradiati (20 Gy) |
| Peso MFP iniziale | 0,461 (in inglese) | 0,457 (in linguaggio da 1,05) |
| Peso MFP dopo la rimozione del campione di istologia | 0,423 (in via 0,423) | 0,416 (in inglese) |
| Peso MFP dopo la decellularizzazione | 0,025 (in via 0,025) | 0,025 (in via 0,025) |
| Peso MFP decellularizzato dopo la rimozione del campione di istologia | 0,015 (in via 0,015) | 0,016 (in inglese) |
Tabella 1: pesi dei tessuti prima e dopo la decellularizzazione. Pesi tissutali rappresentativi per ogni condizione sono stati misurati prima e dopo la decellularizzazione della MFP.
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Discussion
Questo metodo di formazione di idrogel dipende in gran parte dalla quantità di tessuto iniziale. Gli MFP Murine sono piccoli e il processo di decellularizzazione comporta una significativa riduzione del materiale (Tabella1). Il processo può essere ripetuto con più MFP per aumentare la resa finale. La fresatura è un altro passo importante che può portare alla perdita di materiale. Altri hanno dimostrato successo con un mulino criogenico, ma questo protocollo si basa sulla fresatura tramite un mortaio portatile e un trapano elettrico con un attacco pestello8,17. Ciò ha il vantaggio di ridurre i costi di capitale e di ridurre al minimo la perdita di materiale, ma può introdurre variabilità nel prodotto finale.
Una sfida alla conferma della decellularizzazione e de-lipidazione è nel congelamento del tessuto adiposo nel mezzo di incorporamento criostato. La figura 2A mostra la colorazione H & E di un MFP non irradiato incorporato e sezionato in paraffina. Nuclei distinti sono visibili sui bordi delle cellule adipose vicino giunzioni con altre cellule, e la morfologia adipocito è ben mantenuta. Figura 2B ,C,E,F mostra le unità multifunzione preparate incorporando e congelando le unità multifunzione in un mezzo di incorporamento criostato e sezionando 5 fette di m. Questo processo non è stato in grado di mantenere la morfologia e la forma degli adipociti. Tuttavia, la decellularizzazione è stata confermata dalla perdita di nuclei e altre tracce di DNA (Figura 2C) e la delipidazione è stata visualizzata con la perdita di colorazione neutra del contenuto lipidico (Figura 2F). La morfologia degli adipociti è stata mantenuta incubando MFP in saccarosio, incorporando e congelando nel mezzo di incorporamento criostato e sezionando 30 fette di m (Figura 2D,G). Mentre la visualizzazione della colorazione H & E era difficile con questo metodo (Figura 2D), 1-([4-(Xylylazo)xylyl)-2-naphthol colorazione ha confermato la conservazione della morfologia adipocite (Figura 2G).
Abbiamo sviluppato un modello di idrogel in vitro in grado di imitare il microambiente tissutale normale in vivo e la sua risposta ai danni da radiazioni. Gli idrogel ECM sono stati fabbricati in studi simili, ma l'impatto dei danni da radiazioni sul comportamento delle cellule tumorali non è stato valutato9,12,16,17,18. Prevediamo che l'irradiazione delle MFP altererà il rimodellamento e la composizione dell'ECM, e questi cambiamenti compositivi saranno caratterizzati negli studi futuri. Abbiamo osservato una tendenza crescente nella proliferazione di 4T1 cellule all'interno di idrogel ECM irradiati utilizzando sia l'imaging a bioluminescenza che la colorazione della vitalità (Figura 4). Inoltre, abbiamo usato il coniugato di phalloidin ai filamenti F-actin macchiati nelle cellule tumorali incapsulate e abbiamo trovato un aumento qualitativo dell'allineamento dell'actina e dell'allungamento delle cellule tumorali negli idrogel ECM irradiati, il che suggerisce un aumento della forza di adesione e capacità invasiva (Figura 5)19,20. Esperimenti futuri esploreranno i cambiamenti nelle dinamiche di adesione focale e il rimodellamento mediato dalla proteasi per la valutazione della migrazione e dell'invasione delle cellule.
Questo metodo è stato sviluppato utilizzando una linea cellulare TNBC murine, ma questo metodo può essere utilizzato come piattaforma per valutare la proliferazione e l'invasività di altri tipi di cellule. Studi futuri possono incorporare cellule immunitarie per determinare il loro ruolo in risposta alle radiazioni così come altre forme di danno tissutale (ad esempio, chirurgia). Anche se questo studio ha valutato gli idrogel ECM da MFP irradiati ex vivo, ulteriori studi esploreranno le radiazioni in vivo di MFP per valutare l'effetto della risposta alle radiazioni fisiologiche e infiltrarsi nelle cellule immunitarie sulle caratteristiche ECM. Abbiamo stabilito un metodo per fabbricare idrogel ECM da MFP del topo per studiare l'effetto della normale radiazione tissutale sul comportamento delle cellule tumorali, e questa tecnica può essere estesa al tessuto umano per un modello di idrogel più rilevante. Nel complesso, l'esame dei normali danni ai tessuti attraverso gli idrogel ECM può portare a approfondimenti sul ruolo dei cambiamenti dell'ECM in seguito alla radioterapia nella ricorrenza locale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano la dott.ssa Laura L. Bronsart per aver fornito le cellule GFP e luciferase-4T1, il Dr. Edward L. LaGory per un consiglio su 1-((4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol che staina, il Dr. Craig L. Duvall per IVIS e lyophilizer use, e Dr. Scott A. usare. Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente da NIH grant #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | - |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | - |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | - |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | - |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | - |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | - |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | - |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | - |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | - |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | - |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | - |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | - |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | - |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | - |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | - |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | - |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | - |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
References
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