Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Toksicitetsundersøgelse af zinkoxid nanopartikler i cellekultur og i Drosophila melanogaster

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59510
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

Summary

Vi beskriver en detaljeret protokol til evaluering af de toksikologiske profiler af zinkoxid nanopartikler (ZnO NPs) i særdeleshed, typen af celledød i humane MRC5 lunge fibroblaster og ROS dannelse i frugtflue Drosophila.

Abstract

Zinkoxid nanopartikler (ZnO NPs) har en bred vifte af applikationer, men antallet af rapporter om ZnO NP-associeret toksicitet er vokset hurtigt i de seneste år. Men, undersøgelser, der belyse de underliggende mekanismer for ZnO NP-induceret toksicitet er scanty. Vi fastsatte toksicitets profilerne for ZnO NPs ved hjælp af både in vitro-og in vivo-forsøgsmodeller. Et signifikant fald i cellernes levedygtighed blev observeret i ZnO NP-eksponerede MRC5 lunge fibroblaster, hvilket viste, at ZnO NPs udøver cytotoksiske virkninger. Tilsvarende, interessant, Gut udsat for ZnO NPs udstillet en dramatisk stigning i reaktive ilt arter niveauer (ROS) i frugtflue Drosophila. Der er behov for mere dybtgående undersøgelser for at fastlægge en risikovurdering for forbrugernes øgede brug af ZnO NPs.

Introduction

Nanoteknologi refererer til anvendelsen af nanodimensionale materialer, der anvendes på tværs af alle videnskabelige områder, herunder medicin, materialevidenskab, og biokemi. For eksempel, ZnO NPs, der er kendt for deres ultraviolet spredning, kemisk sensing, og anti-mikrobielle egenskaber, samt høj elektrisk ledningsevne, udnyttes i produktionen af forskellige forbrugerprodukter såsom fødevareemballage, kosmetik, tekstiler, gummi, batterier, katalysator til bil hale gas behandling, og biomedicinske-relaterede applikationer1,2,3.

De spirende anvendelser af ZnO NP-baserede produkter, som fører til øget menneskelig udsættelse for ZnO NPs, har imidlertid givet anledning til betænkeligheder med hensyn til deres potentielle skadelige virkninger på menneskers sundhed. En række in vitro cellulære undersøgelser har vist, at ZnO NPS kan inducere oxidativt stress, autophagy-relateret cytotoksicitet, inflammation og genotoksicitet4,5,6,7,8 . Især er toksiciteten af ZnO NP'er antaget at være forårsaget af opløsningen af Zn til frie Zn2 + ioner, samt overfladen reaktivitet af ZnO, hvilket resulterer i de cellulære Ioniske og metaboliske ubalancer, der er forbundet med nedsat ionisk homeostase og en hæmning af ion transport4,7,9,10. Det er vigtigt, at undersøgelser har vist, at genereringen af reaktive oxygenarter (ROS) er en af de primære mekanismer, der ligger til grund for ZnO NPs-associeret toksicitet. Utilstrækkelig anti-oxidativ aktivitet efter ROS fornærmelse har vist sig at være ansvarlig for at fremkalde cytotoksicitet og DNA-skade9. De toksiske virkninger af ZnO NPS er også blevet rapporteret i dyremodeller, herunder gnaver1, zebra11,12, samt hvirvelløse Drosophila13.

Drosophila fungerer som en veletableret alternativ dyremodel for toksicitets screening af kemiske enheder og nanomaterialer (NMS)14,15. Det er vigtigt, at der er høje niveauer af genetisk og fysiologisk lighed mellem mennesker og Drosophila , som berettiger brugen af Drosophila som en in vivo-model til vurdering af biologisk respons på miljøforurenende stoffer såsom NMS 16. Desuden er der mange fordele ved at bruge Drosophila på grund af sin lille størrelse, kort levetid, genetiske modtagelighed, og nem og omkostningseffektiv vedligeholdelse. Desuden, Drosophila er blevet bredt vedtaget for studiet af genetik, molekylær og udviklingsmæssige biologi, lige siden dens fulde genom var fuldt sekvenserede år siden tilbage i 2000, derfor gør det egnet til en bred vifte af High-gennemløb screening og for at tackle uløste biologiske spørgsmål17,18,19,20,21. I de seneste år, en række undersøgelser relateret til immuntoksicitet ved hjælp af forskellige typer af NPS i Drosophila er blevet rapporteret15,22,23,24. Denne grundlæggende nye viden indhentet fra undersøgelserne ved hjælp af Drosophila har bidraget til at give mere indsigt i vores forståelse af Nanotoksikologi.

