Summary
O objetivo deste protocolo é isolar as células mononucleares que residem na lâmina própria do cólon por digestão enzimática do tecido usando Collagenase. Este protocolo permite a isolação eficiente de pilhas mononucleares tendo por resultado uma única suspensão da pilha que por sua vez possa ser usada para immunophenotyping robusto.
Abstract
O intestino é a casa para o maior número de células imunes no corpo. A exposição da polícia intestinal de pequenos e grandes sistemas imunológicos a antígenos exógenos e modulam respostas a potentes estímulos imunológicos derivados microbialmente. Por esta razão, o intestino é um local principal alvo de desregulação imune e inflamação em muitas doenças, incluindo mas, não limitado a doenças inflamatórias intestinais, como a doença de Crohn e colite ulcerosa, doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) após o osso transplante de medula óssea (TMO) e muitas condições alérgicas e infecciosas. Os modelos murinos de inflamação e colite gastrintestinal são fortemente utilizados para estudar as complicações do GI e para otimizar as estratégias de prevenção e tratamento pré-clinicamente. Os dados recolhidos destes modelos através da isolação e da análise fenotípica de pilhas imunes do intestino são críticos para uma compreensão imune mais adicional que possa ser aplicada para amenizar desordens inflamatórios gastrintestinais e sistemáticas. Este relatório descreve um protocolo altamente eficaz para a isolação de pilhas mononucleares (MNC) dos dois pontos usando uma relação sílica-baseada misturada do inclinação da densidade. Este método isola revisivelmente um número significativo de leucócito viáveis ao minimizar contaminando restos, permitindo o fenótipo imune subseqüente pela citometria do fluxo ou pelos outros métodos.
Introduction
Embora o trato gastrointestinal (GI) é principalmente dedicado ao processamento e reabsorção de nutrientes de alimentos, o trato gastrointestinal também mantém papéis centrais na integridade dos sistemas vasculares, linfáticos e nervosos e de numerosos outros órgãos através seu sistema imunológico mucoso e submucoso1. O sistema imunológico Gi tem um papel influente na saúde gastrointestinal e sistêmica, devido à sua exposição constante a antígenos estrangeiros de alimentos, bactérias comensais ou agentes invasores1,2. Assim, o sistema imunológico gastrointestinal deve manter um equilíbrio delicado no qual tolera antígenos não patogênicos enquanto respondesse apropriadamente aos antígenos patogênicos1,2. Quando o equilíbrio de tolerância e defesa é interrompido, a desregulação imune localizada ou sistêmica e a inflamação podem ocorrer resultando em uma infinidade de doenças1,2,3.
O intestino abriga pelo menos 70% de todas as células linfóides no corpo4. A maioria de interações imunológicas preliminares envolvem pelo menos uma de três estações imunes no intestino: 1) Peyer ' remendos de s, 2) linfócitos intraepithelial (IEL) e 3) linfócitos do própria do lamina (LPL). Cada uma delas é composta por uma complexa rede interconectada de células imunes que respondem rapidamente aos desafios imunes normais no intestino5. Restrita ao estroma acima da musculatura Mucosae, a lâmina própria vagamente estruturada é o tecido conjuntivo da mucosa intestinal e inclui andaimes para o villus, a vasculatura, drenagem linfática e sistema nervoso mucoso, bem como muitos inatos e subconjuntos imunes adaptativos6,7,8,9. As LPL são compostas por células T CD4+ e CD8+ em uma proporção aproximada de 2:1, células plasmáticas e células de linhagem mielóide, incluindo células dendríticas, mastócitos, eosinófilos e macrófagos6.
