Summary
Denne protokollen presenterer en metode for decellularization og påfølgende hydrogel dannelse av murine bryst fett pads etter ex vivo bestråling.
Abstract
Stråling er en terapi for pasienter med trippel negativ brystkreft. Effekten av stråling på ekstracellulære matrise (ECM) av sunne brystvevet og dens rolle i lokale gjentakelse på den primære tumor området er ukjent. Her presenterer vi en metode for decellularization, lyophilization og fabrikasjon av ECM-hydrogeler avledet fra murine melkefett pads. Resultatene er presentert på effektiviteten av decellularization prosessen, og reologiske parametre ble vurdert. GFP-og luciferase-merket brystkreftceller innkapslet i hydrogeler demonstrerte en økning i spredning i bestrålt hydrogeler. Til slutt, phalloidin bøye farging ble brukt til å visualisere cytoskeleton organisering av innkapslet tumorceller. Vårt mål er å presentere en metode for fabrikere hydrogeler for in vitro studie som etterligner in vivo brystvevet miljø og dens reaksjon på stråling for å studere tumor celle atferd.
Introduction
Kreft er preget av overflødig spredning av celler som kan unngå apoptose og også metastase til fjerntliggende områder1. Brystkreft er en av de vanligste formene blant kvinner i USA, med anslagsvis 266 000 nye tilfeller og 40 000 dødsfall i 20182. En spesielt aggressiv og vanskelig å behandle under type er trippel negativ brystkreft (TNBC), som mangler østrogen reseptor (ER), progesteron reseptor (PR), og menneskelig epidermal vekstfaktor (HER2). Strålebehandling er vanligvis brukt i brystkreft å eliminere gjenværende tumorceller etter lumpectomy, men over 13% av TNBC pasienter fortsatt oppleve gjentakelse på den primære tumor området3.
Det er kjent at strålebehandling er effektiv i begrensende metastasering og gjentakelse fordi kombinasjonen av lumpectomy og stråling resulterer i samme langsiktige overlevelse som mastektomi4. Men det har nylig blitt vist at strålebehandling er forbundet med lokale tilbakefall til den primære tumor området i immunsupprimerte innstillinger5,6. Dessuten er det velkjent at stråling endrer ekstracellulære matrise (ECM) av normalt vev ved å indusere fibrose7. Derfor er det viktig å forstå rollen til stråling-indusert ECM endringer i dikterer tumor celle atferd.
Decellularized vev har blitt brukt som in vitro-modeller for å studere sykdom8,9. Disse decellularized vev bevarer ECM-sammensetning og recapitulate komplekset in vivo ECM. Denne decellularized tissue ECM kan videre behandles og fordøyd å danne rekonstituert ECM hydrogeler som kan brukes til å studere cellevekst og funksjon10,11. For eksempel, injiserbare hydrogeler avledet fra decellularized menneskelige liposaspiratet og fra hjerteinfarkt vev fungert som ikke-invasiv metoder for vev engineering, og en hydrogel avledet fra svin lunge vev ble utnyttet som en in vitro metode for testing mesenchymal Stem Cell vedlegg og levedyktighet12,13,14. Effekten av normal vevs stråling skade på ECM-egenskaper, men har ikke blitt undersøkt.
Hydrogeler avledet fra ECM har størst potensial for in vitro studie av in vivo fenomener. Flere andre materialer har blitt studert, inkludert kollagen, fibrin og matrigel, men det er vanskelig å syntetisk recapitulate sammensetningen av ECM13. En fordel med å bruke ECM-avledet hydrogeler er at ECM inneholder de nødvendige proteiner og vekstfaktorer for en bestemt vev14,15. Bestråling av normalt vev under lumpectomy forårsaker betydelige endringer i ECM, og ECM-avledet hydrogeler kan brukes til å studere denne effekten in vitro. Denne metoden kan føre til mer komplekse og mer nøyaktige in vitro modeller av sykdom.