ROS er en velkendt synder for cytotoksicitet og genotoksicitet forårsaget af NPs, især, metal-baserede NPs25. ROS er oxygen-holdige kemiske arter med højere reaktive egenskaber end Molekylær ilt. Frie radikaler såsom superoxid radikal (O2-) og endda, ikke-radikale molekyler såsom hydrogenperoxid (H2O2) kan fungere som ros. Under normale fysiologiske tilstand, de er forpligtet til at opretholde cellulære homøostase26, dog, overdreven ros på grund af overproduktion eller dysregulering af antioxidant forsvar system kan forårsage oxidativ stress, fører til beskadigelse af proteiner, lipiderne og deoxyribonucleinsyre (DNA)27. For eksempel, som ROS niveauer stigning og glutathion (GSH) niveau falder samtidig, afbrydelse af adenosin trifosfat (ATP) syntese finder sted og lactat dehydrogenase (LDH) niveau stigninger i mediet, kulminerende i celledød27.

Her tilbyder vi protokoller for at udføre cellulære og genetiske analyser ved hjælp af dyrkede pattedyrceller og Drosophila at bestemme de potentielle negative virkninger af ZnO NPS. Figur 1viser en oversigt over den metode, der er anvendt til toksicitetsstudiet af ZnO NPS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) analyse af levede/faste celler

  1. Sonicate ZnO NPs i suspension i 15 min.
  2. Forbered ZnO NPs ved forskellige koncentrationer (f. eks. 0, 10, 25, 50.100 og 200 μg/mL) med 1 mg/mL ZnO NP stamopløsning til behandling af dyrkede celler.
  3. Seed MRC5 humane lunge fibroblaster (1 x 105 celler/brønd) på en 6-brønd kultur plade om dagen i forvejen, og Behandl derefter cellerne med 2 ml ZnO NPS (i triplicater) i 8 timer, 16 timer og 24 timer.
  4. Ved hvert tidspunkt opsamles cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 5 min.
  5. Vask celle pillerne to gange med fosfat bufferet saltvand (PBS).
  6. Resuspender cellerne med 1x bindings buffer, som består af 0,1 M HEPES/natriumhydroxid (NaOH), 1,4 M natriumchlorid (NaCl) og 25 mM calciumchlorid (CaCl2), i en koncentration på 1 x 105 celler pr. 100 μl.
  7. Tilsæt 5 μl fluorescein isothiocyanat (FITC) bilagin V Stain og 5 μl propidium kaliumiodid (PI) DNA-pletter, og Inkuber cellerne i 15 minutter ved stuetemperatur (rt; 25 °c) i mørke.
  8. Top op prøverne med en ekstra 400 μL 1x binding buffer før sortering cellerne ved flow cytometry. Der analyseres mindst 10.000 celler for hver prøve.
  9. Tabulere søjlediagrammet ved hjælp af den opnåede median intensitet.

2. eksponering af ZnO NPs til Drosophila

  1. Der tilsættes 1 mL nanopartikler ved forskellige koncentrationer i hætteglas, efterfulgt af 9 mL flue foder for at lave en endelig koncentration på 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL eller 0,5 mg/mL ZnO NPs.
  2. Bland nanopartiklerne med maden grundigt i hætteglassene ved hjælp af pipetten.
  3. Lad flyve maden, der indeholder ZnO NPs, køle af i mindst 2-3 h før brug.
  4. Introducere voksne mænd og kvinder flyver ind i hætteglassene i 5 dage, og give dem mulighed for at parre og lægge æg (som vises som hvide pletter) på overfladen af fødevarer.
  5. Fjern forældre fluer, og lad æggene underkastes yderligere udvikling, som består af 4 forskellige udviklingsmæssige stadier (embryonale, larve, før og voksen scenen).

