Summary
Vi beskriver ett detaljerat protokoll för att utvärdera de toxikologiska profilerna av zinkoxidnanopartiklar (ZnO NPs) i synnerhet, vilken typ av celldöd i human MRC5 lung fibroblaster och ROS formation i bananfluga Drosophila.
Abstract
Zinkoxid nanopartiklar (ZnO NPs) har ett brett spektrum av tillämpningar, men antalet rapporter om ZnO NP-associerad toxicitet har vuxit snabbt under de senaste åren. Emellertid, studier som belyser de bakomliggande mekanismerna för ZnO NP-inducerad toxicitet är knappare. Vi bestämde toxicitetsprofilerna för ZnO NPs med hjälp av både in vitro-och in vivo-experimentella modeller. En signifikant minskning av cellernas lönsamhet observerades i ZnO NP-exponerade MRC5 lung fibroblaster, visar att ZnO NPs utöva cytotoxiska effekter. Likaså, intressant, Gut utsätts för ZnO NPs uppvisade en dramatisk ökning av reaktiva syreradikaler (ROS) i bananfluga Drosophila. Mer djupgående studier krävs för att fastställa en riskbedömning för ökad användning av ZnO NPs av konsumenter.
Introduction
Nanoteknik hänvisar till tillämpningen av nanosized material som används inom alla vetenskapliga områden, inklusive medicin, materialvetenskap, och biokemi. Till exempel, ZnO NPs som är kända för sin ultraviolett spridning, kemisk avkänning, och antimikrobiella egenskaper, samt hög elektrisk ledningsförmåga, utnyttjas i produktionen av olika konsumentprodukter såsom livsmedelsförpackningar, kosmetika, textilier, gummi, batterier, katalysator för bil svans gasbehandling, och biomedicinsk-relaterade tillämpningar1,2,3.
Emellertid, den spirande tillämpningar av ZnO NP-baserade produkter, vilket leder till ökad mänsklig exponering för ZnO NPs, har väckt farhågor om deras potentiella negativa effekter på människors hälsa. Ett antal in vitro cellulära studier har visat att ZNO NPS kan framkalla oxidativ stress, autofagi-relaterad cytotoxicitet, inflammation, och genotoxicitet4,5,6,7,8 . Särskilt, toxiciteten av ZnO NPs antas vara orsakad av upplösningen av Zn till fri Zn2 + joner, liksom ytan reaktivitet av ZnO, vilket resulterar i cellulära joniska och metaboliska obalanser som är förknippade med nedsatt jonisk homeostas och en hämning av jontransporten4,7,9,10. Viktigt, studier har visat att generationen av reaktiva syreradikaler (ROS) är en av de primära mekanismerna bakom ZnO NPs-associerad toxicitet. Otillräcklig anti-oxidativ aktivitet efter ROS förolämpning har visat sig vara ansvarig för framkalla cytotoxicitet och DNA-skador9. De toxiska effekterna av ZNO NPS har också rapporterats i djurmodeller, inklusive gnagare1, zebrafiskar11,12, samt ryggradslösa djur Drosophila13.
Drosophila fungerar som en väletablerad alternativ djurmodell för toxicitet screening av kemiska enheter och nanomaterial (NMS)14,15. Viktigt är att det finns höga nivåer av genetisk och fysiologisk likhet mellan människa och Drosophila som motiverar användningen av Drosophila som en in vivo-modell för utvärdering av biologiska svar på miljöföroreningar som NMS 16. Dessutom finns det många fördelar med att använda Drosophila på grund av dess ringa storlek, korta livslängd, genetiska amenability, och enkelt och kostnadseffektivt underhåll. Dessutom har Drosophila blivit allmänt antagen för studiet av genetik, molekylär-och utvecklingsbiologi, ända sedan hela genomet var fullständigt sekvenserat år sedan tillbaka i 2000, vilket gör det lämpligt för en mängd olika högpresterande screening och för att ta itu med olösta biologiska frågor17,18,19,20,21. Under de senaste åren har ett antal studier relaterade till immuntoxicitet med olika typer av NPS i Drosophila rapporterats15,22,23,24. Denna grundläggande nya kunskap som erhållits genom studierna med hjälp av Drosophila har bidragit till att ge mer insikt i vår förståelse av nanotoxikologin.