I denne studien har vi utsatt murine bryst fett pads (MFP-er) til stråling ex vivo. MFP-er ble decellularized og laget i pre-gel-løsning. Hydrogeler ble dannet med innebygde 4T1 celler, en murine TNBC cellelinje. De reologiske egenskapene til det hydrogel materialet ble undersøkt, og tumor celle dynamikk ble evaluert i hydrogeler. Hydrogeler fabrikkert fra bestrålt MFP-er forbedret tumor celle spredning. Fremtidige studier vil innlemme andre celletyper for å studere celle-celle interaksjoner i sammenheng med kreft gjentakelse etter behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrestudier ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer og protokoller godkjent av Vanderbilt University institusjonelle Animal Care og use Committee.
1. forberedelse og ex vivo-bestråling av MFP-er
- Offer athymic nu/nu mus (8 – 10 uker) ved bruk av CO2 kvelning etterfulgt av cervical forvridning.
- Rengjør huden med 70% etanol.
- Samle bryst fett pads (MFP) fra ofret mus ved hjelp av pre-sterilisert saks og tang i et 15 mL konisk rør som inneholder komplett RPMI Media (RPMI supplert med 1% penicillin-Streptomycin og 10% fosterets storfe serum) (se tabell over materialer ).
- Irradiate prøver til 20 gy ved hjelp av en cesium kilde.
- Ta med bestrålt MFP-er og Fullfør RPMI-medier i et biosafety kabinett. Mediene vil være avhengig av cellelinjen til å bli dyrket i den endelige hydrogel. Fyll 6 cm eller 10 cm oppvask med nok Media til å senke MFP-er. For 6 cm retter, bruk 8 mL medier, og for 10 cm retter, bruk 20 mL av Media.
- Ruge i en 37 ° c/5% CO2 inkubator i to dager. Hvor lang tid i inkubator kan justeres.
- Skyll vevet i fosfat-bufret saltvann (PBS), tørk overflødig fuktighet, og plasser MFP-er i 15 mL koniske rør for lagring ved-80 ° c til decellularization. Dette fryse trinnet hjelper decellularization trinnet, og prøven skal fryses selv om de neste trinnene ellers er klare.
2. Decellularization (tilpasset fra referanser12,16,17)
Merk: denne prosedyren ble tilpasset fra tidligere publiserte metoder fokusert på fett decellularization, som inkluderte natrium natriumdeoksykolat ioniske vaskemiddel i stedet for natrium natriumdodecylsulfat sulfat å fjerne DNA effektivt12,16 , 17av dem.
- På dag 1fjerner du frosne MFP-er fra-80 ° c og tine ved romtemperatur.
- Når tint, tørre MFP-er kort på en delikat oppgave tørk. Veie MFP-er ved hjelp av en analytisk skala.
- Ved hjelp av et par tang med saks eller en skalpell, dele vev opp i 3 mm x 3 mm x 3 mm prøver for studier av intakt ECM og det resterende vevet for hydrogel produksjon.
Merk: antall prøver er avhengig av antall testmetoder, for eksempel at innsamlingen av to prøver er beskrevet nedenfor: én for para fin innebygging (trinn 2,5) og én for frysing i kryostaten innebygging av medium, hvis ønskelig (se tabellen over materialer og trinn 2,6). - Veie vevet. Hvis innebygging i parafin for snitting, fortsetter du til trinn 2,5. Hvis frysing i kryostaten embedding medium for snitting, fortsetter du til trinn 2,6.
- I en kjemisk hette, Senk vevet i 10% nøytral bufret formalin (NBF) (se tabell over materialer) for 24 h ved 4 ° c. Vask 3 ganger i PBS for 5 min hver. Senk vevet i 30% sukrose for 48 h ved 4 ° c.
- Veie vevet nå at dette stykket har blitt fjernet. Fortsett til trinn 2,6.
- I en kjemisk hette, plasser MFP-brikker i en merket kassett klar med kryostaten innebygging medium. Legg til flere kryostaten embedding medium for å dekke vevet.