3. dissektion af flue

  1. Saml sent 3Rd INSTAR larver fra væggen af hætteglassene til analyser. Frisklagte æg udvikler sig normalt til sent 3Rd INSTAR larver efter 72-120 h ved rt.
  2. Rengør dissektions skålen og fyld brønden med dissektion medium/PBS.
  3. Dissekere larverne (sene 3Rd INSTAR) under stereomicroskop ved hjælp af et par tang.
  4. Brug spidsen af pincet til at gøre et lille hul og bryde åbne neglebånd lag af larverne. Træk forsigtigt tarmen ud, og anbring den i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas, der indeholder Schneiders Drosophila -medium, inden fikserings trinnet med 1 ml 4% PARAFORMALDEHYD (PF).
  5. 3.5 Fastgør tarmen i PF i 10 minutter ved RT, for efterfølgende eksperimenter, såsom immun farvning.

4. registrering af ROS ved hjælp af Dihydroethidium (DHE)-farvning

  1. Larverne behandles med forskellige koncentrationer af ZnO NPs som beskrevet i trin 2,1.
  2. Efter dissektion af tarmen fra 3Rd INSTAR larver som beskrevet under punkt 3, Inkuber tarmen i Schneiders Drosophila medium ved rt, før vævs farvning udføres. 1 μL DHE-farvestof (fra lager koncentrationen på 30 mM) opløses i 1 mL af Schneiders medium, hvilket giver en endelig arbejds koncentration på 10-30 μM DHE-farvestof.
  3. Inkuber tarmen i 5 minutter ved RT i mørke, og vask derefter tre gange med Schneiders medium for hver 5 min.
  4. Fastgør tarmen med 4% PF (Valgfrit trin) og monter tarmen på glas skred, med anti-fade monterings medium indeholdende 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Optag billeder under et Konfokal mikroskop.

5. måling af fluorescens ved hjælp af ImageJ software

  1. Importer de optagne fluorescensbilleder, som er erhvervet ved hjælp af Fluorescens mikroskopi eller confokal laser scannings mikroskopi, i ImageJ-softwaren.
  2. Klik på Analysér menu og vælg Indstil mål.
  3. Vælg output måling såsom areal integreret intensitet og gennemsnitlig grå værdi.
  4. Klik på mål.
  5. Vælg en region uden fluorescens for at indstille baggrunden.
  6. Eksporter dataene til Excel-regnearket, og Bestem den korrigerede totale celle fluorescens (CTCF) ved hjælp af beregningen som vist nedenfor.
    CTCF = integreret tæthed-(område af den valgte celle X gennemsnitlig fluorescens af baggrunds aflæsninger)
  7. Konstruere et søjlediagram og udføre statistisk analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NP-udsatte celler blev behandlet med cellen farvning reagens kit, efterfulgt af celle sortering ved hjælp af flow cytometri. ZnO NP-behandlede celler (nederst, højre panel) udviser en højere procentdel af tidlige (R3)/sene apoptotiske celler (R6) end kontrol celler (R5, nederst, venstre panel). Nekrotisk celledød er angivet af R4 (øverst, højre panel) (figur 2). Resultaterne af FITC/annexin V-analysen på ZnO NP-behandlede MRC-5-fibroblaster er vist i figur 2.

For Drosophila eksperimenter blev Soniseret ZnO NPS ved forskellige koncentrationer tilføjet til at flyve mad i 10 ml rør og derefter blandet godt ved hjælp af en pipette regulator (figur 3). Sene tredje INSTAR larver indsamlet fra hætteglas blev dissekeret under stereomicroskop. Larverne blev først vasket for at fjerne rester af resterende mad (figur 4). Den ydre neglebånd lag blev revet fra hinanden for at afsløre indre organer. Tarmen blev identificeret ved det karakteristiske lange og halvgennemsigtige udseende (hvorimod andre organer synes uigennemsigtige og lyse gullige under mikroskopet) (figur 5). Tarmen blev forsigtigt fjernet uden at knække og overført til et nyt mikrocentrifuge glas indeholdende fikat på is (figur 6).

