Summary
Il SUMO è una proteina modificatoria di tipo ubiquitina, essenziale e altamente conservata. In questo protocollo stiamo descrivendo l'uso di una proteina di SUMO-trapping ricombinante tollerante allo stress (kmUTAG) per visualizzare i coniugati SUMO nativi e senza tag e la loro localizzazione in una varietà di tipi di cellule.
Abstract
Qui presentiamo un nuovo metodo per studiare la sumoilazione delle proteine e la loro localizzazione subcellulare nelle cellule dei mammiferi e negli ovociti nematodi. Questo metodo utilizza un frammento di proteina di SUMO-trapping modificato ricombinante, kmUTAG, derivato dalla proteasi di SUMO Ulp1 del lievito in erba tollerante allo stress Kluyveromyces marxianus. Abbiamo adattato le proprietà del kmUTAG allo scopo di studiare la sumoilazione in una varietà di sistemi di modelli senza l'uso di anticorpi. Per lo studio di SUMO, KmUTAG ha diversi vantaggi rispetto agli approcci basati su anticorpi. Questo reagente a tolleranza di SUMO è prodotto recombinantly, riconosce le isoforme di SUMO native di molte specie e, a differenza degli anticorpi disponibili in commercio, Mostra una ridotta affinità per il SUMO libero e non coniugato. I risultati rappresentativi qui riportati includono la localizzazione dei coniugati SUMO nelle cellule di coltura tissutale dei mammiferi e negli ovociti nematodi.
Introduction
Lo scopo di questo metodo è quello di facilitare lo studio e l'analisi delle proteine coniugate con SUMO utilizzando la proteina ricombinante SUMO-trapping UTAG ( tagULP Domain). Come descritto di seguito, UTAG può essere utilizzato al posto di altri reagenti e approcci per purificare, rilevare e visualizzare le proteine di SUMO modificate. A seconda delle condizioni di crescita, le cellule possono contenere centinaia o migliaia di proteine che vengono modificate con le catene SUMO o SUMO (per la revisione vedere Kerscher et al. 20061 e kerscher 20162). Questo rappresenta una notevole difficoltà per le analisi funzionali di specifiche proteine SUMO-modificate, soprattutto perché solo una frazione di un particolare bersaglio di SUMOilazione è effettivamente modificato3. Oltre ai loro ruoli nei processi cellulari essenziali come la regolazione trascrizionale, l'omeostasi proteica, la risposta allo stress cellulare e il rimodellamento della cromatina durante la mitosi e la meiosi; Ora è diventato sufficientemente chiaro che il Sumo, le proteine modificate dal sumo e i componenti del pathway di Sumo hanno anche un potenziale come biomarcatori per patologie come il cancro e le patologie neurodegenerative4,5,6 ,7. Ciò sottolinea la necessità di strumenti robusti, affidabili e prontamente disponibili e di approcci innovativi per la rilevazione e l'analisi funzionale delle proteine di SUMO modificate in una varietà di cellule e campioni.
In molti sistemi, gli anticorpi specifici per Sumo sono i reagenti di scelta per le analisi di rilevazione, isolamento e funzionale delle proteine di Sumo-modificate8,9. Tuttavia, alcuni anticorpi specifici per SUMO disponibili in commercio sono costosi, limitati in quantità o disponibilità, inclini ad esporre affinità selvaggiamente variabili e cross-reattività, e in alcuni casi mancano riproducibilità10. Un approccio alternativo è l'espressione di SUMO con tag epitopo in cellule e organismi trasformati, ma il collegamento di tag epitopi a SUMO può ridurre artificialmente la sua coniugazione agli obiettivi proteici11. Inoltre, gli epitopi non sono utili quando vengono valutate cellule o tessuti non trasformati.
Ulp1 è una proteasi di SUMO conservata da S. cerevisiae che entrambi elabora il precursore di sumo e desumoylates proteine coniugate con Sumo12. Abbiamo sviluppato il reagente UTAG in base all'osservazione serendipitous che una mutazione della cisteina catalitica (C580S) in Ulp1's Sumo ULP dominio (UD) non solo previene la scissione del Sumo, ma anche intrappola le proteine coniugate con sumo con elevate avidità12. Per semplicità, abbiamo fatto riferimento a questo frammento carboxy-terminale SUMO-trapping Ulp1 (C580S) come UTAG (abbreviazione di UD TAG). UTAG è una proteina di intrappolamento Pan-SUMO ricombinante che rappresenta un'utile alternativa agli anticorpi anti-SUMO utilizzati per l'isolamento e il rilevamento di proteine di SUMO-modificate. È importante sottolineare, in particolare, il SUMO coniugato in modo nativo e non solo uno o più epitopi su SUMO. Per migliorare sia la stabilità proteica che la forza legante SUMO di UTAG, abbiamo generato una variante di UTAG dal lievito a tolleranza di stress Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG lega saldamente i coniugati di SUMO con l'affinità nanomolare13. Inoltre, kmUTAG è resistente a temperature elevate (42 ° c), agenti riducenti (5 mM TCEP-tris (2-carbossimetilico) fosfina cloridrato), denaturanti (fino a 2 M di urea), agenti ossidanti (0,6% di perossido di idrogeno) e detergenti non ionici. Questa tolleranza allo stress è utile durante le dure condizioni di purificazione e i tempi di incubazione prolungati, assicurandone la stabilità e l'attività di cattura di SUMO. Non sorprende tuttavia che l'attività di KmUTAG di SUMO-trapping sia incompatibile con i reagenti modificanti la cisteina, i detergenti ionici e gli estratti proteici completamente denaturati. La notevole affinità e proprietà di KmUTAG indicano che questo reagente può diventare parte del repertorio standard per lo studio delle proteine SUMOilate in più specie.
Qui forniamo un metodo semplice per rilevare le proteine di SUMO-modificate in cellule di mammiferi e nematodi utilizzando una proteina di fusione fluorescente mCherry-KmUTAG ricombinante (kmUTAG-FL).
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Protocol
1. rilevazione di SUMO in cellule di coltura di tessuti fissi utilizzando proteina ricombinante KmUTAG-FL SUMO-trapping
- Coltivare le cellule di coltura tissutale di scelta sui fogli di copertura rotonda di 22 mm in piastre TC a 6 pozzetti fino al 70% – 80% confluente. Eseguire i passaggi 1.2 – 1.8 nella piastra 6-well.
- Lavare brevemente le cellule con 1 mL di DPBS (soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco)
- Per la fissazione, preparare una soluzione fresca di 4% paraformaldeide (PFA) soluzione (diluita in DPBS). Per correggere le cellule, aggiungere 2 mL 4% PFA in DPBS a ciascun pozzo. Incubare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente. Nota: tutti i passaggi che utilizzano PFA devono essere eseguiti in un cappuccio di sicurezza di laboratorio e PFA deve essere smaltito correttamente.
- Lavare le celle fisse 3x in 1 mL di DPBS mentre Nutri la piastra, 5 min ogni lavaggio.
- Per permeabilizzare le cellule, incubare per 15 min con 0,1% Triton X-100 in DPBS
- Lavare le cellule 3x in 1 mL di DPBS mentre Nutri la piastra, 5 min ogni lavaggio
- Incubare le cellule con 500 μL di 0,1 M di glicina-HCL (pH 2,0) per 10 s, quindi neutralizzare immediatamente il pH con 500 μL di 10X tampone di proteasi di SUMO (SPB).
- Lavare le cellule 3x in 1 ml di DPBS mentre la piastra nutanti, 5 min ogni lavaggio
- Rimuovere i coprioggetti dal pozzo e metterli in una camera umida. Quindi procedere con le incubazioni sul vetrino coprioggetti come segue:
- Solo per la colorazione UTAG-FL: miscelare 1 μg UTAG-FL con 100 μL di 1x SPB contenente 5 mM di TCEP in un tubo, pipettare il mix sulle celle del vetrino coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 1 h nella camera di umidità.
- Facoltativamente, per la co-colorazione degli anticorpi UTAG-FL e anti SUMO1, procedere come segue:
- Mescolare in un tubo 1 μg UTAG-FL e 0,5 μL SUMO2/3 8A2 (ottenuto per studi sullo sviluppo Hybridoma Bank9) con 100 μl di tampone bloccante, pipettare il mix sul vetrino coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 1 h.
- Lavare le celle sul vetrino coprioggetti 3 volte con 200 μL di DPBS, 5 min per ogni lavaggio.
- Mescolare in un tubo 0,5 μL anti-topo Alexa Fluor 488 anticorpo coniugato con 100 μL Tampone bloccante, pipettare il mix sul vetrino coprioggetti e incubare a temperatura ambiente per 1 h.
- Per lavare i coprioggetti, Pipettare 200 μL di DPBS su ciascun vetrino coprioggetti e lasciare in posizione per 10 minuti. Ripetere il lavaggio 2 volte.
- Rimuovere il vetrino coprioggetti dall'ultimo lavaggio e invertirlo su una slitta di microscopia pre-pulita con una goccia di supporto di montaggio (vedere tabella dei materiali).
- Conservare la notte in un congelatore da-20 ° c prima di visualizzarla al microscopio. Visualizza utilizzando i set di filtri appropriati per DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) e Alexa Fluor 488 (se viene eseguita la co-colorazione opzionale SUMO2/3).
2. rilevazione SUMO in gonadi nematode fisse con UTAG-FL
- Trasferire gli ermafroditi adulti a una gocciolina di 8 μL di tampone di uovo14 su una slitta più caricata che è stata rivestita con poli-L-lisina. Rilasciare gonadi dai vermi utilizzando 27,5 aghi G. Procedere con l'etichettatura degli anticorpi o l'etichettatura UTAG-FL.
- Per i campioni di etichettatura degli anticorpi, procedere come segue:
- Congelare-rompere i campioni in azoto liquido e quindi fissare durante la notte in-20 ° c metanolo in un barattolo Coplin.
- Anche in vasi Coplin, lavare i vetrini per 3 volte in 1X PBS, quindi bloccare per 20 minuti in PBS contenente 0,5% BSA e 0,1% Tween 20.
- Aggiungere 30 μL di anticorpo anti-SUMO 6F2 (1:10) ad ogni vetrino che copra i campioni. Incubare durante la notte in una camera umida a 4 ° c.
Nota: SUMO 6F2 è stato ottenuto dallo studio sullo sviluppo Hybridoma Bank15. - Nei vasi Coplin, lavare i vetrini per 2 minuti in 1X PBS, quindi coprire e incubare i campioni con 30 μL di anticorpo secondario di capra-anti-topo DyLight 488 (1:200) per 1,5 ore in una camera umida a temperatura ambiente.
- In barattoli di Coplin, lavare i vetrini per 2 minuti in 1X PBS, eseguire un tuffo rapido in dH20, quindi montare le diapositive con il supporto di montaggio (vedere la tabella dei materiali).
- Per l'etichettatura KmUTAG-FL, procedere come segue:
- Per fissare le cellule, aggiungere 1 volume di 8% PF ai campioni per una concentrazione finale del 4% PF. fissare per 10 minuti in una camera di umidità e poi dissetare la reazione trasferendo le diapositive in un barattolo Coplin contenente 1X PBS con 0,1 M di glicina per almeno 5 min.
- Nei vasi di Coplin, lavare le cellule per 5 minuti in 1X PBS, quindi permeabilizzare i campioni in 1X PBS contenente 0,1% Triton-X per 10 min.
- Lavare in un barattolo di Coplin per almeno 5 minuti in 1X PBS, quindi aggiungere 200 μL di 0,1 M di glicina-HCl (pH = 2,0) ai campioni sulla slitta per 10 secondi. Aggiungere immediatamente 200 μL di 10x SPB per neutralizzare il pH.
- Lavare la slitta in 1X PBS in un barattolo Coplin per 5 min.
- Rimuovere la slitta dal lavaggio e pipettare 100 μL di 1x SPB + 5mM TCEP contenente 2 μg di UTAG-FL ai nematodi sui vetrini e incubare in camera umida per 1 h senza dondolo.
- Riportare la slitta nella vaschetta Coplin e lavare per 15 minuti in 1X PBS
- Rimuovere la slitta dal lavaggio, utilizzare un panno di laboratorio per asciugare intorno al campione, quindi montare le diapositive con 5 μL di supporto di montaggio (vedere tabella dei materiali). Conservare le diapositive a 4 ° c. Visualizzare utilizzando i set di filtri appropriati per DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) e DyLight 488 (SUMO2/3).
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Representative Results
KmUTAG-FL è una proteina ricombinante, con etichetta mCherry, che cattura il SUMO. Per produrre kmUTAG-FL, abbiamo clonato un mCherry-kmUTAG ottimizzato per il codone nel plasmide di iperespressione batterica pSPOT1 (Figura 1). Dopo l'induzione, la proteina kmUTAG-FL è stata purificata su spot-TRAP, eluita e congelata fino a ulteriore uso. Per garantire l'attività di intrappolamento di SUMO di KmUTAG-FL, abbiamo confermato il legame con le perle coniugate SUMO1 e la precipitazione di una proteina di fusione SUMO-CAT (dati non mostrati, ma vedere il precedente lavoro13).
KmUTAG-FL incubato con celle fisse PNT2 ha mostrato una colorazione nucleare distinta quando osservata utilizzando il set di filtri appropriato (Chroma) e un obiettivo di immersione a olio 100x su un microscopio Zeiss Axioplan epifluorescente (Figura 2-pannello in alto a destra). Sia la colorazione nucleare diffusa che i focolai nucleari distinti erano visibili. La localizzazione nucleare è stata confermata usando la co-colorazione con DAPI (Figura 2-pannello superiore sinistro). Coerentemente con l'attività di intrappolamento del SUMO di kmUTAG-FL, il modello di localizzazione nucleare ricordava la colorazione SUMO2/3. La co-colorazione con anticorpo anti SUMO2/3 8A2 (Figura 2 -pannello in basso a sinistra) ha confermato la co-localizzazione di kmUTAG-FL con il segnale SUMO2/3 (Figura 2-merge, in basso a destra). Questo convalida l'efficacia di KmUTAG-FL per rilevare SUMO2/3 nelle cellule di mammiferi.
Dal momento che kmutag-FL espone specificità Pan-Sumo, abbiamo anche testato su C. elegans nematodi per determinare se il modello di localizzazione di kmutag-FL sarebbe abbinare i modelli precedentemente segnalati di anticorpi anti-Sumo e mCherry:: Sumo proteine di fusione 8,15. Le gonadi isolate degli ermafroditi adulti che producono ovociti sono state trattate per l'etichettatura con entrambi gli anticorpi anti-SUMO o kmUTAG-FL. coerentemente con le precedenti relazioni 8, l'anticorpo anti-Sumo inizialmente localizzato al nucleoplasma del tardo meiotico ovociti profase (Figura 3A, C). Poi ridistribuito al complesso di anello centrale (RC) dei omologi accoppiati (bivalenti) come l'involucro nucleare si è rotto e il Congresso cromosomi verso la piastra metafase (Figura 3B, D). I componenti del complesso ad anello, che si trova tra gli omologi colorati DAPI, includono sia GEI-17 (a E3 SUMO ligase) che il cromocinesin di SUMO-coniugato 8. In preparazioni parallele, le gonadi etichettate con KmUTAG-FL hanno rivelato modelli simili (Figura 3E, F). Kmutag-FL si è spostato dall'etichettatura del nucleoplasma alla concentrazione sul complesso dell'anello, come hanno cominciato gli ovociti (-1 ovocita nella Figura 3e) e completati (-1 ovocita in Figura 3F) il processo di ripartizione della busta nucleare. Questi risultati convalidano KmUTAG-FL come uno strumento utile per l'analisi della meiosi e dei processi correlati al SUMO in C. elegans ed eventualmente in altri nematodi.
Figura 1. Rappresentazione schematica della proteina di fusione kmUTAG-FL SUMO-trapping utilizzata in questo metodo. Il vettore Spot-Tag pSPOT1 viene utilizzato per l'espressione di KmUTAG-FL. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. kmUTAG-FL colocalizzazione con SUMO2/3 nelle cellule di mammiferi. Le cellule PNT2 sono state coltivate su coprioggetti, fisse e macchiate con l'anticorpo KmUTAG-FL e anti-SUMO2 8A2, prima di applicare supporti di montaggio contenenti DAPI. Le diapositive sono state visualizzate utilizzando un microscopio confocale e filtri appropriati per DAPI (DNA), mCherry (kmUTAG-FL) e GFP (anti SUMO2/3). kmUTAG-FL colocalizzato con SUMO2/3 in cellule PNT2. Barra di scala = 20 μm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Confronto tra l'etichettatura Sumo da anticorpi anti-Sumo e kmutag-FL durante la maturazione di C. elegans ovocita. (A) schema della prossimale C. elegans gonad. Lo sviluppo di ovociti entra nello ricettacolo seminale (sprmth) uno per uno dove vengono fertilizzati prima di entrare nell'utero. Gli ovociti in posizione-1, immediatamente adiacenti alla ricettacolo seminale, subiscono la rottura della busta nucleare prima della fecondazione. Dopo la fecondazione, la cromatina dello sperma rimane in uno stato condensato fino a quando i cromosomi ovociti completano le loro divisioni meiotiche. B) schema che mostra la struttura di un bivalente cromosomico che si forma dopo che i cromosomi omologhi hanno ricombinato, smontato il loro complesso sinapttomenale e si sono condensati in preparazione della metafase. Un complesso di anelli centrali (RC) tra gli omologi è arricchito non solo nell'Aurora chinasi e nella proteina di checkpoint BUB-1 ma anche nell'E3 SUMO ligasi GEI-17 e nella cromochinesin. (C-D) Una linea di sviluppo di ovociti all'interno dell'ovidotto (C) e di un ovocita appena fecondato nella metafase della meiosi I (D) etichettato con anticorpo anti-Sumo. (C-D) Immagini a grandezza naturale a destra mostrano le immagini fuse (m) e a singolo canale DAPI (D) e anti-SUMO (S AB) dei nuclei-2 e-1 e la regione della metafase I mandrino. o = cromosomi metafase I di oocyte, s = massa della cromatina dello sperma. (E-F) Lo sviluppo di ovociti all'interno dell'ovidotto etichettato con kmutag-FL. la concentrazione di kmutag-FL nel complesso dell'anello inizia poco prima della ripartizione della busta nucleare (-1 ovocita in e) e diventa in gran parte limitata al complesso dell'anello dopo la busta nucleare ripartizione (-1 ovocita in F). Blu = DAPI. Barra di scala = 5 μm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui introduciamo l'uso di kmUTAG-FL, una proteina ricombinante, per gli studi funzionali del SUMO in cellule di mammiferi fisse e delle gonadi nematode dissezionate. KmUTAG-FL è un reagente specifico Pan-SUMO a tolleranza di stress che riconosce e intrappola le proteine native del SUMO e le catene di SUMO. Poiché la struttura terziaria di SUMO è altamente conservata, è molto probabile che le varianti di SUMO di sistemi aggiuntivi e non modello possano essere analizzate con il reagente kmUTAG-FL. In quanto tale, KmUTAG-FL può rappresentare un utile reagente alternativo o secondario per i protocolli tradizionali di colorazione degli anticorpi.
Esiste un ampio precedente per l'uso di alternative non anticorpali, comprese le lectine per il rilevamento dei carboidrati, nonché i nucleotidi aptamero e i peptidi di affimer per l'etichettatura in vivo di proteine 16,17,18 ,19. Inoltre, sono stati generati affimeri e monocorpi che legano il sumo e impediscono l'interazione con i motivi che interagiscono con il Sumo (Sims) su altre proteine18,20,21. Tuttavia, a nostra conoscenza, KmUTAG-FL è la prima proteina ricombinante di cattura Pan-SUMO fluorescente per la visualizzazione diretta dei coniugati SUMO in celle fisse. KmUTAG-FL è derivato da Ulp1 di un lievito tollerante allo stress, K. marxianus, e questo può spiegare la sua notevole stabilità 13. A differenza della maggior parte degli anticorpi, KmUTAG non richiede un anticorpo secondario per la visualizzazione e le cellule macchiate sono facilmente visibili sotto il microscopio a fluorescenza. Sia le nostre analisi dei coniugati di SUMO nelle cellule di mammiferi che le gonadi del nematode suggeriscono che l'imaging basato su KmUTAG confronta favorevolmente la colorazione anticorpale di SUMO e mostra poco rumore (ad esempio, confronta Figura 3A, B versus Figura 3D , E).
Passaggi critici nel protocollo includono l'uso di paraformaldeide fresco e un breve tempo di fissazione per mantenere SUMO nativamente-piegato in modo che possa essere riconosciuto da kmUTAG. Inoltre, il breve trattamento delle cellule fisse con la soluzione di glicina a basso pH aumenta la sua sensibilità per SUMO. Tuttavia, non tutti i campioni possono prestarsi all'analisi con KmUTAG-FL. Come con i protocolli basati su anticorpi, quando si tenta di localizzare SUMO in nuovi tipi di cellule o tessuti, la scelta del detergente e le concentrazioni di detergente possono essere variabili importanti. In definitiva, abbiamo in programma di generare varianti KmUTAG-FL aggiuntive, tra cui una proteina kmUTAG che penetra nelle cellule che può essere utilizzata per rilevare le dinamiche di SUMO in cellule viventi, organoidi e biopsie tissutali.
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Disclosures
I reagenti kmUTAG ricombinanti vengono forniti alla comunità di ricerca tramite Kerafast.com.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare tutti i membri del laboratorio Kerscher per il loro sostegno, Nathalie Nguyen per la lettura critica del manoscritto, e Lidia EPP per il sequenziamento. Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo di commercializzazione del Commonwealth Research MF16-034-LS a OK. Il sostegno alla ricerca per gli studenti W & M è stato fornito dal fondo Bailey-Huston Research e dalle borse di studio di Charles Center Honors a RY e CH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
- Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
- Kerscher, O. SUMOylation. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-11 (2016).
- Hay, R. T.
- Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
- Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
- Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
- Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).
- Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
- Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
- Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
- Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).
- Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
- Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).
- Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
- Ruckman, J., et al. 2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
- Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).
- Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).
- Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
- Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).