- Plasser kassetten i et beger med 2-methylbutane (se materialfortegnelsen) som er avkjølt med flytende nitrogen. Begeret skal ha nok 2-methylbutane til å dekke bunnen, men ikke nok til å senke kassetten fordi kryostaten embedding medium ikke bør berøre 2-methylbutane. La kassetten sitte i 2-methylbutane til kryostaten innebygging medium fryser og blir ugjennomsiktig.
- Pakk kassetten (e) i folie, etikett og la være ved-80 ° c til den brukes til snitting.
Merk: vev plassert umiddelbart i kryostaten embedding medium ble delt på 5 μm mens vev inkubert i sukrose ble delt ved 30 μm å beholde adipocyte morfologi.
- Bruk tang for å manuelt massere det resterende vevet.
Merk: vevs brikker kan også plasseres i 10% NBF for 24 – 48 timer, skylt i PBS, og etterlatt i 70% etanol til innebygging i parafin. Etter innebygging, 5 μm seksjoner kan brukes for hematoksylin og eosin (H & E) farging (se avsnitt 7 nedenfor). - Sett MFP-er i 6 cm retter med 5 mL 0,02% Trypsin/0,05% EDTA-løsning. Ruge ved 37 ° c for 1 h. spray og tørk av rettene med 70% etanol før du plasserer i inkubator.
- Bruk 0,7 mm siler for å vaske MFP-er med deionisert (DI) vann ved å helle vann over vevet tre ganger. Bruk pinsett til å manuelt massere vevet mellom vasker.
- Kort tørt vev på en delikat oppgave tørk og veie. Plasser vev i et autoklaveres beger som inneholder en rør bar med riktig størrelse. Dekk vev med 60 mL 3% t-octylphenoxypolyethoxyethanol (se tabell over materialer) per 1 g vev og rør i 1 time ved romtemperatur. Bruk minimum 20 mL.
- Dump vev og innhold i en sil. Skyll begeret med DI vann og hell på vev. Gjenta to ganger til. Bruk pinsett til å manuelt massere vevet mellom skyllinger.
- Kort tørt vev på en delikat oppgave tørk og veie. Plasser vev og rør barer tilbake i samme kanner, og dekk med 60 mL 4% deoxycholic syre per 1 g vev. Rør i 1 time ved romtemperatur. Bruk minimum 20 mL.
- Dump vev og innhold i en mesh sil. Skyll begeret med DI vann og hell på vev. Gjenta to ganger til. Bruk pinsett til å manuelt massere vevet mellom skyllinger.
- Kort tørt vev på en delikat oppgave tørk og veie.
- Plasser vev i samme beger med fersk DI vann supplert med 1% penicillin-Streptomycin. Dekk tett med para fin film. Avreise over natten ved 4 ° c.
- Vask siler og kanner for bruk neste dag.
- På dag 2, avløp beger innholdet i en sil. Kort tørt vev på en delikat oppgave tørk og veie.
- Plasser MFP-er i samme beger med en rør linje med riktig størrelse. Deksel med 60 mL 4% etanol/0,1% peredikksyre bli yre oppløsning per 1 g vev. Bruk minimum 20 mL. Rør for 2 timer ved romtemperatur.
- Dump vev og innhold i en 0,7 mm sil. Bruk pinsett til å manuelt massere vevet. Plasser innholdet tilbake i begeret. Vask vevet ved å dekke det med 60 mL 1x PBS per 1 g vev. Bruk minimum 20 mL. Rør i 15 minutter ved romtemperatur. Gjenta én gang.
- Dump vev og innhold i en 0,7 mm sil. Bruk pinsett til å manuelt massere vevet. Plasser innholdet tilbake i begeret. Vask vevet ved å dekke det med 60 mL DI vann per 1 g vev. Bruk minimum 20 mL. Rør i 15 minutter ved romtemperatur. Gjenta én gang.
- Kort tørt vev på en delikat oppgave tørk og veie. Dump vev og innhold i en sil. Bruk pinsett til å manuelt massere vevet.
- Plasser innholdet tilbake i begeret. Dekk vev med 60 mL på 100% n-propanol per 1 g vev. Bruk minimum 20 mL. Rør i 1 time ved romtemperatur.