Til kvantitering af fluorescens intensitet, såsom intensiteten af DHE-sonden i tarmen, blev billederne eksporteret i JPEG-eller TIFF-format og åbnet med ImageJ-softwaren. Den del af tarmen til analyse blev udvalgt og identificeret, for eksempel, ileum eller hindgut region, og fluorescens intensitet af regionen af interesse (ROI) blev målt. For at sammenligne de forskellige forsøgs gruppers relative intensitet anvendte vi den samme kvantitative, konfokale mikroskopi metode som beskrevet i det foregående afsnit. Til sammenligning af fluorescens intensiteter blev parameteren sat ved hjælp af den negative, ubehandlede kontrol. Beregninger af signal intensiteten på grundlag af kalibrerings intensiteter for ubehandlet kontrol tillod en direkte sammenligning mellem forskellige forsøgsgrupper. Figur 7 viser den gennemsnitlige intensitet af Dhe-signalet i den 3Rd INSTAR larve tarm, som er eksponeret for ZnO NPS ved forskellige koncentrationer. Larverne i tarmen behandlet med 0,5 mg/mL af ZnO NP-behandling viste den højeste fluorescens intensitet.

Forskellene i de relative intensiteter mellem alle forsøgsgrupperne blev yderligere tabuleret, og der blev foretaget statistisk analyse, som giver både kvalitative og kvantitative resultater (figur 8).

Figure 1
Figur 1: oversigt over den metode, der anvendes til toksicitetsundersøgelse af ZnO NPs. For in vitro-arbejde blev ZnO NP-behandlede celler plettet før flow cytometri-analyse. For in vivo-arbejde blev tarmen dissekeret fra 3Rd INSTAR larver, efterfulgt af farvning med Dhe farvestof og billed erhvervelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: prik plot af celler opdelt i forskellige populationer baseret på deres FITC og PE farvning. De pictogrammer viser resultaterne af FITC/annexin V assay med 24 h behandling af ZnO-NPs på MRC-5. Statistisk analyse af cellerne på forskellige stadier kan derefter udføres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: forberedelse af ZnO NP-holdige flyve fødevare medium. A) ingredienser til fluemad tilsættes til vand, får lov til at svulme op og koges i 5 min.B) efter afkøling ned til 50 °c med omrøring blev nipagin tilsat og blandet grundigt. C) udarbejde en masterblanding for nanopartiklerne (samlet volumen på højst 10% af den endelige fødemængde). (D) medium er derefter aliciteret, blandet med ZnO NPS ved forskellige koncentrationer og lov til at køle ned helt før opbevaring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: hele tarm dissektions proceduren. (A) overføre 3Rd INSTAR larver til en dissektion disc. (B) Brug pincet til forsigtigt at holde en larve, og (C) vaske resterne af fødevarer med saltvand væk. (D) forsigtigt rive neglebånd fra hinanden uden at røre tarmen og andre indre organer. E) Anbring tarmen i saltvand ved efterfølgende procedure. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: anatomi af fordøjelseskanalen/tarmen. Tarmen ekstraheret fra Drosophila larve er opdelt i tre diskrete domæner af forskellig udviklingsmæssige oprindelse, nemlig fortarmen, midgut, og hindgut. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: farvning af tarm vævet med DHE. A) udarbejde en masterblanding, der indeholder vækstmedium og Dhe (en endelig koncentration på 30 μM). (B) Tilsæt masterblandingen i brønden af en dissektion disc. C) overføre det dissekterede tarm væv til brønden, der indeholder Dhe-masterblandingen. D) INKUBER ved rt i 5 minutter og Beskyt vævet mod lys vask 3x i PBS/saltvand i 5 min. (E) Fix i 4% PF i 10 min; vask vævet tre gange med PBS (valgfrit). (F) Overfør forsigtigt tarmen til en glas rutsjebane, læg den fladt uden at have noget væv foldet og monter med monterings medium, før der dækkes med dækglas. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7

Figur 7: ZnO NPs inducerer ros i tarmen af Drosophila larver. (a) Dhe bejdses i kontrol tarmen viser det basale niveau af ros. (b og c) behandlede tarmceller viser en gradvis stigning i Dhe-intensiteten på en dosisafhængig måde.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: kvantitering af fluorescerende billeder ved hjælp af ImageJ. (A) importere de optagne billeder. (B) Klik på Analysér menu og vælg Indstil målinger. C) vælge området integreret intensitet og den gennemsnitlige grå værdi. Vælg en region uden fluorescens for at indstille baggrunden. D) eksportere dataene til Excel og beregne ctcf for efterfølgende statistiske analyser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at vurdere om ZnO NP kan inducere apoptose i MRC5 fibroblaster, bruger vi flowcytometri til at skelne cellerne fra nekrotisk eller apoptotisk celledød. I normale levende celler, Phosphatidylserin (PS) er lokaliseret på cellemembranen. Hvis apoptose forekommer, er PS omplaceret til den ekstracellulære folder i plasma membranen, hvilket gør det muligt at binde Bilagin V mærket med fluorescein (FITC Bilagin V)29. På den anden side er det røde fluorescerende propidium kaliumiodid (PI), et nukleinsyre bindende farvestof, uigennemtrængeligt for levende celler og apoptotiske celler, men pletter døde celler30. Dette giver os mulighed for at identificere de døde celler (rød og grøn), apoptotiske celler (grøn fluorescens) og levende celler (ringe eller ingen fluorescens), ved hjælp af et flow flowcytometer med 488 nm linje af en argon-ion laser for excitation.

