Summary
सूमो एक आवश्यक और अत्यधिक संरक्षित, छोटे ubiquitin की तरह संशोधक प्रोटीन है । इस प्रोटोकॉल में हम एक तनाव-सहिष्णु पुनः संयोजक सूमो-फंसाने प्रोटीन के उपयोग का वर्णन कर रहे है (kmUTAG) के लिए देशी, untagged सूमो conjugates और सेल प्रकार की एक किस्म में उनके स्थानीयकरण कल्पना ।
Abstract
यहाँ हम स्तनधारी कोशिकाओं और सूत्रकृमि ओयोसाइट्स में प्रोटीन के sumoylation और उनके उप सेलुलर स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए एक उपंयास विधि प्रस्तुत कर रहे हैं । इस विधि एक पुनः संयोजक संशोधित सूमो-फंसाने प्रोटीन टुकड़ा, kmutag, तनाव सहिष्णु उभरते खमीर kluyveromyces marxianusके Ulp1 SUMO प्रोटीज से व्युत्पंन का उपयोग करता है । हम एंटीबॉडी के उपयोग के बिना मॉडल सिस्टम की एक किस्म में sumoylation अध्ययन के उद्देश्य के लिए kmUTAG के गुणों को अनुकूलित किया है । सुमो के अध्ययन के लिए, KmUTAG कई लाभ जब एंटीबॉडी आधारित दृष्टिकोण की तुलना में है । यह तनाव सहिष्णु सूमो-ट्रैपिंग अभिकर्मक पुनः संयोजक उत्पादन किया जाता है, यह कई प्रजातियों से देशी सूमो isoforms पहचानता है, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के विपरीत यह मुक्त, असंसंयुग्मित सूमो के लिए कम आत्मीयता से पता चलता है । प्रतिनिधि परिणाम यहां दिखाया गया है स्तनधारी ऊतक संस्कृति कोशिकाओं और सूत्रकृमि oocytes में सूमो conjugates का स्थानीयकरण शामिल हैं ।
Introduction
इस विधि का उद्देश्य रीकॉम्पानेंट सूमो-ट्रैपिंग यूटैग (ULp डोमेन टैग) प्रोटीन का उपयोग करके सूमो-संयुग्मित प्रोटीनों के अध्ययन और विश्लेषण को सुगम बनाना है । के रूप में नीचे विस्तृत, UTAG अंय अभिकर्मक और दृष्टिकोण के एवज में इस्तेमाल किया जा सकता को शुद्ध, पता लगाने, और सूमो-संशोधित प्रोटीन कल्पना । वृद्धि की स्थिति के आधार पर, कोशिकाओं सैकड़ों या हजारों प्रोटीन है कि सूमो या सूमो जंजीरों के साथ संशोधित कर रहे हैं (समीक्षा के लिए देख Kerscher एट अल. २००६1 और kerscher २०१६2) शामिल हो सकते हैं । यह विशिष्ट सूमो के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक काफी कठिनाई का प्रतिनिधित्व करता है-संशोधित प्रोटीन, विशेष रूप से केवल एक विशेष sumoylation लक्ष्य का एक अंश वास्तव में3संशोधित किया गया है । आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाओं में अपनी भूमिकाओं के अलावा, जैसे कि ट्रांसक्रिप्शनल नियमन, प्रोटीन homeostasis, सेलुलर तनाव के लिए प्रतिक्रिया, और मिटोसिस और अर्धसूत्रण के दौरान क्रोमेटिन remodeling; अब यह पर्याप्त रूप से स्पष्ट हो गया है कि सूमो, सूमो-संशोधित प्रोटीनों और सूमो पाथवे के घटकों में भी कैंसर और न्यूरोडिजेनेरेटिव विकारों के रूप में विकृतियों के लिए biomarkers के रूप में क्षमता4,5,6 ,7. यह विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और नमूनों में सुमो-मोडीफाइड प्रोटीनों की पहचान और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए मजबूत, विश्वसनीय, और आसानी से उपलब्ध उपकरणों और नवीन दृष्टिकोणों की आवश्यकता को रेखांकित करता है ।
कई प्रणालियों में, सूमो-विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाने, अलगाव और सूमो-संशोधित प्रोटीन8,9के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए पसंद के अभिकर्मक हैं । हालांकि, कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सूमो-विशिष्ट एंटीबॉडी महंगे हैं, मात्रा या उपलब्धता में सीमित, बेतहाशा परिवर्तनशील बंधुता और पार-reactivity प्रदर्शन करने के लिए प्रवण, और कुछ उदाहरणों में reproducibility की कमी10. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण epitope की अभिव्यक्ति-बदल कोशिकाओं और जीवों में सूमो टैग की गई है, लेकिन epitope टैग सूमो को जोड़ने कृत्रिम रूप से प्रोटीन लक्ष्य11के लिए अपनी संयुग्मन कम हो सकता है । इसके अतिरिक्त, epitopes उपयोगी नहीं है जब untransformed कोशिकाओं या ऊतकों का मूल्यांकन कर रहे हैं ।
Ulp1 एस सेरेविसिए से एक संरक्षित सूमो प्रोटीज है कि दोनों सूमो अग्रदूत और desumoylates सूमो-संयुग्मित प्रोटीन12प्रक्रियाओं । हम का विकास UTAG अभिकर्मक serendipitous अवलोकन पर आधारित है कि उत्प्रेरक Cysteine के एक उत्परिवर्तन (C580S) में Ulp1's सूमो प्रसंस्करण यूएलपी डीomain (यूडी) न केवल सूमो दरार से बचाता है, लेकिन यह भी जाल सूमो-संयुग्मित प्रोटीन के साथ उच्च उत्सुकता12। सरलता के लिए, हमने इस कार्बोक्सी-टर्मिनल सूमो-ट्रैपिंग Ulp1 (C580S) खंड को यूटैग (यूडी टैग के लिए शॉर्ट) के रूप में संदर्भित किया है । Utag एक पुनः संयोजक पैन-सूमो फंसाने प्रोटीन है कि विरोधी के लिए एक उपयोगी विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है सूमो-आइसोलेशन और सूमो संशोधित प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी । महत्वपूर्ण बात, यह विशेष रूप से पहचानता-तह, संयुग्मित सूमो और सूमो पर न सिर्फ एक या कई epitopes । UTAG के प्रोटीन स्थिरता और सूमो बाध्यकारी शक्ति दोनों में सुधार करने के लिए, हम तनाव सहिष्णु खमीर Kluyveromyces marxianus (किमी) से utag के एक संस्करण उत्पंन । के------------------------ इसके अतिरिक्त, kmUTAG ऊंचा तापमान (४२ डिग्री सेल्सियस) के लिए प्रतिरोधी है, एजेंटों (5 मिमी TCEP-Tris (2-carboxyethyl) फॉसफिन हाइड्रोक्लोराइड), denaturants (अप करने के लिए 2 एम यूरिया), ऑक्सीकरण एजेंटों (०.६% हाइड्रोजन पेरोक्साइड), और गैर-आयनिक डिटर्जेंट । यह तनाव सहिष्णुता कठोर शुद्धि हालत और लंबे समय तक ऊष्मायन समय, अपनी स्थिरता और सूमो-फंसाने गतिविधि को सुनिश्चित करने के दौरान फायदेमंद है । आश्चर्य की बात नहीं है, तथापि, है KmUTAG सूमो-फंसाने गतिविधि cysteine-संशोधित अभिकर्मकों, ईओण डिटर्जेंट और पूरी तरह से विकृत प्रोटीन के अर्क के साथ असंगत है । उल्लेखनीय समानता और KmUTAG के गुण संकेत मिलता है कि इस अभिकर्मक कई प्रजातियों में sumoylated प्रोटीन के अध्ययन के लिए मानक प्रदर्शनों की सूची का हिस्सा बन सकता है ।
यहां हम एक पुनः संयोजक फ्लोरोसेंट mCherry-के---------------------------------------------------------
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Protocol
1. पुनः संयोजक KmUTAG-FL सूमो-फंसाने प्रोटीन का उपयोग कर निश्चित ऊतक संस्कृति कोशिकाओं में सूमो का पता लगाने
- ऊतक के विकास की कोशिकाओं को विकसित 22 मिमी दौर कवर पर 6-well टीसी प्लेटों में फिसल जाता है जब तक 70%-80% संगम । चरण 1.2 – 1.8 6-well प्लेट में निष्पादित करें ।
- DPBS के 1 मिलीलीटर (डलबेस्को फॉस्फेट-बफ़र्ड नमकीन) के साथ कक्ष संक्षेप में धोएं
- निर्धारण के लिए, 4% पैराफार्मलेडिहाइड (पीएफए) समाधान (डीपीबीएस में पतला) का एक नया समाधान तैयार करें । कक्षों को ठीक करने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से DPBS में 2 मिलीलीटर 4% पीएफए जोड़ें । कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते । नोट: पीएफए का उपयोग करते हुए सभी कदम एक प्रयोगशाला सुरक्षा हुड में किया जाना चाहिए और पीएफए सही ढंग से निपटारा किया जाना चाहिए ।
- 1 मिलीलीटर DPBS में फिक्स्ड सेल 3x धोने जबकि थाली, 5 मिनट प्रत्येक धोने nutating ।
- कोशिकाओं permeabilize करने के लिए, ०.१% Triton एक्स के साथ 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट-DPBS में १००
- 1 मिलीलीटर DPBS में 3x कोशिकाओं को धोने जबकि थाली, 5 मिनट प्रत्येक धोने nutating
- 10 एस के लिए ०.१ एम Glycine-एचसीएल (पीएच २.०) के ५०० μL के साथ कोशिकाओं को सेते, तो 10x सूमो Protease बफर (SPB) के ५०० μL के साथ तुरंत पीएच बेअसर ।
- 1 मिलीलीटर DPBS में कोशिकाओं 3x धो जबकि nutating प्लेट, 5 प्रत्येक धोने मिनट
- कोवरलिप्स को कुएं से निकाल कर आर्द्रता कक्ष में रखें । तो coverslip पर इस प्रकार के रूप में इनक्यूबिशन्स के साथ आगे बढ़ें:
- Utag के लिए-fl केवल धुंधला: एक ट्यूब में 5 मिमी tcep युक्त 1x spb के १०० μl के साथ 1 माइक्रोग्राम utag-fl मिक्स, coverslip पर कोशिकाओं पर मिश्रण पिपेट, और आर्द्रता चैंबर में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेबेट.
- वैकल्पिक रूप से, के लिए UTAG-FL और विरोधी SUMO1 एंटीबॉडी सह धुंधला, निम्नलिखित के साथ आगे बढ़ें:
- एक ट्यूब में मिक्स 1 माइक्रोग्राम utag-FL और ०.५ μl SUMO2/3 8a2 (विकास के अध्ययन के लिए प्राप्त की १००μl बैंक ब्लॉकिंग बफर, coverslip पर मिश्रण पिपेट, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान में सेते ।
- २०० μL DPBS, 5 मिनट प्रत्येक धोने के साथ 3 बार coverslip पर कोशिकाओं को धो.
- एक ट्यूब में मिक्स ०.५ μl विरोधी माउस Alexa fluor ४८८ संयुग्मित एंटीबॉडी १०० μl अवरुद्ध बफर के साथ, coverslip पर मिश्रण पिपेट, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान में सेबेट ।
- एक coverslips पर coverslips, पिपेट २०० μL DPBS धोने के लिए और 10 मिनट के लिए जगह में छोड़ दें । 2 अधिक बार धोने दोहराएं ।
- पिछले धोने से coverslip निकालें और बढ़ते माध्यम की एक बूंद के साथ एक पूर्व साफ माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर इसे पलटो ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
- माइक्रोस्कोप के नीचे देखने से पहले एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रात भर स्टोर । कल्पना DAPI (डीएनए), टेक्सास लाल (kmUTAG-fl) के लिए उपयुक्त फिल्टर सेट का उपयोग कर, और Alexa Fluor ४८८ (यदि वैकल्पिक SUMO2/
2. utag-fl का उपयोग कर फिक्स्ड सूत्रकृमि जननग्रन्थि में सूमो का पता लगाने
- पाली-एल-lysine के साथ लेपित किया गया है कि एक प्लस चार्ज स्लाइड पर अंडा बफर14 के एक 8 μl बिंदकी करने के लिए वयस्क hermaphrodites स्थानांतरण । २७.५ जी सुई का उपयोग कर कीड़े से गोंड्स छोड़ें । या तो एंटीबॉडी लेबलिंग या UTAG-fl लेबलिंग के साथ आगे बढ़ें ।
- एंटीबॉडी लेबलिंग नमूनों के लिए, निम्नानुसार आगे बढ़ें:
- तरल नाइट्रोजन में फ्रीज नमूने और फिर एक Coplin जार में-20 डिग्री सेल्सियस मेथनॉल में रात भर ठीक ।
- Coplin जार में भी, 1x PBS में 3 बार के लिए स्लाइड धोने, तो PBS में 20 मिनट के लिए ब्लॉक ०.५% BSA और ०.१% के बीच 20 ।
- नमूनों को कवर करने वाली प्रत्येक स्लाइड में 30 μL एंटी-सूमो 6F2 एंटीबॉडी (1:10) जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रता चैंबर में रातोंरात सेते ।
नोट: सूमो 6F2 विकास के अध्ययन से प्राप्त किया गया था संकरना बैंक15। - Coplin जार में, 1x PBS में 2 मिनट के लिए स्लाइड धोने, फिर कवर और नमूनों के 30 μL के साथ DyLight ४८८ बकरी-विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी (1:200) के लिए १.५ घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक आर्द्रता कक्ष में ।
- Coplin जार में, 1x PBS में 2 मिनट के लिए स्लाइड धोने, dH20 में एक त्वरित डुबकी प्रदर्शन, और फिर बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड माउंट ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
- KmUTAG-fl लेबलिंग के लिए, निम्न के साथ आगे बढ़ें:
- कक्षों को ठीक करने के लिए, 4% पीएफ की अंतिम सांद्रता के लिए नमूनों में 8% पीएफ का 1 वॉल्यूम जोड़ें । एक आर्द्रता चैंबर में 10 मिनट के लिए फिक्स और फिर एक Coplin जार के लिए स्लाइड स्थानांतरित द्वारा प्रतिक्रिया बुझाना 1x PBS के साथ ०.१
- Coplin जार में, 5 मिनट के लिए 1x PBS में कोशिकाओं को धोने, तो 1x PBS में नमूनों permeabilize 10 मिनट के लिए ०.१% ट्राइटन एक्स युक्त ।
- एक Coplin जार में 1 x PBS में कम से 5 मिनट के लिए धो, तो 10 सेकंड के लिए स्लाइड पर नमूनों को ०.१ एम Glycine-HCl (पीएच = २.०) के २०० μL जोड़ें । तुरंत पीएच बेअसर करने के लिए 10x SPB के २०० μL जोड़ें ।
- स्लाइड को 1x PBS में एक Coplin जार में 5 मिनट के लिए धोएं ।
- धोने और पिपेट से स्लाइड निकालें 1x spb के १०० μl + 5mm tcep युक्त utag की 2 माइक्रोग्राम-fl करने के लिए स्लाइड पर सूत्रकृमि, और नमी कक्ष में 1 के लिए सेते बिना घोड़ा ।
- Coplin जार करने के लिए स्लाइड लौटें और 1x PBS में 15 मिनट के लिए धोने
- धोने से स्लाइड निकालें, नमूने के आसपास सुखाने के लिए एक प्रयोगशाला पोंछ का उपयोग करें, और फिर बढ़ते माध्यम के 5 μL के साथ स्लाइड माउंट ( सामग्री की तालिकादेखें) । स्लाइड् स को 4 ° c पर भंडारित करिए । कल्पना DAPI (डीएनए), टेक्सास लाल (kmUTAG-fl), और DyLight ४८८ (SUMO2/3) के लिए उपयुक्त फिल्टर सेट का उपयोग कर ।
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Representative Results
KmUTAG-fl एक पुनः संयोजक है, mCherry-सुमो-फँसाने प्रोटीन टैग. KmUTAG-fl का उत्पादन करने के लिए, हम pSPOT1 बैक्टीरियल overexpression प्लाज्मिड (चित्रा 1) में एक codon अनुकूलित Mcherry-kmutag क्लोन. प्रेरण के बाद, kmUTAG-fl प्रोटीन स्पॉट ट्रैप पर शुद्ध किया गया था, eluted, और आगे उपयोग तक जमे हुए. को सुमो सुनिश्चित करने के लिए-KmUTAG की गतिविधि फंसाने-fl, हम SUMO1-संयुग्मित मोती और एक सूमो-बिल्ली संलयन प्रोटीन के वर्षण के लिए बाध्यकारी की पुष्टि (डेटा नहीं दिखाया गया है, लेकिन पिछले काम13देखें) ।
KmUTAG-fl फिक्स्ड PNT2 कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेटिड एक विशिष्ट Zeiss Axioplan माइक्रोस्कोप पर उपयुक्त फिल्टर सेट (क्रोमा) और एक 100x तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करते हुए मनाया जब एक अलग परमाणु धुंधला दिखाया (चित्रा 2शीर्ष सही पैनल). दोनों विसरित परमाणु धुंधला और विशिष्ट परमाणु फोकी दिखाई दे रहे थे । परमाणु स्थानीयकरण सह का उपयोग कर की पुष्टि की थी-DAPI के साथ धुंधला (चित्रा 2शीर्ष बाएं पैनल) । सूमो-kmUTAG-fl परमाणु स्थानीयकरण पैटर्न SUMO2 की याद ताजा करने की गतिविधि के साथ संगत/ Co-SUMO2/3 8A2 एंटीबॉडी (चित्रा 2 -नीचे बाईं पैनल) सीओ की पुष्टि की-SUMO2/3 संकेत के साथ kmUTAG-fl के स्थानीयकरण (चित्रा 2-विलय, नीचे सही). यह स्तनधारियों की कोशिकाओं में SUMO2/3 का पता लगाने के लिए KmUTAG-fl की प्रभावकारिता की पुष्टि करता है ।
चूंकि kmutag-fl प्रदर्शन pan-सूमो विशिष्टता, हम भी इसे सी एलिगेंस सूत्रकृमि पर परीक्षण के लिए निर्धारित करने के लिए अगर kmutag के स्थानीयकरण पैटर्न-fl विरोधी सूमो एंटीबॉडी और mcherry के पहले रिपोर्ट पैटर्न मैच होगा:: सूमो फ्यूजन प्रोटीन 8,15. Oocyte उत्पादक वयस्क hermaphrodites से अलग जननग्रन्थि या तो विरोधी सूमो एंटीबॉडी या kmutag-fl के साथ लेबलिंग के लिए संसाधित किया गया । पिछले रिपोर्ट 8के साथ संगत, विरोधी सूमो एंटीबॉडी शुरू में देर अर्धसूत्री के न्यूकोप्लाज्म के लिए स्थानीयकृत पूर्वावस्था oocytes (चित्र 3a, C) । इसके बाद यह युग्मित समजात (bivalents) के केंद्रीय रिंग कॉम्प्लेक्स (आर सी) के लिए पुनः वितरित के रूप में परमाणु लिफाफा टूट गया और क्रोमोसोम कांग्रेस के मेटाहासे प्लेट की ओर (चित्रा 3b, डी). रिंग कॉंप्लेक्स, जो DAPI के बीच स्थित है के घटक-दाग homologs, दोनों GEI-17 (एक E3 सूमो ligase) और सूमो-संयुग्मित chromokinesin 8शामिल हैं । समानांतर तैयारी में, kmutag के साथ लेबल जननग्रन्थि-fl इसी तरह के पैटर्न से पता चला (चित्रा 3e, F). Kmutag-fl न्यूक्लियोप्लाज्म लेबल से स्थानांतरित करने के लिए रिंग कॉम्प्लेक्स पर ध्यान केंद्रित, के रूप में oocytes शुरू हुआ (-1 अंडक में चित्रा 3e) और पूरा (-1 अंडक में चित्रा 3e) परमाणु लिफाफा टूटने की प्रक्रिया. इन परिणामों में kmutag-fl अर्धसूत्रण और सूमो से संबंधित प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में मान्य C. एलिगेंस और संभवतः अन्य सूत्रकृमि.
चित्रा 1 । इस विधि में प्रयुक्त kmUTAG-fl सूमो-फंसाने संलयन प्रोटीन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. स्पॉट-टैग वेक्टर pSPOT1 का उपयोग KmUTAG-fl की अभिव्यक्ति के लिए किया जाता है. कृपया इस आंकड़े का कोई बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 स्तनधारी कोशिकाओं में SUMO2 के साथ kmUTAG-fl और 3 colocalization । PNT2 कोशिकाओं coverslips पर बड़े हो रहे थे, तय है, और दोनों KmUTAG-fl और विरोधी SUMO2 8A2 एंटीबॉडी के साथ दाग, बढ़ते DAPI युक्त मीडिया लागू करने से पहले । स्लाइड एक संनाभि माइक्रोस्कोप और dapi (डीएनए), mcherry के लिए उपयुक्त फिल्टर का उपयोग कर कल्पना (kmutag-fl), और gfp (विरोधी SUMO2/ kmUTAG-fl PNT2 कोशिकाओं में SUMO2/3 के साथ colocalized. स्केल पट्टी = 20 μm कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 । C. एलिगेंस अंडकोशिका परिपक्वता के दौरान एंटी-सूमो एंटीबॉडी और kmutag-fl द्वारा सूमो लेबलिंग की तुलना । (क) समीपस्थ सी एलिगेंस जननाद की योजनाबद्ध । अंडकोशिका का विकास शुक्राणुता (sprmth) में एक-एक करके होता है, जहां वे गर्भाशय में प्रवेश करने से पहले निषेचित होते हैं । में oocytes-1 स्थिति, तुरंत spermatheca के निकट परमाणु लिफाफा टूटने से पहले निषेचन से गुजरना । निषेचन के बाद, शुक्राणु वर्णक संघनित अवस्था में तब तक रहता है जब तक कि अंडकोशिका गुणसूत्र अपने अर्धसूत्री विभाजन को पूर्ण नहीं कर लेतीं । (इ) गुणसूत्री द्विसंयोजक की संरचना को दर्शाते हुए योजनाबद्ध, जो समजात गुणसूत्रों के बाद रूपांतरित होते हैं, अपने अन्तर्सूत्रीय परिसर को पुन: संयोजित करते हैं, तथा मध्यात्तक की तैयारी में संघनित होते हैं । Homologs के बीच एक केंद्रीय रिंग कॉम्प्लेक्स (आर सी) न केवल अरोड़ा काइनेज और चेकपॉइंट प्रोटीन बुब-1 में समृद्ध है, लेकिन यह भी E3 सूमो ligase gei-17 और chromokinesin । (सी-डी) अंडवाहिनी (ग) के भीतर ओयोसाइट्स विकसित करने की एक पंक्ति और अर्धसूत्रण (डी) के मेटाहासे में एक नव निषेचित अंडकोशिका जो एंटी-सूमो एंटीबॉडी के साथ लेबल है । (सी-डी) सही शो में पूर्ण आकार छवियों विलय (एम) और एकल चैनल DAPI (डी) और विरोधी सूमो एंटीबॉडी (एस एबी) के चित्र-2 और-1 नाभिक और मेटाहासे मैं धुरी क्षेत्र । अणुकोशिका, एस = शुक्राणु क्रोमेटिन द्रव्यमान के (ई-एफ) अंडवाहिनी के भीतर oocytes विकासशील KmUTAG-fl के साथ लेबल. रिंग कॉम्प्लेक्स में KmUTAG-fl की एकाग्रता परमाणु लिफाफा टूटने से पहले शीघ्र ही शुरू होता है (- ईमें 1 oocytes) और काफी हद तक परमाणु लिफाफा के बाद अंगूठी परिसर के लिए प्रतिबंधित हो जाता है ब्रेकडाउन (-1 अंडक एफमें) । नीला = DAPI । स्केल पट्टी = 5 μm. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यहां हम निश्चित स्तनधारी कोशिकाओं में सूमो के कार्यात्मक अध्ययन और विच्छेदक सूत्रकृमि gonads के लिए kmUTAG-fl, एक पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग करें परिचय । KmUTAG-fl एक तनाव सहिष्णु पैन-सूमो विशिष्ट अभिकर्मक है कि पहचानता है और जाल देशी सूमो-संयुग्मित प्रोटीन और सूमो जंजीरों । चूंकि सुमो तृतीयक संरचना अत्यधिक संरक्षित है यह बहुत संभव है कि अतिरिक्त मॉडल और गैर से सूमो वेरिएंट मॉडल सिस्टम kmUTAG-fl अभिकर्मक के साथ विश्लेषण किया जा सकता है । जैसे, KmUTAG-fl पारंपरिक एंटीबॉडी धुंधला प्रोटोकॉल के लिए एक उपयोगी विकल्प या माध्यमिक अभिकर्मक का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं ।
गैर-एंटीबॉडी विकल्पों के उपयोग के लिए पर्याप्त पूर्वोदाहरण है, जिसमें कार्बोहाइड्रेट का पता लगाने के लिए लेटिंस के साथ-साथ प्रोटीन के वीवो लेबलिंग में के लिए एपटामर न्यूट्रयोटाइड और affimer पेप्टाइड शामिल हैं । 16,17,18 ,19. इसके अतिरिक्त, affimers और monobodies उत्पंन किया गया है कि बांध सुमो और सूमो के साथ संपर्क-बातचीत रूपांकनों (SIMs) अंय प्रोटीन18,20,21पर रोक । हालांकि, हमारे ज्ञान के लिए, KmUTAG-fl निश्चित कोशिकाओं में सूमो conjugates के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए पहली पुनः संयोजक फ्लोरोसेंट पैन-सूमो-ट्रैपिंग प्रोटीन है । KmUTAG-fl एक तनाव सहिष्णु खमीर, के Ulp1 से व्युत्पंन है marxianus, और यह अपनी उल्लेखनीय 13स्थिरता की व्याख्या कर सकते हैं । सबसे एंटीबॉडी के विपरीत, KmUTAG दृश्य के लिए एक माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं है, और दाग कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत आसानी से दिखाई दे रहे हैं । दोनों के हमारे विश्लेषण स्तनधारी कोशिकाओं और सूत्रकृमि जननग्रन्थि में सुमो conjugates का सुझाव है कि kmutag आधारित इमेजिंग सुमो एंटीबॉडी के लिए कृपापूर्वक तुलना-धुंधला और थोड़ा शोर से पता चलता है (उदाहरण के लिए तुलना चित्रा 3a, बी बनाम चित्रा 3 डी , ई) ।
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम ताजा पैराफॉर्मलेडिहाइड का उपयोग और सुमो natively रखने के लिए एक कम निर्धारण समय शामिल है-तो यह kmUTAG द्वारा मांयता प्राप्त किया जा सकता है जोड़ दिया । इसके अलावा, कम पीएच glycine समाधान के साथ फिक्स्ड कोशिकाओं के संक्षिप्त उपचार सूमो के लिए अपनी संवेदनशीलता बढ़ जाती है । हालांकि, नहीं सभी नमूनों को KmUTAG-fl के साथ विश्लेषण करने के लिए खुद को उधार दे सकता है । एंटीबॉडी आधारित प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, जब नए सेल प्रकार या ऊतकों में सूमो स्थानीयकरण करने का प्रयास, डिटर्जेंट पसंद और डिटर्जेंट सांद्रता महत्वपूर्ण चर हो सकता है । अंत में, हम एक सेल-मर्मज्ञ kmUTAG प्रोटीन है कि रहने वाले कक्षों में सूमो गतिशीलता का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता सहित अतिरिक्त KmUTAG-fl वेरिएंट उत्पंन करने की योजना, organoids, और ऊतक बायोप्सी ।
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Disclosures
पुनर्योगवादी kmUTAG अभिकर्मक Kerafast.com के माध्यम से अनुसंधान समुदाय के लिए प्रदान की जाती हैं.
Acknowledgments
हम उनके समर्थन के लिए Kerscher लैब के सभी सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, के लिए महत्वपूर्ण पांडुलिपि के पढ़ने Nathalie गुयेन, और अनुक्रमण के लिए Lidia Epp । यह काम राष्ट्रमंडल अनुसंधान के व्यावसायीकरण कोष MF16-034-LS को ठीक करने के लिए समर्थन किया गया है । डब्ल्यू & एम के छात्रों के लिए अनुसंधान सहायता बेली द्वारा प्रदान की गई थी ह्यूस्टन रिसर्च फंड, और चार्ल्स केंद्र संमान फैलोशिप के लिए RY और CH ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
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