Summary
在这里,我们提出一个协议,处理从小鼠或人类分离的新鲜骨髓(BM),用于对中性粒细胞的超维质量细胞测定(飞行时间,CyTOF)的细胞测定。
Abstract
在本文中,我们提出了一个协议,经过优化,以保存新BM中的中性粒细胞,用于整个BM CyTOF分析。我们使用骨髓偏置的39抗体CyTOF面板,利用该协议对造血系统进行评价,重点是中性粒细胞系细胞。利用开放资源维还原算法viSNE对CyTOF结果进行了分析,并给出了数据,以证明该协议的结果。我们根据这个协议发现了新的嗜中性粒细胞群。这种新鲜全BM制剂的协议可用于1),CyTOF分析,发现来自整个BM的不明细胞群,2),调查整个BM缺陷的血液疾病患者,如白血病,3,协助优化荧光激活流式细胞仪协议,利用新鲜的全BM。
Introduction
在过去的几十年中,细胞学方法一直是研究BM造血系统的有力工具。这些方法包括荧光活化流细胞测定法和采用重金属标记抗体的CyTOF新方法。通过鉴定其独特的表面标记表达特征,它们在异质生物标本中发现了许多细胞类型。增加的频谱重叠与更多的通道相关,导致荧光激活流细胞学应用中的数据误差更高。因此,为了丰富荧光激活流细胞学分析感兴趣的细胞群,通常会去除不需要的细胞。例如,Ly6G(或Gr-1)和CD11b被视为成熟的骨髓细胞标记,Ly6G= (或Gr-1+) 和CD11b+细胞在流式细胞测定分析之前,通常使用磁性浓缩试剂盒从BM样品中取出。造血干细胞和祖细胞(HSPCs)或将这些标记物组合在一个转储鸡尾酒通道1,2,3。另一个例子是,中性粒细胞经常从人类血液标本中取出,以丰富外周血单核细胞(PBMC),用于免疫学研究。然而,从小鼠或人类分离出的整个骨髓很少被完整地研究为细胞学分析。
最近,CyTOF已成为研究造血系统4,5,6的革命性工具。使用CyTOF,荧光度标记抗体被重元素报告标记抗体所取代。此方法允许同时测量 40 多个标记,而不必担心频谱重叠。它使完整的生物标本能够进行分析,无需预消耗步骤或转储通道。因此,我们可以从传统的二维流式细胞学图中,以高含量的维数全面地观察造血系统。过去在消耗或浇注过程中省略的细胞群现在可以使用CyTOF4,5生成的高维数据来揭示。我们设计了一个抗体面板,同时测量造血系统中的39个参数,重点是骨髓性linage7。与传统流式细胞测量数据相比,CyTOF生成的前所未有的单细胞高维数据的解释和可视化具有挑战性。计算科学家已经开发了用于高维数据集可视化的维数缩减技术。在本文中,我们使用使用 t 分布随机邻域嵌入 (t-SNE) 技术的算法 viSNE 来分析 CyTOF 数据,并在二维地图上显示高维结果,同时保护高维结构数据8,9,10。在 tSNE 图中,类似的单元格被聚入子集,颜色用于突出显示单元格的特征。例如,在图1中,骨髓细胞根据CyTOF(图1)4产生的33个表面标记的表达模式的相似性,分布到多个细胞集中。在这里,我们研究了小鼠骨髓与我们之前报告的39标记CyTOF面板通过viSNE分析7。viSNE分析我们的CyTOF数据显示一个不明的细胞群,显示HSPC (CD117+)和嗜中性粒细胞 (Ly6G+) 特性 (图2)7。
最后,我们提出了一个方案,用于CyTOF分析处理新鲜的全骨髓。在本文中,我们以小鼠骨髓为例,而此协议也可用于处理人类骨髓样本。协议中也注明了人类骨髓样本的细节。该协议的优点是,它包含一些细节,如孵育时间和温度,经过优化,以保存整个骨髓中的嗜中性粒细胞,以便对完整的整个骨髓进行调查。对于荧光激活流式细胞学应用,此协议也可轻松修改。
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Protocol
所有实验均遵循拉霍亚过敏和免疫学研究所动物护理和使用委员会批准的准则,并根据国家卫生研究院的《实验室动物护理和使用指南》。
1. 收获小鼠骨髓 (BM)
- 从商业供应商处购买 C57BL/6J 鼠标。在无病原体的设施中,在微型隔离器笼中喂养标准的啮齿动物食物,并饲养房屋。
- 使用6-10周大的雄性小鼠进行实验。通过CO2吸入安乐死,然后是宫颈脱位。
- 将鼠标放在腹部向上的无菌手术垫上。通过喷洒70%乙醇对腹部和后肢的皮肤进行消毒。用一把解剖手术剪刀切开腹腔。
- 去除皮肤以暴露后肢。使用一对钝尖敷料钳将鼠标尖头保持在脚踝正下方。使用另一对弯曲的修整钳将钝尖修整钳下方的尖头稳定。打破骨质,并通过用钝尖敷料钳撕裂肌肉暴露骨头。
注:骨裂是松散地连接到膝关节,可以很容易地挑选出来使用钝尖敷料钳。 - 将 tibia 置于冷 1x PBS 中。
- 接下来,将稳定弯曲的修整钳向下移到股骨上。将钝尖敷料滑到膝盖关节下方,并按住膝盖。轻轻地拉起膝盖。通过撕开附着在膝盖上的肌肉来暴露股骨。用弯曲的敷料钳抓住裸露的股骨,并用解剖手术剪刀将股骨从骨底切开。
- 将股骨置于冷 1x PBS 中。
- 用 18 G 针在 0.5 mL 微离心管中打孔。
- 将头骨和股骨放入同一 0.5 mL 微离心管中,使骨骼的开端朝下朝向孔。
- 将含有头骨和股骨的0.5 mL管放入1.7 mL微离心管中。
- 在微型离心机中,以 5,510 x g的速度旋转含有头骨和股骨的双层管,为 30 s 旋转。
- 确保从骨骼中提取 BM,并在管底部进行颗粒处理。将包含神圣骨骼的 0.5 mL 管。鼠标 BM 已准备好执行后续步骤。
注:人类BM在临床资源中采集,如前所述11。
2. CyTOF的染色BM细胞
- 在 1 mL 1x 红血球 (RBC) 赖沙缓冲液中重新悬浮 BM。对于人类BM,在10倍红血细胞(RBC)赖沙缓冲液的10倍体积中重新悬浮整个BM。在室温 (RT) 下孵育 10 分钟。
- 在 4°C 下以 350 x g旋转管 5 分钟。对于人工 BM,请重复步骤 2.1 和 2.2,然后再继续执行步骤 2.3。
- 小心吸出上清液,使颗粒不受干扰。用 1 mL 的冷 1x PBS 重新悬浮颗粒。通过 70 μm 细胞滤网将颗粒过滤到 15 mL 锥形管中。BM细胞现在完全从肌肉和骨屑分离到管中。通过在管中加入9 mL的冷1x PBS来清洗细胞。
- 在 4°C 下以 350 x g旋转 15 mL 管 5 分钟。
- 小心吸出上清液,用10mL冷PBS重新悬浮BM细胞。取一个等分的单元格进行计数。使用血细胞计对细胞进行计数。
- 阿利胶 5 x 106 BM 细胞进入新的 15 mL 管,用于 CyTOF 染色。
- 在 4°C 下以 350 x g旋转 15 mL 管等分 5 分钟。
- 小心地吸出上清液,用125 nM Cisplatin在CyTOF染色缓冲液中重新悬浮BM细胞,作为样品的生存能力指标。在 RT 孵育 5 分钟。
- 孵育后,向管中加入4 mL的CyTOF染色缓冲液。在 4°C 下以 350 x g旋转管 5 分钟。对于人类BM,将10%的人类AB血清加入CyTOF染色缓冲液中。
- 小心吸出上清液,用50μL的Fc受体阻断溶液重新悬浮BM细胞。在4°C下孵育10分钟。跳过此步骤,用于人工 BM。
- 将50μL的自制CyTOF抗体鸡尾酒5添加到样品中,使总染色量为100μL。轻轻移液器混合。在4°C下孵育30分钟。对于小鼠BM和人体BM样本,抗体鸡尾酒的最终体积为100μL。
- 在孵育后向每根管中加入2 mL的CyTOF染色缓冲液,以洗涤细胞,在4°C下以350 x g旋转管5分钟。
- 重复步骤 2.12,共进行两次。
- 从 16% 库存安培制备新鲜的 1.6% 甲醛溶液。用 1x PBS 的 9 部分稀释 1 份库存甲醛。
- 小心吸出上清液,用1 mL新鲜1.6%的FA溶液重新悬浮颗粒。在 RT 孵育 15 分钟。
- 在 4°C 下以 800 x g旋转管 5 分钟。
- 小心地吸出上清液,用125 nM的间切溶液在1mL固定/perm缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。
- 在4°C的分压溶液中孵育样品过夜。
3. 为CyTOF采集准备细胞
- 在 4°C 下,在 800 x g下轻轻旋转和旋转细胞 5 分钟。
- 通过加入2 mL的CyTOF染色缓冲液清洗细胞,在800 x g下旋转细胞在4°C下旋转5分钟,然后通过吸入去除上清液。
- 在 1 mL 的 diH2O 中重新悬浮细胞,从每个管中保留一个小体积(约 10 μL)以计数细胞。
- 在 4°C 下以 800 x g旋转细胞 5 分钟。
- 重复步骤 3.3 和 3.4。
- 小心地吸出上清液,并将细胞留在颗粒中。BM细胞现在准备重新悬浮到1 x 106细胞/mL的浓度,用于CyTOF的采集。
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Representative Results
图1作为CyTOF实验的一个示例。在此 tSNE 图中,跨多个小鼠组织的细胞根据 33 参数 CyTOF 面板测量的表面标记表达式配置文件的相似性聚集到子中。具有更多相似属性的细胞根据每个细胞上的 33 个标记的表达式自动聚集在一起,如嗜中性粒细胞、巨噬细胞或 DC。
图2是使用本研究提出的协议进行的小鼠BM CyTOF实验的一个示例结果。该协议保留了整个BM的完整性,导致发现一个以前未知的细胞群,共同表达中性粒细胞(Ly6G+,图2A)和HSPC(CD117+,图2B)特征表面标记同时。此细胞群显示了由我们的 CyTOF 面板测量的表面标记表达式(图 2C)的独特模式,由于 Ly6G=细胞耗竭1,2, 之前骨髓祖细胞研究省略了该模式。 3.更重要的是,这一结果导致发现聚类的一小部分到viSNE地图的左侧,不表示Ly6G,但是被紧密地聚到CD117+Ly6G+细胞,这表明这些相似性基于用于此 CyTOF 实验的 39 个标记的表达式的中性粒细胞谱系。
我们使用图 2C中所示的 CyTOF 数据中的标记表达式配置文件构建了 13 色 FACS(荧光激活细胞分类)面板,允许我们通过流式细胞测定分离中性粒细胞祖子,用于下游功能测定(图 3.
图 1:由 CyTOF 产生的 tSNE 图示例。聚合 tSNE 维数减少了来自所有被分析的小鼠组织的单细胞数据,这些细胞数据由 28 个"无监督"聚类绘制和颜色编码。根据各种已发布的分析对每个聚类的粗标识进行了批过。此图已由参考4中修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:对Lin-CD117+Ly6A/E-骨髓中的HSPC细胞进行自动单细胞分析,识别出一个独特的中性粒细胞祖居群体。Lin 的 viSNE 地图-CD117=Ly6A/E- HSPC 单元显示为点叠加,以显示 5 个自动群集。(A) Ly6G 和 (B) CD117 表达模式显示在 Lin 的 viSNE 图上-CD117+Ly6A/E- HSPC 细胞作为光谱色点。(C) 指示标记的表达式模式显示为每个聚类的直方图叠加。此图已由参考文献7修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:使用大规模细胞测定 (CyTOF) 数据集演示的 FACS 门控策略。手动封闭的目标总体已回门到自动 viSNE 映射进行验证。此图已由参考文献7修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在过去的几十年里,荧光流细胞学被用作研究细胞谱系和异质性1、2、3的主要方法。虽然流式细胞学提供了多维数据,但这种方法受到参数选择和光谱重叠的限制。为了克服流式细胞学的弱点,我们利用了CyTOF,它使用重金属同位素代替荧光水,来标记抗体,消除检测通道之间的串扰或细胞的自荧光,因此,可以测量许多在单细胞水平上同时有更多的参数,并生成对细胞多样性的更深入的评估12。过去在消耗或浇注过程中省略的细胞群,特别是重要的免疫细胞,如中性粒细胞系状细胞,长期被认为是同质的13,14,可以更好地用CyTOF 2来描述 ,3,7.
为了适应CyTOF的这种强大的细胞学工具,研究细胞异质性和特征化稀有细胞群,保护生物标本完整性的协议对于异质性研究非常实用。在这里,我们描述了一个协议,以处理整个细胞细胞CyTOF,使新的细胞群在完整的整个BM,可用于小鼠或人类研究全面表征。从小鼠和人类分离出的整个骨髓包含细胞群,尤其是中性粒细胞,这些细胞非常脆弱,对环境变化(如温度和培养条件)非常敏感。在此协议中,我们优化了每个步骤的温度和孵育条件,以便将这些敏感种群保持到最大水平。通过这样做,整个骨髓细胞的完整性得到很好的保护。通过将个性化标记面板纳入该协议,研究人员可以识别更多不同研究领域感兴趣的细胞。
虽然CyTOF是发现新细胞群的一种强大的端点分析工具,能够根据新种群的标记特征预测新种群的功能,但该技术对于进一步下游功能研究是有限的。为了进行下游功能研究,我们使用viSNE通过检查每个39个标记的表达水平来全面描述每个聚类的特征,并找出如图2C所示的不同标记组合。虽然 CyTOF 数据无法应用于当前的分拣技术,但其同时测量许多参数的优势可以帮助我们在有限参数内确定标记的最佳组合。数据分析的这一关键步骤帮助我们充分利用 CyTOF 结果,设计了一个与 FACS 兼容的基于荧光的分拣面板。例如,在本实验中,我们使用图 2C中的此信息构建了一个 13 色 FACS 面板,该面板允许我们通过流式细胞测定分离嗜中性粒细胞祖(NeP),以便进行下游功能测定(图3)。通过在管道中使用CyTOF和FACS,这些方法可以一起分离新发现的细胞类型,用于功能研究,如形态学、多功能性、体外测定和体内研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢LJI流式细胞学核心协助进行大规模细胞测量程序。这项工作得到了NIH授予R01HL134236、P01HL136275和R01CA202987(全部授予C.C.H)和ADA7-12-MN-31(04)(C.C.H.和Y.P.Z)的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
References
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