ROS är en välkänd boven i dramat för cytotoxicitet och genotoxicitet orsakad av NPs, i synnerhet metallbaserade NPs25. ROS är syrehaltiga kemiska arter med högre reaktiva egenskaper än molekyl syre. Fria radikaler såsom superoxid radikal (O2-) och även, icke-radikala molekyler såsom väteperoxid (H2O2) kan fungera som ros. Under normala fysiologiska tillstånd, de är skyldiga att upprätthålla cellulära homeostas26, dock, överdriven ros på grund av överproduktion eller dysreglering av antioxidant försvar kan orsaka oxidativ stress, vilket leder till skador på proteiner, lipider och deoxyribonukleinsyra (DNA)27. Till exempel, som ROS nivåer öka och glutation (GSH) nivå minskar samtidigt, störningar av adenosintrifosfat (ATP) syntes sker och laktatdehydrogenas (LDH) nivå ökar i mediet, som kulminerar i celldöd27.
Här tillhandahåller vi protokoll för att utföra cellulära och genetiska analyser med hjälp av odlade däggdjursceller och Drosophila för att fastställa de potentiella negativa effekterna av ZNO NPS. En översikt över den metod som används för toxicitetsstudien av ZnO NPs visas i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fluorescence aktiverad cell sortering (FACS) analys av levde/fasta celler
- Sonicate ZnO NPs i fjädring för 15 min.
- Förbered ZnO NPs vid olika koncentrationer (t. ex. 0, 10, 25, 50 100 och 200 μg/mL) med 1 mg/mL ZnO NP stamlösning för behandling av odlade celler.
- Utsäde MRC5 Human lung fibroblaster (1 x 105 celler/brunn) på en 6-brunn kultur tallrik en dag i förväg, och sedan behandla cellerna med 2 ml ZNO NPS (i tre exemplar) för 8 h, 16 h, och 24 h.
- Vid varje tidpunkt, samla in cellerna genom centrifugering vid 300 x g i 5 min.
- Tvätta cell pellets två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Omsuspendera cellerna med 1x bindningsbuffert, som består av 0,1 M HEPES/natriumhydroxid (NaOH), 1,4 M natriumklorid (NaCl) och 25 mM kalciumklorid (CaCl2), vid en koncentration av 1 x 105 celler per 100 μl.
- Tillsätt 5 μL fluorescein isotiocyanat (FITC) Annexin V Stain och 5 μL propidiumjodid JODID (PI) DNA-fläck, och inkubera cellerna i 15 minuter vid rumstemperatur (RT; 25 ° c) i mörker.
- Upp proverna med ytterligare 400 μL 1x bindningsbuffert innan cellerna sorteras efter flödescytometri. Minst 10 000 celler analyseras för varje prov.
- TABULERA stapeldiagrammet med hjälp av den erhållna median intensiteten.
2. exponering av ZnO NPs till Drosophila
- Tillsätt 1 mL nanopartiklar vid olika koncentrationer i flaskor, följt av 9 mL flugmat för att göra en slutlig koncentration på 0,1 mg/ml, 0,25 mg/mL eller 0,5 mg/mL ZnO NPs.
- Blanda nanopartiklarna med mat grundligt i injektionsflaskorna med hjälp av pipetten.
- Låt flyga mat som innehåller ZnO NPs svalna minst 2-3 h före användning.
- Introducera vuxna manliga och kvinnliga flugor i injektionsflaskorna i 5 dagar, och låta dem para sig och lägga ägg (som visas som vita fläckar) på ytan av maten.
- Ta bort föräldra flugor, och låta äggen att genomgå ytterligare utveckling, som består av 4 olika utvecklingsstadier (embryonal, larval, Pupp och vuxna skede).
3. dissektion av fluga
- Samla in sena 3RD INSTAR larver från väggen av flaskorna för analyser. Nyligen lagda ägg utvecklas normalt till sena 3RD INSTAR larver efter 72-120 h vid RT.
- Rengör dissektion skålen och fylla upp väl med dissektion medium/PBS.
- Dissekera larverna (sent 3RD INSTAR) under stereomikroskopet, med hjälp av ett par tång.
- Använd spetsen på tång för att göra ett litet hål och bryta öppna nagelbanden skiktet av larverna. Dra försiktigt ut tarmen och placera den i ett 1,5 mL microcentrifugerör som innehåller Schneiders Drosophila -medium, före infästnings steget med 1 ml 4% PARAFORMALDEHYD (PF).
- 3.5 fixera tarmen i PF i 10 minuter vid RT, för efterföljande experiment, såsom immunofärgning.
4. ROS-detektion med hjälp av Dihydroethidium (DHE) färgning
- Behandla larver med olika koncentrationer av ZnO NPs som beskrivs i steg 2,1.
- Efter dissektion av tarmen från 3RD INSTAR larver som beskrivs i avsnitt 3, inkubera tarmen i Schneiders Drosophila -medium vid RT innan vävnads färgning utförs. Lös upp 1 μL av DHE-färgämnet (från lager koncentrationen 30 mM) i 1 mL Schneider-medium, vilket gör en slutlig arbets koncentration på 10-30 μM DHE-färg.
- Inkubera tarmen i 5 min vid RT i mörker, och sedan tvätta tre gånger med Schneider ' s medium för varje 5 min.
- Fixera tarmen med 4% PF (valfritt steg) och montera tarmen på glas diabilder, med anti-Fade monteringsmedel som innehåller 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Ta bilder under ett konfokalmikroskop.
5. mäta fluorescens med ImageJ Software
- Importera de tagna fluorescensbilderna som erhållits med fluorescensmikroskopi eller mikroskopi med konfokal laserskanning i ImageJ-programvaran.
- Klicka på analysera -menyn och välj Ange mått.
- Välj utdatamått, till exempel områdes integrerad intensitet och medelvärde för grått värde.
- Klicka på mått.
- Välj en region utan fluorescens för att ställa in bakgrunden.
- Exportera data till Excel-kalkylbladet och Bestäm den korrigerade total cells fluorescens (CTCF) med hjälp av beräkningen som visas nedan.
CTCF = integrerad densitet-(område av vald cell X Medelfluorescensen av bakgrunds avläsningar) - Konstruera ett stapeldiagram och utföra statistisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NP-exponerade celler behandlades med cell färgning reagens kit, följt av cell sortering med flödescytometri. ZnO NP-behandlade celler (botten, höger panel) uppvisar en högre andel av tidiga (R3)/sena apoptotiska celler (R6) än kontrollceller (R5, botten, vänster panel). Nekrotisk celldöd betecknas med R4 (övre, högra panelen) (figur 2). Resultaten av FITC/Annexin V-analysen på ZnO NP-behandlade fibroblaster i MRC-5 visas i figur 2.
För Drosophila experiment, sonicated ZNO NPS vid olika koncentrationer lades till flyga mat i 10 ml rör och sedan blandas väl med hjälp av en pipett Controller (figur 3). Sena tredje INSTAR larver som samlats in från injektionsflaskor dissekeras under stereomikroskop. Larverna tvättades först för att avlägsna rester av kvarvarande föda (figur 4). Det yttre nagelbands skiktet revs isär för att exponera inre organ. Tarmen identifierades av det karakteristiska långa och semitransparenta utseendet (medan andra organ verkar ogenomskinliga och ljusgulaktiga under mikroskopet) (figur 5). Tarmen togs försiktigt bort, utan att bryta, och överföras till en ny microcentrifug rör som innehåller fixativ på is (figur 6).
För kvantifiering av fluorescensintensitet, såsom intensiteten hos DHE-sonden i tarmen, exporterades bilderna i JPEG-eller TIFF-format och öppnades med ImageJ-programvaran. Den del av tarmen för analys valdes och identifierades, till exempel, midgut eller hindgut regionen, och fluorescensintensiteten i regionen av intresse (ROI) mättes. För att jämföra de olika försöks gruppernas relativa intensitet använde vi samma kvantitativa konfokalmikroskopi-metod som beskrevs i föregående avsnitt. För jämförelse av fluorescensintensiteter har parametern ställts in med den negativa obehandlade kontrollen. Beräkningar av signalintensiteten på grundval av kalibrerings intensiteter av obehandlad kontroll möjliggjorde en direkt jämförelse mellan olika experimentella grupper. Figur 7 visar den genomsnittliga intensiteten av DHE signalen i 3RD INSTAR larv Gut utsätts för ZNO NPS vid olika koncentrationer. Tarmen av larver som behandlades med 0,5 mg/mL av ZnO NP-behandling visade den högsta fluorescensintensiteten.
Skillnaderna i relativa intensiteter mellan alla experimentella grupper var ytterligare i tabellform och statistisk analys utfördes, vilket gav både kvalitativa och kvantitativa resultat (figur 8).
Figur 1: översikt över den metod som används för toxicitetsstudier av ZNO NPS. För in vitro-arbete, ZnO NP-behandlade celler färgas före flödescytometri analys. För in vivo arbete dissekeras tarmen från 3RD INSTAR larver, följt av färgning med DHE Dye och bild förvärv. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: dot Plot av celler separerade i olika populationer baserat på deras FITC och PE färgning. Piktogrammen visar resultatet av FITC/Annexin V-analysen med 24 h behandling av ZnO-NPs på MRC-5. Statistisk analys av cellerna vid olika stadier kan sedan utföras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: beredning av ZNO NP-innehållande flugmat medium. (A) ingredienser för flugmat tillsätts till vatten, får svällas och kokas i 5 min. (B) efter kylning ner till 50 ° c under omrörning, nipagin tillsätts och blandas grundligt. C) förbereda en Mastermix för nanopartiklarna (sammanlagd volym på högst 10% av den slutliga livsmedels volymen). (D) medium är sedan aliciterat, blandat med ZNO NPS vid olika koncentrationer och får svalna helt före lagring. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: hela tarm dissektionens procedur. (A) överför 3RD INSTAR larver till en dissekering skiva. (B) Använd pincett för att försiktigt hålla en larv, och (C) tvätta bort resterna av mat med saltlösning. (D) försiktigt riva nagelbanden isär utan att vidröra tarmen och andra inre organ. E) Placera tarmen i saltlösning för efterföljande ingrepp. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: magtarmkanalens anatomi/tarm. Tarmen som utvinns ur Drosophila larv är uppdelad i tre diskreta domäner av olika utvecklingsursprung nämligen foregut, midgut, och hindgut. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: färgning av Tarmvävnaden med DHE. A) förberedaen Mastermix som innehåller odlingssubstrat och DHE (en slutkoncentration på 30 μm). (B) Lägg till Mastermixen i brunnen för en dissekera skiva. (C) överför den dissekerade Tarmvävnaden till brunnen som innehåller DHE Master Mix. DInkubera vid RT i 5 minuter och skydda vävnaden från ljus, Tvätta 3x i PBS/saltlösning i 5min. (E) Fix i 4% PF för 10 min; Tvätta vävnaden tre gånger med PBS (tillval). (F) försiktigt överföra tarmen till en glasplatta, låg Plant utan att ha någon vävnad hopfälld och montera med monteringsmedel innan du täcker med täckglas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: ZnO NPS inducerar ros i tarmen av Drosophila larver. (a) DHE fläcken i kontroll Gut visar den basala nivån av ros. (b och c) behandlade tarmceller visar en gradvis ökning av DHE-intensiteten på ett dosberoende sätt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: kvantifiering av fluorescerande bilder med ImageJ. (A) importera de tagna bilderna. (B) Klicka på analysera -menyn och välj ange mätningar. (C) Välj den Area-integrerade intensiteten och det genomsnittliga gråvärdet. Välj en region utan fluorescens för att ställa in bakgrunden. Dexportera uppgifterna till Excel och beräkna ctcf för efterföljande statistisk analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att bedöma om ZnO NP kan inducera apoptos i MRC5 fibroblaster, använder vi flödescytometri för att särskilja cellerna från nekrotisk eller apoptotisk celldöd. I normala levande celler, Fosfatidylserin (PS) är lokaliserad på cellmembranet. Om apoptos inträffar, är PS transplacerad till den extracellulära broschyren av plasmamembranet, vilket gör att bindningen av Annexin V märkt med fluorescein (FITC Annexin V)29. Å andra sidan, den rödfluorescerande propidiumjodid jodid (PI), en nukleinsyra bindande färgämne, är ogenomtränglig för levande celler och apoptotiska celler men fläckar döda celler30. Detta gör det möjligt för oss att identifiera de döda cellerna (röda och gröna), apoptotiska celler (grön fluorescens) och levande celler (liten eller ingen fluorescens), med hjälp av en flödescytometer med 488 nm linje av en argon-Ion laser för excitation.
För DHE färgning av Drosophila tarmen, är det viktigt att rekonstituera färgämnet med DMSO precis innan du börjar experimentet, eftersom långvarig lagring kan leda till en automatisk oxidation av färgämnet som förvandlar färgämnet till mörk/lila färg31, 32. Dessutom tenderar de rekonstituerade Stamlösningarna också att löpa ut ganska snabbt, så man måste uppmärksamma "utgångsdatum". Alternativt kan fluorogena sonder som den gröna versionen av den foto stabila sonden, som har den extra förmågan att multiplexeras med fläckar, och ger mycket tydligare signaler än DHE, användas. Den dissekerade tarmen överfördes till Schneiders medium som innehöll färgämnet vid den önskade koncentrationen utan tillsats av fixativ. Detta för att möjliggöra införlivandet av färgämnet i levande celler, och därmed färgning utförs i odlingsmediet, för att möjliggöra bättre andning av cellerna.
När det gäller kvantifiering av DHE färgning, till en början, undvika mättnad av pixlarna i kontroll obehandlade celler. Bildhanteringsprogrammet användes för att fastställa exponeringstiden genom att visuellt flagga mättade pixlar. Det obehandlade provet användes för att ställa in exponeringstiden och bibehålla samma parametrar vid avbildning för jämförelse av intensiteten i olika behandlingsgrupper, vilket är viktigt för att kvantifiera fluorescensbildens intensitet senare. Det är viktigt att förvärva alla bilder (kontroll och behandlade prover) med samma system och förvärvs inställningar/parametrar, och bakgrunden bör standardiseras för alla bilder (så att det finns konsistens för bakgrunden subtraktion)33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Studien stöddes av bidrags numret R706-000-043-490. Studien representerar inte bidrags sponsorns uppfattning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| Cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| ImageJ software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
References
- Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
- Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
- Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
- De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
- Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
- Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
- Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
- Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
- Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
- Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
- Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
- Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
- Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Jennings, B. H. Drosophila - a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
- Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
- Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
- Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
- Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
- Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
- Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
- Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
- Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
- Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
- Marino, G., Kroemer, G.
- Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , Chapter 1 (2011).
- Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
- Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
- Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).
