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方法文章

利用荧光Sumo捕获蛋白定位SUMO化修饰蛋白

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DOI：

10.3791/59576

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2019年4月27日

 ,  ,  , 
1Integrated Science Center, Biology Department, College of William & Mary

本文内容

摘要

SUMO 是一种必需且高度保守的小分子泛素样修饰蛋白。本实验方案描述了利用一种耐受应激的重组 SUMO 捕获蛋白（kmUTAG）来可视化多种细胞类型中天然的、未标记的 SUMO 共价结合物及其亚细胞定位。

摘要

本文介绍一种研究哺乳动物细胞和线虫卵母细胞中蛋白质SUMO化修饰及其亚细胞定位的新方法。该方法利用一种来自耐受胁迫的酵母克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）的Ulp1 SUMO蛋白酶衍生的重组修饰型SUMO捕获蛋白片段kmUTAG。我们已将kmUTAG的特性优化，用于在多种模式系统中研究SUMO化过程，且无需使用抗体。与基于抗体的方法相比，KmUTAG在SUMO研究中具有多项优势：这种耐受胁迫的SUMO捕获试剂可通过重组方式生产，能够识别多种物种中的天然SUMO异构体，并且与市售抗体不同，其对游离的、未结合的SUMO具有较低的亲和力。本文展示的代表性结果包括SUMO偶联物在哺乳动物体外培养细胞和线虫卵母细胞中的定位情况。

引言

本方法旨在利用重组的SUMO捕获蛋白UTAG（Ulp结构域Tag），促进对SUMO化修饰蛋白的研究与分析。如下文所述，UTAG可替代其他试剂和方法，用于纯化、检测和可视化SUMO修饰蛋白。根据不同的生长条件，细胞中可能存在数百至数千种被SUMO或SUMO链修饰的蛋白（综述见Kerscher等，20061 和 Kerscher，20162）。这为特定SUMO化蛋白的功能分析带来了显著困难，尤其是因为某一特定底物蛋白中仅有部分分子实际发生了SUMO化修饰3。除了在转录调控、蛋白质稳态、细胞应激反应以及有丝分裂和减数分裂期间的染色质重塑等基本细胞过程中发挥重要作用外，目前已有充分证据表明，SUMO、SUMO修饰蛋白及SUMO通路组分在癌症和神经退行性疾病等病理过程中也具有作为生物标志物的潜力4,5,6,7。这凸显了开发稳健、可靠且易于获取的工具以及创新性方法的迫切需求，以实现对多种细胞和样本中SUMO修饰蛋白的检测与功能分析。

在许多系统中，SUMO 特异性抗体是检测、分离和功能分析 SUMO 修饰蛋白的首选试剂8,9。然而，一些 commercially available SUMO 特异性抗体价格昂贵、数量或供应有限，容易表现出显著变化的亲和力和交叉反应性，且在某些情况下缺乏可重复性10。另一种替代方法是在转化细胞和生物体中表达带有表位标签的 SUMO，但将表位标签连接到 SUMO 可能人为降低其与靶蛋白的偶联效率11。此外，当研究未转化的细胞或组织时，表位标签则无法发挥作用。

Ulp1 是一种来自 S. cerevisiae 的保守 SUMO 蛋白酶，既能加工 SUMO 前体，也能去除 SUMO 修饰蛋白上的 SUMO12。我们开发 UTAG 试剂的灵感源于一个偶然发现：Ulp1 的 SUMO 加工 Ulp domain（UD）中催化半胱氨酸（C580S）的突变不仅可阻止 SUMO 的切割，还能以高亲和力捕获 SUMO 修饰的蛋白12。为简便起见，我们将这一羧基末端的 SUMO 捕获片段 Ulp1(C580S) 称为 UTAG（即 UD TAG 的缩写）。UTAG 是一种重组型广谱 SUMO 捕获蛋白，可作为抗 SUMO 抗体的有效替代品，用于 SUMO 修饰蛋白的分离与检测。重要的是，它特异性识别天然构象的共价结合 SUMO，而不仅仅识别 SUMO 上的一个或多个表位。为了提高 UTAG 的蛋白稳定性及其与 SUMO 的结合能力，我们从耐逆境酵母 Kluyveromyces marxianus（Km）中构建了 UTAG 的一种变体，即 KmUTAG。KmUTAG 以纳摩尔级亲和力紧密结合 SUMO 修饰物13。此外，KmUTAG 对高温（42 °C）、还原剂（5 mM TCEP - 盐酸三（2-羧乙基）膦）、变性剂（最高 2 M 尿素）、氧化剂（0.6% 过氧化氢）以及非离子型去垢剂均具有抗性。这种耐逆性在严苛的纯化条件和长时间孵育过程中尤为有利，可确保其稳定性和 SUMO 捕获活性。然而，不出所料，KmUTAG 的 SUMO 捕获活性与半胱氨酸修饰试剂、离子型去垢剂以及完全变性的蛋白提取物不相容。KmUTAG 所表现出的卓越亲和力和理化特性表明，该试剂有望成为研究多种物种中 SUMO 化蛋白的标准工具之一。

本文提供了一种利用重组荧光mCherry-KmUTAG融合蛋白（kmUTAG-fl）在哺乳动物细胞和线虫中检测SUMO化修饰蛋白的简便方法。

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方案

1. 使用重组 KmUTAG-FL SUMO 捕获蛋白在固定组织培养细胞中检测 SUMO

  1. 在6孔细胞培养板中，将所选的细胞培养于22 mm圆形盖玻片上，直至细胞融合度达到70%–80%。步骤1.2–1.8均在6孔板中进行。
  2. 用1 mL DPBS（Dulbecco磷酸盐缓冲液）短暂清洗细胞。
  3. 固定时，配制新鲜的4%多聚甲醛（PFA）溶液（用DPBS稀释）。向每孔加入2 mL 4% PFA的DPBS溶液以固定细胞，在室温下孵育20分钟。注意：所有使用PFA的操作均应在实验室安全通风橱中进行，且PFA废液必须妥善处理。
  4. 在摇床上用1 mL DPBS对固定后的细胞清洗3次，每次5分钟。
  5. 为使细胞通透，加入含0.1% Triton X-100的DPBS溶液，孵育15分钟。
  6. 在摇床上用1 mL DPBS清洗细胞3次，每次5分钟。
  7. 加入500 µL 0.1 M Glycine-HCl（pH 2.0）孵育10秒，随后立即加入500 µL 10× SUMO蛋白酶缓冲液（SPB）中和pH值。
  8. 在摇床上用1 mL DPBS清洗细胞3次，每次5分钟。
  9. 将盖玻片从孔中取出，置于湿盒中。随后在盖玻片上进行以下孵育步骤：
    1. 仅用于UTAG-fl染色：在离心管中将1 µg UTAG-fl与含5 mM TCEP的100 µL 1× SPB混合，将混合液滴加至盖玻片上的细胞，于湿盒中室温孵育1小时。
    2. 可选：若需进行UTAG-FL与抗SUMO1抗体共染色，请按以下步骤操作：
      1. 在离心管中将1 µg UTAG-FL与0.5 µL SUMO2/3 8A2（购自发育研究杂交瘤库9）加入100 µL封闭缓冲液中混合，将混合液滴加至盖玻片，室温孵育1小时。
      2. 用200 µL DPBS在盖玻片上清洗细胞3次，每次5分钟。
      3. 在离心管中将0.5 µL Alexa Fluor 488标记的抗小鼠二抗与100 µL封闭缓冲液混合，将混合液滴加至盖玻片，室温孵育1小时。
  10. 清洗盖玻片：向每张盖玻片上滴加200 µL DPBS，静置10分钟，重复此清洗步骤共3次。
  11. 从最后一次清洗液中取出盖玻片，将其细胞面朝下倒置在预先清洁的载玻片上，滴加一滴封片介质（参见材料表）。
  12. 在-20°C冰箱中过夜保存，然后在显微镜下观察。使用适当的滤光片组合观察DAPI（DNA）、Texas Red（kmUTAG-fl）以及Alexa Fluor 488（如进行了可选的SUMO2/3共染色）。

2. 使用 UTAG-fl 在固定线虫性腺中检测 SUMO

  1. 将成年雌雄同体线虫转移至已涂覆多聚-L-赖氨酸的正电荷载玻片上的 8 µL 卵缓冲液液滴中14。使用 27.5 G 针头释放线虫的性腺。随后进行抗体标记或 UTAG-fl 标记。
  2. 对于抗体标记样品，按以下步骤操作：
    1. 在液氮中进行冷冻裂解，然后在 Coplin 染色缸中用 -20 °C 的甲醇固定过夜。
    2. 在 Coplin 染色缸中用 1x PBS 洗涤载玻片 3 次，随后在含 0.5% BSA 和 0.1% Tween 20 的 PBS 中封闭 20 分钟。
    3. 向每张载玻片上的样本加入 30 µL 抗 SUMO 6F2 抗体（1:10），覆盖样本。在 4 °C 湿度箱中孵育过夜。
      注意：SUMO 6F2 抗体购自发育研究杂交瘤库15。
    4. 在 Coplin 染色缸中用 1x PBS 洗涤载玻片 2 分钟，然后覆盖样本并加入 30 µL DyLight 488 标记的山羊抗小鼠二抗（1:200），在室温湿度箱中孵育 1.5 小时。
    5. 在 Coplin 染色缸中用 1x PBS 洗涤载玻片 2 分钟，快速浸入 dH2O 中一次，然后用封片剂封片（参见 材料表）。
  3. 对于 KmUTAG-fl 标记，按以下步骤操作：
    1. 为固定细胞，向样本中加入 1 体积的 8% 戊二醛（PF），使终浓度为 4% PF。在湿度箱中固定 10 分钟，然后将载玻片转移至含 0.1 M 甘氨酸的 1x PBS Coplin 染色缸中，淬灭反应至少 5 分钟。
    2. 在 Coplin 染色缸中用 1x PBS 洗涤细胞 5 分钟，然后在含 0.1% Triton-X 的 1x PBS 中透化 10 分钟。
    3. 在 Coplin 染色缸中用 1x PBS 洗涤至少 5 分钟，然后向载玻片上的样本加入 200 µL 0.1 M 甘氨酸-盐酸（pH = 2.0）处理 10 秒。立即加入 200 µL 10x SPB 以中和 pH。
    4. 在 Coplin 染色缸中用 1x PBS 洗涤载玻片 5 分钟。
    5. 将载玻片从洗涤液中取出，用移液器向载玻片上的线虫样本加入 100 µL 含 2 µg UTAG-fl 的 1x SPB + 5 mM TCEP 溶液，在湿度箱中孵育 1 小时，不摇动。
    6. 将载玻片放回 Coplin 染色缸，用 1x PBS 洗涤 15 分钟。
    7. 将载玻片从洗涤液中取出，用实验室擦拭纸擦干样本周围液体，然后加入 5 µL 封片剂封片（参见 材料表）。将载玻片于 4 °C 保存。使用适用于 DAPI（DNA）、Texas Red（kmUTAG-fl）和 DyLight 488（SUMO2/3）的相应滤光片组进行观察。

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结果

KmUTAG-fl 是一种重组的、带有 mCherry 标签的 SUMO 捕获蛋白。为制备 kmUTAG-fl，我们将密码子优化的 mCherry-kmUTAG 克隆至 pSPOT1 细菌过表达质粒中（图1）。诱导表达后，利用 Spot-TRAP 纯化 kmUTAG-fl 蛋白，洗脱并冻存以备后续使用。为验证 KmUTAG-fl 的 SUMO 捕获活性，我们确认了其与 SUMO1 偶联磁珠的结合能力以及对 SUMO-CAT 融合蛋白的沉淀作用（数据未显示，但可参见先前研究13）。

在使用Epifluorescent Zeiss Axioplan显微镜（配备适当的滤光片组（Chroma）和100倍油镜）观察时，与固定的PNT2细胞共孵育的KmUTAG-fl显示出明显的细胞核染色（图2－右上...

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讨论

本文介绍了重组蛋白kmUTAG-fl在固定哺乳动物细胞和分离的线虫性腺中进行SUMO功能研究的应用。kmUTAG-fl是一种耐受应激的广谱特异性SUMO试剂，能够识别并捕获天然的SUMO结合蛋白及SUMO链。由于SUMO的三级结构高度保守，因此极有可能利用kmUTAG-fl试剂分析更多模式及非模式生物系统中的SUMO变体。因此，kmUTAG-fl可能作为传统抗体染色方案的一种有效替代或辅助试剂。

使用非抗体替代物已有充分先例，包括用于碳水化合物检测的凝集素，以及用于体内蛋白质标记的适配体核苷酸和亲和体多肽16,17,18,19。此外，已有研究开发出可结合SUMO并阻断其与其他蛋白上SUMO相互作用基序（SIMs）结合的亲和体和单体抗体18,

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披露

重组kmUTAG试剂通过Kerafast.com提供给科研界。

致谢

我们感谢Kerscher实验室所有成员的支持，感谢Nathalie Nguyen对稿件的审阅，以及Lidia Epp提供的测序服务。本工作得到了弗吉尼亚州共同研究商业化基金（MF16-034-LS）对OK的资助。W&M学生的科研支持由Bailey-Huston研究基金以及授予RY和CH的Charles Center荣誉奖学金提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% 多聚甲醛（甲醛）水溶液Electron Microscopy Sciences30525-89-4
6 孔细胞培养板Genesee Scientific/Olympus Plastics25-105
Alexa Fluor 488 标记的 AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-545-003用作小鼠单克隆抗体的二抗
不含钙、镁的 DPBSFisher ScientificGibco 14190144
Dylight 488 标记的 AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-485-146用作小鼠单克隆抗体的二抗
Fisherbrand 生长盖玻片用盖玻片Fisherbrand12545101
含 DAPI 的 FLUORO-GEL IIElectron Microscopy Sciences50-246-93)步骤 1.11 中的封片剂
含 DABCO 的 FLUORO-GELElectron Microscopy Sciences17985-02添加 DAPI 至 1 µg/mL；步骤 2.2.5 中的封片剂
甘氨酸-盐酸Fisher BioReagentsBP3815
甘氨酸-盐酸ACROS Organics6000-43-7
KmUTAG-flKerafastKmUTAG 试剂可在 Kerafast.com 获取
Oneblock Western-CL 封闭缓冲液Prometheus20-313
PBS，磷酸盐缓冲液，10X 溶液Fisher BioReagentsBP3994
PNT2 细胞系Sigma-Aldrich95012613经 SV40 永生化的正常前列腺上皮细胞。
pSPOT1(ChromoTek GmbH)ev-1https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2DSHBSUMO 6F2SUMO 6F2 由 Pelisch, F. / Hay, R.T. 惠赠并存入 DSHB（DSHB 杂交瘤产品 SUMO 6F2）
SUMO 蛋白酶缓冲液 [10x]500 mM Tris-HCl，pH 8.0，2% NP-40，1.5 M NaCl
SUMO-2 抗体 8A2DSHBSUMO-2 8A2SUMO-2 8A2 由 Matunis, M. 惠赠并存入 DSHB（DSHB 杂交瘤产品 SUMO-2 8A2）
TCEP-盐酸GoldBio51805-45-9用作浓度为 5 mM 的还原剂
Triton X-100Fisher BioReagents9002-93-1用于线虫在 DPBS/PBS 中以 0.1% 浓度进行透化处理

参考文献

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