- Kort tørt vev på en delikat oppgave tørk og veie. Dump vev og innhold i en 0,7 mm sil. Bruk pinsett til å manuelt massere vevet.
- Plasser innholdet tilbake i begeret. Vask vevet ved å dekke det med 60 mL av DI vann per 1 g vev. Bruk minimum 20 mL. Rør i 15 minutter ved romtemperatur. Gjenta tre ganger.
- Dump vev og innhold i en sil. Gjenta trinn 2.3 – 2.6 for å samle biter av vev for sukrose inkubasjons og frysing i kryostaten embedding medium.
- Kort tørt vev på en delikat oppgave tørk og veie. Plasser i et merket 15 mL rør. Frys ved-80 ° c over natten.
3. Lyophilization
- Fjern 15 mL rør fra-80 ° c og plasser på tørr is. Hold prøvene frosset på tørr is til på lyophilizer.
- Fjern caps. Bruk en gummistrikk for å feste en delikat oppgave tørk til toppen for å dekke åpningen. Sett prøver på lyophilizer i minst 2 dager.
- Fjern prøvene fra lyophilizer og Legg rørene på tørr is. Fjern delikate aktivitets kluter veie hver prøve på en analytisk skala. Fest caps og plasser ved-80 ° c over natten.
4. fresing
- Fyll en grunne beholder med flytende nitrogen. Fjern prøvene fra-80 ° c fryseren. Veie hver lyofilisert MFP.
- Plasser en prøve i mørtel. Bruk en kryogene hanske for å holde mørtel i flytende nitrogen.
- Bruk en morter som er festet til en håndholdt Drill for å mølle prøven. Mill i 1 min intervaller for å sjekke fremgangen og fjerne hansker hånd fra flytende nitrogen. Mill i minst 5 min.
- Gjenta for alle prøvene. Spray og tørk av mørtel og morter med etanol mellom hver prøve.
- Oppbevar pulverisert prøver i 15 mL rør ved-80 ° c til klar til bruk.
Merk: prøver kan brukes umiddelbart eller lagres over natten.
5. hydrogel formasjon
- Hvis det oppbevares ved-80 ° c over natten, fjern og Tin ved romtemperatur. Mens tine, beregne den nødvendige vekten av Pepsin (se tabell over materialer) og volum av saltsyre (HCL) som er nødvendig for hver prøve som resulterer i en løsning med 1% w/v prøve pulver og 0,1% w/v pepsin i 0,01 M HCL. legge til pepsin i HCL-skjemaet en pepsin-HCl løsning.
- Legg prøve pulver og pepsin-HCl løsning på en 15 mL tube. Legg til en liten røre bar, og røre for 48 h.
- Plasser rørene på isen i 5 min. Beregn nødvendig volum på 10x PBS nødvendig for hver prøve som resulterer i en løsning med en 1x PBS konsentrasjon. Legg til riktig volum på 10x PBS til hvert rør.
- Tilsett 10% v/v 0,1 M NaOH til hver løsning for å nå pH 7,4. Bruk en pH-papir for å teste individuelt.
Merk: gel-løsningen kan oppbevares ved 4 ° c i en uke.
6. innkapsle celler i hydrogeler
- Bruke GFP-og luciferase-merkede celler
- Ved hjelp av pH 7,4 gel løsning, resuspend pelleted GFP-og luciferase-merket 4T1 celler til en konsentrasjon av 500 000 eller 1 000 000 celler/mL gel løsning. Tilsett 16 μL gel-celle løsning på hver brønn av en 16-brønn kammer Slide. Ruge for 30 min ved 37 ° c.
- Tilsett 100 μL av komplett RPMI-medium i hver brønn. Fortsett inkubasjons for 48 h ved 37 ° c. GFP-og luciferase-merkede celler kan visualisere ved hjelp av fluorescens mikroskopi på 0 timer, 24 timer, og 48 timer etter gelation.