For DHE farvning af Drosophila Gut, er det vigtigt at rekonstruere farvestoffet med DMSO lige før du starter eksperimentet, som langvarig opbevaring kan føre til en auto-oxidation af farvestoffet, der forvandler farvestoffet til mørk/lilla farve31, 32. Desuden har de rekonstituerede stamopløsninger også en tendens til at udløbe ret hurtigt, så man skal være opmærksom på "udløbsdato". Alternativt kan fluorogene sonder som den grønne version af den foto stabile sonde, som har den ekstra evne til at være multiplexed med pletter, og producerer meget klarere signaler end DHE, anvendes. Den dissekeret tarm blev overført til Schneiders medium, der indeholdt farvestoffet i den ønskede koncentration uden nogen fikativ tilsætning. Dette er for at muliggøre inkorporering af farvestoffet i levende celler, og dermed farvning udføres i kulturmediet, for at give mulighed for bedre respiration af cellerne.

Med hensyn til kvantitation af DHE farvning, for en start, undgå mætning af pixels i kontrol ubehandlet celler. Imaging softwareprogrammet blev brugt til at bestemme eksponeringstid ved visuelt at udflagning mættede pixels. Den ubehandlede prøve blev anvendt til at fastsætte eksponeringstid og bevare de samme parametre ved optagelse af billeder til sammenligning af intensiteten på tværs af forskellige behandlingsgrupper, hvilket er vigtigt for kvantificering af fluorescens billed intensitet senere. Det er vigtigt at erhverve alle billeder (kontrol og behandlede prøver) ved hjælp af samme system og erhvervelse indstillinger/parametre, og baggrunden bør være standardiseret for alle billeder (så der er konsistens for baggrunds subtraktion)33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev støttet af tilskuds nummeret R706-000-043-490. Undersøgelsen repræsenterer ikke tilskuds sponsorens opfattelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15% Methyl 4-Hydroxybenzoate Sigma Aldrich
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Bacto Agar BD biosciences
cncCK6/TM3, Sb a gift from Dr. Kerppola T
Cornmeal, glucose, yeast brewer Sigma Aldrich
CyAn ADP with Summit Software DAKO https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihydroethidium (Hydroethidine) Thermo Fisher Scientific D11347
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD biosciences 556547
Fluorescent microscope Olympus
Glucolin Supermarket
ImageJ software NIH
MRC5 human lung fibroblast ATCC CCL-171
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fisher Scientific 21720-024
Vectashield antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO NIG-FLY
Zinc Oxide Nanoparticles Sigma Aldrich 721077 Refer Sheet 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
  2. Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
  3. Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
  4. De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
  5. Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
  6. Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
  7. Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
  8. Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
  9. Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
  10. Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
  11. Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
  12. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  13. Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
  14. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
  15. Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
  16. Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
  17. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  18. Jennings, B. H. Drosophila - a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
  19. Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
  20. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
  21. Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
  22. Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
  23. Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
  24. Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
  25. Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
  26. Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
  27. Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
  28. Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
  29. Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
  30. Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , Chapter 1 (2011).
  31. Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
  32. Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
  33. Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).

Tags

Immunologi og infektion zinkoxid nanopartikler toksicitet celledød oxidativt stress MRC5 celler Drosophila
Toksicitetsundersøgelse af zinkoxid nanopartikler i cellekultur og i <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ng, C. T., Ong, C. N., Yu, L. E.,… More

Ng, C. T., Ong, C. N., Yu, L. E., Bay, B. H., Baeg, G. H. Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e59510, doi:10.3791/59510 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter