Summary
Wir präsentieren einen Ansatz zur Reinigung ribossomengebundener mRNA aus vaskulären Endothelzellen (ECs) direkt im Gehirn, der Lunge und im Herzgewebe der Maus über das EC-spezifische genetische Tag des verbesserten grünen Fluoreszenzproteins (EGFP) in Ribosomen in Kombination mit RNA-Reinigung .
Abstract
Viele Studien beschränkten sich auf die Verwendung von in vitro zellulären Assays und ganzen Geweben oder die Isolierung bestimmter Zelltypen von Tieren zur In-vitro-Analyse von Transkriptom und Genexpression durch qPCR- und RNA-Sequenzierung. Umfassende Transkriptom- und Genexpressionsanalyse spezifischer Zelltypen in komplexen Geweben und Organen wird entscheidend sein, um zelluläre und molekulare Mechanismen zu verstehen, durch die Gene reguliert werden, und ihre Assoziation mit Gewebehomöostase und Organ Funktionen. In diesem Artikel zeigen wir als Beispiel die Methodik zur Isolierung ribosomgebundener RNA direkt in vivo in der vaskulären Endothelie der Tierlunge. Die spezifischen Materialien und Verfahren für die Gewebeverarbeitung und RNA-Reinigung werden beschrieben, einschließlich der Bewertung der RNA-Qualität und -Ausbeute sowie der Echtzeit-qPCR für arteriogene Gen-Assays. Dieser Ansatz, der als Übersetzung der Ribosomen-Affinitätsreinigung (TRAP)-Technik bekannt ist, kann zur Charakterisierung der Genexpression und Transkriptomanalyse bestimmter Zelltypen direkt in vivo in jedem spezifischen Typ in komplexen Geweben verwendet werden.
Introduction
In komplexen Geweben wie Gehirn, Herz und Lunge erschweren die hohen Zellheterogenitätdien die Analyse von Genexpressionsdaten aus ganzen Gewebeproben. Um Genexpressionsprofile in einem bestimmten Zelltyp in vivo zu beobachten, wurde kürzlich eine neue Methodik entwickelt, die die Abfrage der gesamten übersetzten mRNA-Ergänzung eines genetisch definierten Zelltyps ermöglicht. Diese Methode wird als die übersetzende Ribosome Affinitätsreinigung (TRAP) Technik1,2bekannt. Es ist ein nützliches Werkzeug, um Endothelzellbiologie und Angiogenese in Kombination mit genetisch manipulierender anderer Angiogenese-assoziierter Gene bei Tieren zu untersuchen.
Wir haben gezeigt, dass angiogene PKD-1-Signalisierung und die Transkription des angiogenen Gens CD36 für die Endothelzelldifferenzierung (EC) und funktionelle Angiogenese3,4,5,6entscheidend sind. Um molekulare Mechanismen der angiogenen und metabolischen Signalisierung in der Gentranskription und der EG-Transdifferenzierung zu bestimmen, haben wir gentechnisch veränderte TRAP-Mäuse mit speziell gelöschten angiogenen Genen auf der Grundlage der TRAP-Technik1 erstellt. , 2. Darüber hinaus haben sie bei unseren TRAP-Tieren nicht nur pkd-1- oder cd36-Genmangel in der vaskulären Endothelie oder die globale Deletion des cd36-Gens, sondern ein verbessertes grünes Fluoreszenzprotein (EGFP) ist auch genetisch auf Die übersetzenden Ribosomen der EG. TRAP ermöglicht die Affinitätsreinigung von ribosomgebundener mRNA direkt aus der vaskulären Endothelie von Zielgeweben, was die Analyse der Genexpression und die Identifizierung neuer Transkriptome ermöglicht, die mit der EG-Differenzierung und Angiogenese direkt unter in vivo-Bedingungen. Wir haben bei diesen gentechnisch veränderten Tieren erfolgreich ribosomgebundene RNA aus der Endothelie isoliert. Die gereinigte RNA kann zur weiteren Charakterisierung angiogener oder arteriogener Gene bei der Regulation von EG-Differenzierung und -Funktionen verwendet werden. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Implementierung des TRAP-Ansatzes zur Isolierung von mRNA in ECs direkt in vivo.
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Protocol
Für Tierversuche wurden alle hier beschriebenen Methoden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Medical College of Wisconsin genehmigt.
1. Reagenzien vorbereiten
- Bereiten Sie Lysepuffer auf Konzentrationen von 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 100 mg/ml Cycloheximid, Proteaseinhibitoren und rekombinanten RNase-Inhibitoren auf Konzentrationen wie unten beschrieben vor.
- Folgende Reagenzien zu 500 ml RNase-freiem deionisiertem Wasser hinzufügen: 1,19 g HEPES, 5,59 g KCl, 0,24 g MgCl2, 35 mg DTT, 0,5 ml Cycloheximid und NaOH nach Bedarf bis pH 7,4, EDTA-freie Proteaseinhibitoren (eine Minitablette pro 10 ml) und RNase-Hemmer (1 0 l/ml).
- Bis zu 1 Monat in einem 4 °C-Kühlschrank aufbewahren.
- Bereiten Sie einen hochsalzigen Polysomen-Waschpuffer auf Konzentrationen von 10 mM HEPES, pH 7,4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1% vol/vol CA-630, 0,5 mM DTT und 100 mg/ml Cycloheximid vor.
- Folgende Reagenzien zu 500 ml RNase-freiem deionisiertem Wasser hinzufügen: 1,19 g HEPES, 13,05 g KCl, 0,24 g MgCl2, 5 ml nichtionisches, nicht denatierendes Reinigungsmittel, 5 von 7,7 mg DTT-Röhrchen und 0,5 ml Cycloheximid und NaOH bei Bedarf bis pH 7,4.
- In 4 °C Kühlschrank für bis zu 1 Monat aufbewahren.
- Binden Sie Anti-GFP-Antikörper an Protein G magnetische Perlen vor Beginn des Experiments.
- Fügen Sie 10 mg Anti-GFP-Antikörper in 200 ml PBS zu Protein G Perlen verdünnt.
- Mit End-over-End-Rotation 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Legen Sie die Perlen auf ein magnetisches Rack und entfernen Sie den Überstand.
- Die Perlen in 200 ml PBS aufhängen und bis zu 1 Woche im 4 °C-Kühlschrank aufbewahren.
- Eiskalte PBS mit 100 mg/ml Cycloheximid vorbereiten.
- Fügen Sie 1 Volumen Cycloheximidlösung (100 mg/ml) zu 99 Volumen eiskaltem PBS hinzu.
2. Isolieren und lysieren gewünschte Gewebe
- Euthanisieren Sie Mäuse durch IP-Injektion von Ketamin (500 mg/kg/Körpergewicht) und Xylazin (10 mg/kg/Körpergewicht) und isolieren Sie gewünschte Gewebe (z. B. Herz, Lunge). Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
- Gewünschte Gewebe in 500 ml eiskaltes PBS mit 100 mg/ml Cycloheximid geben.
- Hackgewebe in eine Zellsuspension mit einem motorgetriebenen Homogenisator oder einem Kleinglashomogenisator. Wenn Sie einen motorisch angetriebenen Homogenisator verwenden, begrenzen Sie die Homogenisierung bei niedriger Frequenz (<15.000 Hz) auf weniger als 1 Minute, um eine RNA-Denaturierung zu vermeiden.
- Zellpellet in 200 ml Lysepuffer durch Pipettieren und Neuziehen des Puffers mehrmals aussetzen. Zellsuspension mit 10 Hubs in einem Kleinglashomogenisator oder 15 Sekunden bei niederfrequentem (<15.000 Hz) in einem motorgetriebenen Homogenisator weiter homogenisieren.
- Zentrifugen homogenisieren für 10 min bei 2.000 x g bei 4 °C zu Pelletkernen und großen Zellablagerungen und halten den Überstand.
- Fügen Sie dem Überstand ein nicht-denaturierendes Reinigungsmittel zu 1% vol/vol und DHPC bis 30 mM hinzu. 5 min auf Eis bebrüten.
- Zentrifugenlysat für 10 min bei 16.000 x g zu Pellet unlöslichem Material. Übertragen und halten Sie 15% des klaren Lysats als Input für zukünftige Schritte.
3. Ribosom/mRNA-Komplexe isolieren
- Fügen Sie 50 ml antikörpergebundene Perlen zu zelllysaten überstand und inkubieren Mischung bei 4 °C mit End-over-End-Rotation für 30 min. Hier binden die Anti-GFP-Antikörper die GFP-markierten Ribosomen, so dass wir die RNA weiter von diesen Ribosomen isolieren können.
- Sammeln Sie Perlen auf einem magnetischen Rack und waschen Sie 5 Mal mit Hochsalz-Polysomen-Waschpuffer.
- Nach dem Sammeln von Perlen an der Seite des Rohres flüssigkeitsauf- und entsorgen. Dann Pipette und ziehen Sie 200 ml Hochsalz-Polysomen-Waschpuffer mehrmals neu. Wiederholen Sie diesen Schritt 5 Mal, und verwerfen Sie den gesamten Puffer nach der letzten Wiederholung. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
4. isolieren mRNA
- Legen Sie Perlen in den RLT-Puffer. Die folgenden Schritte werden direkt aus dem RNeasy Mini Kit Protokoll ausgeführt und in keiner Weise erweitert.
VORSICHT: RLT-Puffer enthält Guanidinsalze; NICHT mit Bleichmittel mischen. - Zentrifugenlysat für 3 min bei voller Geschwindigkeit 13.000 U/min oder 16.000 g bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig Überstand von 350 ml durch Pipettieren und übertragen Sie es auf ein neues Mikrofugenrohr. Verwenden Sie nur diesen Überstand (Lysat) in den nachfolgenden Schritten.
- Fügen Sie ein gleiches Volumen von 70% Ethanol in das Mikrofugenrohr.
- Übertragen Sie bis zu 700 ml der Probe, einschließlich aller möglicherweise gebildeten Ausfällungsmittel, in eine Spinsäule, die in einem 2 ml Sammelrohr platziert ist. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und Zentrifugen für 15 s bei 8.000 x g, um die Spinsäulenmembran zu waschen. Entsorgen Sie den Durchfluss.
- Fügen Sie der Spinspalte 350 ml Puffer RW1 hinzu. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und Zentrifugen für 15 s bei 8.000 x g, um die Spinsäulenmembran zu waschen. Verwerfen Sie den Durchfluss und verwenden Sie das Sammelrohr im nächsten Schritt wieder.
VORSICHT: Puffer RW1 enthält Guanidinsalze; NICHT mit Bleichmittel mischen. - Fügen Sie der Spinspalte 350 ml Puffer RW1 hinzu. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und Zentrifugen für 15 s bei 8.000 x g. Entsorgen Sie den Durchfluss.
- Fügen Sie der Spin-Spalte 500 ml Puffer-RPE hinzu. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und Zentrifugen für 15 s bei 8.000 x g, um die Spinsäulenmembran zu waschen. Entsorgen Sie den Durchfluss.
- Fügen Sie der Spin-Spalte 500 ml Puffer-RPE hinzu. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und zentrieren Sie 2 min bei 8.000 x g, um die Spinsäulenmembran zu waschen. Entfernen Sie dann vorsichtig die Spin-Spalte aus dem Sammelrohr, um sicherzustellen, dass die Spalte nicht mit dem Durchfluss in Berührungkommt.
- Legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml-Sammelrohr und entsorgen Sie das alte Rohr mit dem Durchfluss. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und Zentrifugen mit voller Geschwindigkeit für 1 min, um Restpuffer zu entfernen.
- Platzieren Sie die Spin-Spalte in einem neuen 1,5 ml-Sammelrohr. Fügen Sie 30-50 ml RNase-freies Wasser direkt in die Spinsäulenmembran ein. Schließen Sie den Deckel vorsichtig und zentrieren Sie 1 min bei 8.000 x g, um die RNA zu vereiteln.
- Wenn die erwartete RNA-Ausbeute >30 mg beträgt, wiederholen Sie Schritt 4.10 mit weiteren 30-50 ml RNase-freiem Wasser oder verwenden Sie Elute aus Schritt 4.10 (wenn eine hohe [RNA] erforderlich ist). Sammelrohr aus Schritt 4.10 wiederverwenden.
- Verwenden Sie gereinigte RNA für die nachgeschaltete Analyse einschließlich RNA-Sequenzierung oder quantitative randquantitative rquantitative PCR in Echtzeit oder speichern Sie RNA, die in RNase-freiemH2O bei -80 °C für bis zu 1 Jahr gelöst ist.
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Representative Results
Unsere früheren Studien4,7 deuten darauf hin, dass CD36 als Schalter für arteriolar Differenzierung und Kapillararterienarterienbildung über den LPA/PKD-1 Signalweg fungieren kann. Um zu untersuchen, ob die Signalachse LPA/PKD-1-CD36 für die Arteriogenese in vivo wesentlich ist, haben wir die neuartigen TRAP-Linien etabliert, die nicht nur einen globalen cd36-Mangel oder einen endothelialen-spezifischen-cd36- oder pkd-1-Mangel haben, sondern auch eine selektive Isolierung ermöglichen. ribosomgebundene RNA aus kreositierten Zelllinien durch GFP und sind als cre-aktivierter Fluoreszenzreporternützlich 2.
Durch die Durchführung der Genotypisierung beobachteten wir, dass das cd36-Gen global oder in der vaskulären Endothelie für endothelia-spezifische cd36 null-Mäuse (Daten nicht gezeigt) und das pkd-1-Gen auch in der vaskulären Endothelie gelöscht wurde. Abbildung 1 ist ein repräsentatives Ergebnis, das die erstellte globale CD36-TRAP- oder endotheliale-spezifische pkd-1-TRAP-Mauslinie zeigt. Mit Hilfe der Immunfluoreszenzmikroskopie haben wir gezeigt, dass ein verbessertes GFP genetisch auf die Ribosomen der Endothelzellen in vivo getaggt wird (Abbildung 2). Anschließend isolierten wir Ribosom gebundene mRNA direkt in vivo und erhielten erfolgreich qualitativ hochwertige RNA, wie durch Messung des Verhältnisses von 260 nm und 230 nm gezeigt wurde (Abbildung 3). Weitere Analysen mit Echtzeit-qPCR zeigten, dass die Expression bestimmter arteriogener Gene in der Lungenendothelie von cd36 Null-Mäusen hochreguliert wurde (Abbildung 4), was darauf hindeutet, dass die isolierte RNA direkt in vivo in der vaskulären Endothelie mit der TRAP Technologie sind für nachgelagerte Studien qualifiziert. Diese Studien umfassen die Analyse der Genexpression auf mRNA-Niveau und die Identifizierung neuartiger Transkriptome unter physiologischen und pathologischen Bedingungen, die für das Verständnis der Regulation der vaskulären Endothelzelldifferenzierung unerlässlich sind. und funktionelle Angiogenese.
Abbildung 1: Ein Beispiel für Genotypisierung für gentechnisch veränderte TRAP-Mäuse. Repräsentative Ergebnisse für die Genotypisierung von globalen cd36 null TRAP-Mäusen oder bedingten gewebespezifischen pkd-1 null TRAP-Mäusen. VEC-kretransgene Mäuse drücken Cre Recombinase unter der Kontrolle eines Cdh5-Promotors B6 aus; 129-Tg (Cdh5-cre)1Spe/J Mäuse waren Brot mit B6.129S4-Gt(ROSA)26Sor tm1(CAG-EGFP/Rpl10a,-birA)Wtp/J, und weiter mit B6.129S1tm1Mfe-cd36 /J oder pkd-1loxP/loxP. Die Doppelmutanten-Mäuse cd36 TRAP (A) und pkd-1 TRAP (B) wurden erhalten, bei denen ein verbessertes GFP auf L10a des Ribosoms in vaskulären Endothelzellen markiert ist und das cd36-Gen global gelöscht wird und pkd-1-Gen speziell in der vaskulären Endothelie. Mausschwänze wurden für die DNA-Extraktion mit einem Kit und auf der Grundlage der Anweisung des Herstellers gesammelt, und DNA in allen Proben wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verstärkt und dann durch 1-2% Agarose-Gel-Elektrophorese bewertet. Fotografien sind das Agarose-Gel-Bild, das die Ergebnisse der Verstärkung von cd36- oder pkd-1-Mutanten mit/ohne TRAP- oder Wildtyp-Mäuse (WT) zeigt. Maus-Genotyp-Panel A: Spur 1, cd36-/-; FALLE+/-; Spur 2, TRAP+/+; Spur 3, cd36-/-; FALLE+/+; Cdh5+/-; Spur 4, TRAP+/+; Cdh5+/-; Spur 5, cd36-/-; FALLE+/+; Cdh5+/-; Spur 6, cd36-/-; FALLE+/-; Cdh5+/-; Spur 7, TRAP+/+; Cdh5+/-; Spur 8, TRAP+/-; Spur 9, DNA-Leiter. Maus-Genotyp-Panel B: Spur 1, pkd-1fl/-; FALLE+/-; Cdh5+/-; Spur 2, pkd-1fl/fl; FALLE+/+; Cdh5+/-; Spur 3, pkd-1fl/-; TRAP+/+; Spur 4, pkd-1fl/fl; TRAP+/+; Cdh5+/-; Spur 5, pkd-1fl/fl; FALLE+/+; Cdh5+/-; Spur 6, pkd-1fl/-; Spur 7, DNA-Leiter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ein Beispiel für endotheliale verbesserte GFP-Expression unter Fluoreszenzmikroskop. Blutvaskuläre Endothelien im Lungengewebe von CD36 Knockout TRAP-Mäusen waren EGFP-positiv (grüne Farbe, Oberpanel) unter Immunfluoreszenzmikroskop. Das Fehlen des primären GFP-Antikörpers wurde als Negativkontrolle (unteres Panel) verwendet. Mausgewebe wurden mit GFP- und CD31-Antikörpern mit geeigneten sekundären Fluoreszenz-Antikörpern (rote Farbe) mitgefärbt. Repräsentative Bilder, die mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebungssystems aufgenommen wurden. Bar = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Qualität und Quantität der ribosomal gebundenen mRNA von Endothelzellen, die gereinigt und direkt aus Geweben von TRAP-Mäusen extrahiert werden. Ein Beispiel für Qualität und Konzentration von gereinigter RNA aus Lungengewebe in einer cd36 Knock-out-TRAP-Maus. Zur Beurteilung der Menge und Reinheit der extrahierten RNA wurde ein Spektralphotometer verwendet. Wie in dieser Abbildung dargestellt, beträgt die Konzentration der RNA 51,2 ng/l. Das Absorptionsverhältnis bei 260 nm und 280 nm beträgt 1,87, während das Verhältnis von 260 nm und 230 nm 2,40 beträgt, was auf die Reinheit der extrahierten RNA-Proben hinweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Ein Beispiel für die Expression von angiogenen Genen und Kerbligaden in der ribosomgebundenen RNA von Endothelzellen durch Echtzeit-qPCR-Assays. Die isolierte mRNA aus dem endothelialer Ribosom der Lunge in der TRAP-Steuerung und EC-spezifische cd36-Mangel-TRAP-Mäuse wurde in Echtzeit qPCR-Assays unterzogen, indem Primer verwendet wurden, die von einem Biotech-Unternehmen wie Hey2, Ephrin B2 und Delta-ähnlichen Liganden gekauft wurden. 4 (DLL4). Die Haushaltegene PPIA wurden zur Normalisierung verwendet. Der Schüler-t-Test wurde für die statistische Analyse verwendet. *P < 0,05; **P <0.01.
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Discussion
Die Angiogenese ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, bei dem DIE EC-spezifische angiogene Gentranskription und -expression eine wesentliche Rolle bei der EG-Differenzierung und angiogenen Reprogrammierung3,4spielen. Um die Barrieren aus der zellulären Vielfalt und architektonischen Komplexität zu überwinden, um die Funktion des Säugetiergefäßsystems auf molekularer Ebene in vivo besser zu verstehen, haben wir EC-spezifische TRAP-Mäuse geschaffen, begleitet von EC-spezifischen cd36 , EC-spezifischer pkd-1-Mangel oder globaler cd36-Mangel durch Verwendung eines vielseitigen Floxed-TRAP-Mausmodells oder EGFP-TRAP, das im Pu-Labor2 in Kombination mit anderen gentechnisch veränderten Mauslinien erzeugt wird. Dies ermöglicht die Untersuchung der gesamten übersetzten mRNA-Ergänzung von Gefäß-ECs aus intaktem Gewebe in vivo unter EG-spezifisch in pkd-1 oder einem globalen Mangel an cd36-Genexpression 8, der für die Untersuchung Gentranskription im Zusammenhang mit physiologischer und pathologischer Angiogenese4,7,9,10. Im Einklang mit anderen Studien1,2benötigt unser Ansatz zur Isolierung von EC-spezifischer mRNA keine Gewebefixierung, Dissoziation von Geweben oder Isolierung von Einzelzellen aus Geweben und vermeidet so die potenziellen Artefakte, die sich aus diesen Behandlungen ergeben. Wir waren auch in der Lage, TRAP-Reinigungen durchzuführen und hochwertige ribosomgebundene mRNA aus dem gefrorenen Gewebe zu extrahieren. Zusätzlich wurde der übersetzte mRNA-Gehalt von ECs direkt in vivo gereinigt, der den Proteingehalt besser darstellt als die Verwendung der gesamten RNA für das Genexpressionsprofil. Darüber hinaus kennzeichnet das TRAP-Transgen die ECs genetisch mit EGFP, was nicht nur die Extraktion von ribosomgebundener mRNA, sondern auch die Visualisierung in immunhistochemischen oder elektrophysiologischen Studien ermöglicht.
Der Ansatz zeigte jedoch niedrige RNA-Ausbeuten, insbesondere bei gereinigten mRNA aus Herzgeweben oder aus zuvor gefrorenem Gewebe. Wir brauchen daher die Bedingungen zu optimieren, um die Erträge zu erhöhen. Bei EG-spezifischen cd36-Mäusen mit Mangel an Ephrin B2 und DLL4 waren jedoch sowohl bei der Lunge ( Abbildung4) als auch bei den Herz-(Daten nicht gezeigt) Endothelien im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöht. Diese Ergebnisse stimmten mit unseren früheren In-vitro-Studien3,4überein, was darauf hindeutet, dass die RNA-Qualität für nachgelagerte Analysen ausreicht. Die Ausbeute war möglicherweise aufgrund der strengen Bedingungen gering. Um diese Einschränkung zu überwinden und die Ausbeute zu verbessern, ist es wichtig, eine RNase-freie Arbeitszone einzurichten und Arbeitsflächen und Geräte zu dekontaminieren, die mit RNase kontaminiert werden können, und häufig Handschuhe zu wechseln, um hochwertige RNA zu extrahieren. Es ist auch wichtig, geeignete Konzentrationen von GFP-Antikörpern in der Affinitätsmatrix zu finden und geeignete Konzentrationen von RNase-Inhibitoren im Gewebelysepuffer zu verwenden. Die Verwendung von RNase-freien Kunststoffwaren und Reagenzien ist vorteilhaft für die RNA-Extraktion aus endotheliaalen Ribosomen des zielgerichteten Gewebes.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Acknowledgments
Dr. Rens Arbeit wird von der American Heart Association (13SDG14800019; BR), der Ann es Hope Foundation (FP00011709; BR), die American Cancer Society (86-004-26; das MCW Cancer Center to BR) und das National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan Palmer wird vom MCW CTSI 500 Stars Internship Program 2018 unterstützt; P. Moran wird von einem Institutional Research Training Grant von NHLBI (5T35 HL072483-34) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
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