Merk: celle spredning kan måles for GFP-og luciferase-merket 4T1 celler som brukes her ved å legge til (S)-4, 5-dihydro-2-(6-AHA-2-benzothiazolyl) -4-thiazolecarboxylic acid kalium salt (se tabell over materialer) til brønnene for 10 min og utføre bioluminesens avbildning ved hjelp av et bioluminesens bildesystem (se tabell over materialer). Etter bioluminesens avbildning kan cytoskeleton vises (se pkt. 10).
- Bruke umerkede celler
- Ved hjelp av pH 7,4 gel-løsningen, resuspend pelleted umerkede 4T1-celler til en konsentrasjon på 500 000 eller 1 000 000 celler/mL gel løsning. Tilsett 16 μL gel-celle løsning på hver brønn av en 16-brønn kammer Slide og en 96-brønn plate. Ruge for 30 min ved 37 ° c.
- Tilsett 100 μL av medier i hver brønn. Fortsett inkubasjons for 48 h ved 37 ° c.
Merk: celle levedyktigheten kan måles (se avsnitt 11). Den 16-brønn kammer Slide kan brukes til bildebehandling, og 96-brønn plate kan brukes til kvantifisering.
7. H & E farging
- For formalin-fast, parafin-embedded vev, Senk lysbilder inneholder 5 μm seksjoner to ganger i 100% xylen (5 – 10 min) for de-paraffinization. Rehydrate av submerging i 100%, 95%, 85%, og 70% etanol for 5 min hver etterfulgt av DI vann i 5 min. Fortsett til trinn 7,6.
- For frosne vev seksjoner, ta seksjoner umiddelbart fra fryseren og senk dem i 10% NBF i 10 min. vask i 1x PBS tre ganger for 5 min hver. Skyll i vann i 5 minutter.
- Stain kjerner med hematoksylin i 3 min. skyll i rennende vann fra springen.
- Differensiere ved å dyppe 1-2 ganger i 0,3% syre alkohol (0,3% HCl i 70% etanol). Skyll i rennende vann fra springen i 5 min.
- Legg bluing agent for 30 s. skyll i rennende vann fra springen i 5 min. Senk i 95% etanol for 30 s.
- Ruge med eosin for 90 s ved romtemperatur. Tørke i 3 endringer av 100% etanol for 5 min hver.
- Senk to ganger i 100% xylen for 5 min hver. Legg til distyrene-mykgjører-xylen (DPX0 monterings medier i lysbildet, og Legg til en dekkglass. La det kurere over natten før bildebehandling.
8.1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farging
- Forbered 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol løsning.
- Tilsett 0,5 g av 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol pulver til et beger med 100 mL propylenglykol. Varme til 95 – 100 ° c under omrøring i minst 30 min. forhindre at temperaturen overstiger 100 ° c.
- Fjern begeret fra varmen og la avkjøles litt. Hell oppløsningen gjennom en grad 4 kvalitativ filter papir for å fjerne eventuelle gjenværende partikler.
Merk: oppløsningen kan oppbevares ved romtemperatur og bør filtreres gjennom et sprøyte filter på 0,45 μm rett før farging.
- Stain frosne vev seksjoner.
- Fjern lysbilder fra-80 ° c fryseren og lufttørke i 30 min. pre-Cool 10% NBF ved-20 ° c i 30 min i en Coplin krukke. Fest lysbildene ved romtemperatur i 10 min. vask i DI vann 3 ganger for 5 min hver.
- Fjern overflødig vann ved hjelp av en delikat oppgave tørk før du fordyper deg i propylenglykol 2 ganger i 5 minutter hver. Fjern lysbilder fra propylenglykol. Må ikke skylles.
- Plasser lysbildene i sprøyten filtrert olje rød O farge løsning for 3 timer ved romtemperatur.
- Differensiere ved å plassere lysbilder i 85% propylenglykol i 5 min. skyll prøvene i PBS to ganger i 5 minutter hver.
- Stain prøver med hematoksylin for 30 s. vask i rennende vann fra springen i 5 min og deretter plassere lysbildene i DI vann.
- Monter prøver ved hjelp av vandig basert montering medium og la Media tørke over natten før bildebehandling.
9. Reologi
- Bring pre-gel løsninger fra trinn 5,4 til rheometer på isen.
- Fest en 25 mm arm og plate til rheometer. Åpne den Reologi programvaren på datamaskinen som er koblet til rheometer.
- Utfør rotasjons tilordning og Bestem null gapet. Hev armen når den er ferdig.
- Pipetter 500 μL av pre-gel på tallerkenen. Senk armen til den pre-gel løsning helt opptar gapet mellom platen og armen. Være konservativ fordi senke armen forbi dette punktet vil resultere i pre-gel løsning søle ut av siden.
- Utfør en frekvens sveip på pre-gel-oppløsningen fra 0,1 – 100 Hz etter at den har vært på 37 ° c i 30 minutter.
- Hev rheometer armen når den er ferdig. Tørk væske med en delikat oppgave tørk. Skyll med DI vann og tørk med en delikat oppgave tørk. Gjenta trinn 9.4 – 9,6 med flere eksempler.
10. Phalloidin bøy farging av F-utgangen
- Bring phalloidin bøye løsning til romtemperatur. Sentrifuger kort med lav hastighet før åpning. Alikvot nok løsning for analysen, og oppbevar resten ved-20 ° c.
- Fortynne 1000x phalloidin bøye lagerløsning til en 1x arbeids løsning ved å tilsette 1 μL lagerløsning til 1 mL 1x PBS + 1% storfe serum albumin (BSA). Dette gjør at det er nok for 10 brønner (100 μL/brønn).
Merk: en kan bruke vanlig 1x PBS, men 1x PBS + BSA foretrekkes for å hindre phalloidin bøy fra å stikke til røret. Ikke Oppbevar denne løsningen etter analysen. 1 μL av blått fluorescerende fargestoff (se tabell over materialer) arbeids løsning kan tilsettes til flekken for kjerner. Arbeids løsning kan gjøres ved å blande 1 μL 20 mM blått fluorescerende fargestoff med 11,3 μL 1x PBS. - Aspirer medier fra brønner (trinn 6,1). Skyll brønnene med 1x PBS.
- Tilsett 10% NBF. Ruge brønner med 10% NBF i 20 min ved romtemperatur. Fjern supernatanten. Vask 3 ganger med PBS for 5 min hver gang.
- Legg 0,1% t-OCTYLPHENOXYPOLYETHOXYETHANOL i PBS for 5 min. aspirer og vask 3 ganger med PBS for 5 min hver gang.
- Tilsett 100 μL av arbeids løsning fra trinn 10,2 til hver brønn. Ruge for 1 time ved romtemperatur. Aspirer og vask 3 ganger med PBS for 5 min hver gang. Leave in PBS ved 4 ° c.
- Aspirer og fjerne brønner fra pakningen på kammeret lysbildet. Bruk nål nese pinsett for å fjerne pakningen fra lysbildet. Montere og dekkglass prøver ved hjelp av vandig basert montering medium. Tillat å kurere (5 min).
- Observer celler under et fluorescens mikroskop ved eksitasjon/utslipp på 590/618 NM.
11. levedyktighet analysen
- Skyll cellene med Dulbecco ' s PBS (DPBS). Tilsett 100 μL av DPBS inneholdende 1 μM calcein AM og 2 μM etidiumbromid homodimer til hver brønn. Ruge i 30 minutter ved romtemperatur.
- Bilde av 16-brønn kammer lysbilde av fluorescens mikroskopi. Calcein acetoxymethyl (Calcein AM) kan observeres ved eksitasjon/emisjon = 494/517 NM. Etidiumbromid homodimer kan observeres ved eksitasjon/emisjon = 528/645 NM.
- Les 96 brønn platen på en plate leser med samme bølgelengder i trinn 11,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MFP-er ble decellularized etter bestråling ved bruk av prosedyren vist i figur 1a. MFP-decellularization (figur 1B) og post-Decellularization (figur 1C) vises. Decellularization ble bekreftet ved hjelp av hematoksylin og eosin (H & E) farging, og 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farging ble brukt til å evaluere lipid innhold (figur 2). Reologiske egenskaper for ECM-hydrogeler ble også vurdert ved 37 ° c (Figur 3). Lagrings modulen var høyere enn taps modulen for alle forhold, og viste stabil hydrogel formasjon.
GFP-og luciferase-merket 4T1 brystkreftceller ble innkapslet i hydrogeler. Celle spredning ble undersøkt av fluorescens mikroskopi, bioluminesens målinger og levedyktighet farging 48 h etter innkapsling (Figur 4). Bestrålt hydrogeler viste en økende trend i spredning av tumorceller. Phalloidin bøy ble brukt til å visualisere F-utgangen i de innkapslet cellene (figur 5). Denne teknikken kan brukes til å undersøke celle morfologi og cytoskjelettkomponenter egenskaper.
Figur 1: eksperimentell arbeidsflyt. (A) skjematisk av hydrogel formasjon. Digital kamerabilder ble tatt av MFP-er før-(B) og post-decellularization (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: bekreftelse av decellularization og lipidation i MFP-er. Hematoksylin og eosin farging (H & E) av unirradiated MFP-er innebygd i parafin og delt ved 5 μm (A) ble sammenlignet med MFP-er frosset i kryostaten embedding medium (5 μm seksjoner) før (B) og etter decellularization (C), inkubert med sukrose før frysing i kryostaten embedding medium og delt ved 30 μm (D). 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farging ble gjort for å visualisere lipid oppbevaring i MFP-er frosset i kryostaten embedding medium (5 μm seksjoner) før (E) og etter Decellularization (F) og inkubert med sukrose før frysing i kryostaten embedding medium og delt ved 30 μm seksjoner (G). Vektstenger representerer 50 μm. Decell = decellularization. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: bekreftelse av hydrogel formasjon. Reologi ble brukt til å bestemme lagrings-og taps modulen for kontroll (A) og bestrålt (B) pre-gel-løsning laget av mfp-er på 37 ° c og 0,5% belastning. Feilfelt viser standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: tumor celle spredning i BESTRÅLT ECM-hydrogeler. 4T1 celle spredning 48 h etter inoculation er vist med pre-gel avledet fra kontroll (A) og bestrålt (B) MFP. (C) bioluminesens signal fra 4T1 celler innebygd i kontroll og bestrålt hydrogeler. Calcein AM farget levende celler og etidiumbromid homodimer farget døde celler ble evaluert i kontroll (D) og bestrålt (E) hydrogeler, og live/Dead ratio var kvantifisert (F). Vektstenger representerer 200 μm. Feil stolper viser standard feil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: cytoskjelettkomponenter egenskaper i ECM-hydrogeler. Celler i (A) kontroll og (B) bestrålt ECM-hydrogeler er farget med phalloidin bøy for å visualisere F-utgangen (rød) og blått fluorescerende fargestoff for å visualisere kjerner (blå) i bestrålt MFP-er. Scale bar representerer 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Vevs vekt (g) | Kontroll (0 gy) |
Bestrålt (20 gy) |
| Opprinnelig MFP-vekt | 0,461 | 0,457 |
| MFP-vekt som følger histologi prøve fjerning | 0,423 | 0,416 |
| MFP-vekt etter decellularization | 0,025 | 0,025 |
| Decellularized MFP-vekt etter histologi prøve fjerning | 0,015 | 0,016 |
Tabell 1: vevs vekter før og etter decellularization. Representative vevs vekter for hver tilstand ble målt før og etter MFP-decellularization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden for hydrogel formasjon er i stor grad avhengig av mengden av starter vev. Murine MFP-er er små, og decellularization prosessen resulterer i en betydelig reduksjon av materiale (tabell 1). Prosessen kan gjentas med flere MFP-er for å øke den endelige avkastningen. Fresing er et annet viktig skritt som kan føre til tap av materiale. Andre har vist suksess med en kryogene mill, men denne protokollen er basert på fresing via en håndholdt mørtel og elektrisk drill med en morter vedlegg8,17. Dette har fordelen av lavere kapitalkostnader og minimere materielle tap, men kan innføre variasjon i det endelige produktet.
En utfordring til bekreftelse av decellularization og de-lipidation er i frysing fettvev i kryostaten embedding medium. Figur 2a viser H & E farging av en unirradiated MFP innebygd og delt i parafin. Distinkte kjerner er synlige på kantene av fett celler i nærheten av veikryss med andre celler, og adipocyte morfologi er godt vedlikeholdt. Figur 2b , C, E, F Vis MFP-er klargjort ved å bygge inn og fryse MFP-er i kryostaten innebygging mellom store og snitt 5 μm skiver. Denne prosessen kunne ikke beholde adipocyte morfologi og form. Imidlertid ble decellularization bekreftet gjennom tap av kjerner og andre spor av DNA (figur 2C), og de-lipidation ble visualisere med tap av nøytralt lipid innhold farging (figur 2F). Adipocyte morfologi ble opprettholdt av incubating MFP-er i sukrose, innebygging og frysing i kryostaten embedding medium, og skjæring 30 μm skiver (figur 2D, G). Mens visualisering av H & E farging var vanskelig med denne metoden (figur 2D), 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farging bekreftet oppbevaring av adipocyte morfologi (figur 2g).
Vi har utviklet en in vitro hydrogel modell som kan etterligne in vivo normale vevs mikromiljøet og dens respons på strålings skade. ECM hydrogeler har vært fabrikkert i lignende studier, men virkningen av stråling skade på tumor celle atferd har ikke blitt vurdert9,12, 16,17,18. Vi forventer at bestråling av MFP-er vil endre ECM-ombygging og sammensetning, og disse endringene vil karakteriseres i fremtidige studier. Vi observerte en økende trend i spredningen av 4T1 celler innenfor bestrålt ECM-hydrogeler ved hjelp av både bioluminesens avbildning og levedyktighet farging (Figur 4). I tillegg brukte vi phalloidin bøye å beis F-utgangen filamenter i innkapslet tumorceller og fant en kvalitativ økning i utgangen justering og tumor celle forlengelse i bestrålt ECM-hydrogeler, noe som tyder på en økning i vedheft styrke og invasiv kapasitet (figur 5)19,20. Fremtidige eksperimenter vil utforske endringer i fokal vedheft dynamikk og protease-mediert remodeling for evaluering av celle migrasjon og invasjon.
Denne metoden ble utviklet ved hjelp av en murine TNBC cellelinje, men denne metoden kan brukes som en plattform for evaluering av spredning og invasiveness av andre celletyper. Fremtidige studier kan innlemme immunceller til å bestemme deres rolle i respons til stråling, samt andre former for vevskader (f. eks kirurgi). Selv om denne studien evaluerte ECM-hydrogeler fra MFP-er bestrålt ex Vivo, vil ytterligere studier utforske in vivo-stråling av MFP-er for å evaluere effekten av fysiologisk stråle respons og infiltrere immunceller på ECM-karakteristikker. Vi har opprettet en metode for å dikte opp ECM-hydrogeler fra muse-MFP-er for å studere effekten av normal vevs stråling på tumor celle adferd, og denne teknikken kan utvides til menneskelig vev for en mer relevant hydrogel modell. Overall, undersøke normal vevsskade gjennom ECM hydrogeler kan føre til innsikt i rollen som ECM endringer etter strålebehandling i lokal gjentakelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Laura L. Bronsart for å gi GFP-og luciferase-4T1 celler, Dr. Edward L. LaGory for råd om 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farging, Dr. Craig L. Duvall for IVIS og lyophilizer bruk, og Dr. Scott A. Guelcher for rheometer Bruke. Denne forskningen ble økonomisk støttet av NIH stipend #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | - |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | - |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | - |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | - |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | - |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | - |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | - |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | - |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | - |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | - |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | - |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | - |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | - |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | - |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | - |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | - |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | - |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
- Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
- Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
- Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
- Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
- Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
- Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
- Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
- Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).