Há um interesse crescente em compreender o desregulação imune e a inflamação do intestino como pertence aos vários Estados da doença. Tais condições como a doença de Crohn e colite ulcerosa todos manifestam diferentes níveis de inflamação do cólon10,11,12. Adicionalmente, os pacientes com desordens malignos ou não-malignos da medula ou do sistema imune que se submetem a uma transplantação allogeneic da medula (Allo-BMT) podem desenvolver várias formas da colite que incluem 1) toxicidade direta dos regimes condicionantes antes de BMT,2) infecções causadas por imunossupressão após BMT e 3) doença do enxerto versus hospedeiro (DECH) impulsionada por células T do tipo doador reagindo a antígenos de Allo nos tecidos após o BMT13,14,15. Todas essas complicações pós-BMT resultam em alterações significativas no ambiente imunológico dos intestinos16,17,18. O método proposto permite uma avaliação confiável do acúmulo de células imunes no cólon do camundongo e, quando aplicado aos receptores murinos após a TMO, facilita um ensaio eficiente de células imunes de doadores e receptores envolvidas na tolerância ao transplante19 ,20. Causas adicionais de inflamação intestinal incluem malignidades, alergias alimentares, ou perturbação do microbioma intestinal. Este protocolo permite o acesso de pilhas mononucleares do intestino do cólon e, com modificações, aos leucócito do intestino pequeno em alguns destes modelos murino pré-clínicos.
Uma pesquisa PubMed usando os termos de pesquisa "intestino e célula imune e isolamento" revela mais de 200 publicações descrevendo métodos para a digestão do intestino delgado para extrair células imunes. Entretanto, uma busca similar da literatura para dois pontos não rende nenhuns protocolos bem delineados que especificam a isolação de pilhas imunes dos dois pontos. Isto pode ser porque o cólon tem mais camadas musculares e intersticiais, tornando-o mais difícil de digerir completamente do que o intestino delgado. Diferentemente dos protocolos existentes, este protocolo utiliza especificamente a Collagenase E de Clostridium histolyticum sem outras colagenases bacterianas (Collagenase D/Collagenase I). Nós demonstramos que, usando este protocolo, a digestão do tecido relativo ao cólon pode ser conseguida ao preservar a qualidade de pilhas imunes mononucleares isoladas do intestino (MNC) sem a adição de reagentes antiaglutonantes tais como o versenate do sódio (EDTA), Dispase II, e desoxirribonuclease i (DNase i)21,22,23. Este protocolo é aperfeiçoado para permitir a extração robusta reprodutível de MNC viável do cólon murino para uns estudos dirigidos mais adicionais e deve emprestar-se ao estudo da imunologia do cólon ou (com modificações) o intestine pequeno24, a 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os estudos foram conduzidos protocolos de pesquisa de roedores revisados e aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da faculdade de medicina da Universidade de Miami Miller, que atende aos padrões veterinários estabelecidos pela associação americana para laboratório de Zootecnia (AALAS).
1. preparação de soluções
-
Conforme descrito na tabela 1, prepare o buffer de cólon, mídia de separação de densidade baseada em sílica 100%, mídia de separação de densidade baseada em sílica 66%, mídia de separação de densidade baseada em sílica 44%, tampão de digestão de Collagenase E e tampão FACS.
- Prepare o tampão dos dois pontos o dia antes do procedimento e armazene durante a noite em 4 ° c.
- Prepare 100% de separação de sílica-based densidade Media no dia anterior ao procedimento e armazenado durante a noite a 4 ° c, colocando à temperatura ambiente a manhã do procedimento a descongelar.
- Prepare 66% e 44% meios de separação à base de sílica na parte da manhã do isolamento, usando a temperatura ambiente 100% sílica-based densidade meios de separação e buffer de cólon.
- Meça a quantidade apropriada de Collagenase e de Clostridium histolyticum-derivado e armazene em-20 ° c durante a noite antes do procedimento. Na manhã seguinte, dissolver no volume adequado de cólon buffer para derivar Collagenase digestão buffer. Para todas as incubações com tampão da digestão de Collagenase no dia do procedimento, aqueça previamente as soluções a 37 ° c.
- Para a totalidade das etapas do protocolo, mantenha uma centrífuga a 20 ° c e a velocidade de rotação de 859 x g, com freios inativados (0 desaceleração) para centrifugação de gradiente. Definir outro a 4 ° c e velocidade de rotação de 859 x g, com a desaceleração padrão, para as etapas de lavagem.
2. colhendo o cólon
- Eutanizar o rato via CO2 asfixia seguida pelo método confirmatório aprovado pela aalac.
- Coloque o mouse em uma posição supina e pulverize a pele com 70% de etanol. Usando grandes tesouras do tecido, faça uma incisão vertical do midline e exponha o peritoneum intacto.
- Usando tesouras finas da dissecção, abra o peritoneum. Use fórceps para mover o intestino delgado para um lado e expor o cólon descendente. Puxe ligeiramente para cima no cólon descendente para expor maximamente a porção retal do cólon. Corte o reto distal profundamente na pelve e dissecar e remover todo o cólon como uma unidade, do reto distal ao tampão cecal.
- Transfira os dois pontos em 20 mL de tampão de cólon refrigerado em um tubo de polipropileno 50 mL.
3. limpando o cólon
- Coloc os dois pontos em uma toalha de papel umedecida e extraia o tamborete contínuo aplicando a pressão suave à parede das entranhas com a extremidade sem corte das tesouras ou do fórceps.
- Coloque os dois pontos em uma placa de Petri e lave o intestino com 10 mL de tampão de cólon resfriado usando uma seringa de 10 mL com agulha de preenchimento sem corte de 18 G.
- Transfira os dois pontos para um buffer de cólon umedecido toalha de papel e retire o mesenteria e gordura com a extremidade afiada da tesoura.
- Coloc os dois pontos em um prato de Petri enchido com 5-10 mL refrigerou o amortecedor dos dois pontos que agitam manualmente para lavar o Sumário relativo ao cólon restante. Repita 2-3 vezes.
- Corte os dois pontos longitudinalmente de sua extremidade rectal mais muscular aos dois pontos proximal (gerando uma única parte aberta retangular dos dois pontos) em um prato de Petri enchido com o amortecedor refrigerado fresco dos dois pontos. Descarte a mídia existente e reabasteça com buffer Colon limpo e refrigerado.
- Lave o intestino 3 vezes, agitando-o vigorosamente na placa de Petri e substituindo o 5-10 mL de tampão de cólon refrigerado depois com cada lavagem.
- Coloque o tecido do cólon retangular em uma toalha de papel umedecida com Colon buffer e cortá-la cortando-a horizontalmente e, em seguida, em pequenos fragmentos (3 mm x 3 mm seções).
- Colete os fragmentos de cólon cuidadosamente usando fórceps fino em 20 mL resfriado Colon buffer em um tubo de polipropileno 50 mL cônico.
- Lave os fragmentos do cólon 3 vezes, cada lavagem em 20 mL de tampão de cólon, agitando vigorosamente o tubo para 30 s. entre cada agitação, permita que os fragmentos do tecido se instalem à parte inferior do tubo. O decant ou o vácuo aspiram o sobrenadante ao impedir a perda do fragmento do tecido no processo da aspiração entre cada lavagem.
Nota: Não há necessidade de mudar o tubo após cada lavagem.
4. digestão da Collagenase 1
- Adicione 20 mL do tampão de digestão de Collagenase aos fragmentos de cólon lavado no tubo cônico de polipropileno 50 mL.
- Coloque o tubo fechado de 50 mL a 37 ° c em um agitador orbital incubado com a taxa de rotação ajustada em 2 x g por 60 min. Assegure-se de que os fragmentos de tecido estejam em movimento constante durante a agitação; se necessário, aumente a taxa de rotação incrementalmente para garantir que nenhum fragmento de tecido se estabeleça na parte inferior do tubo.
5. Prepare gradientes de mídia de separação à base de sílica
- Prepare 66% e 44% de mídia de separação de densidade baseada em sílica, usando 100% de mídia de separação de densidade baseada em sílica a 20 ° c (temperatura ambiente) e buffer de cólon.
- Despeje 5 mL de 66% de meios de separação de densidade à base de sílica em cada um dos 3 tubos de polipropileno separados de 15 mL. Prepare 3 tubos por dois pontos. Isso forma a base de densidade mais alta do procedimento de isolamento de gradiente, na qual a mídia de separação de menor densidade será mergulhada para criar o gradiente de separação.
- Conservar a 20 ° c até à utilização.
6. coleção de sobrenadante da digestão 1
- Colete apenas o sobrenadante usando uma pipeta sorológica de 25 mL e filtre o sobrenadante através de um filtro de célula de tecido de filtração de poros de 40 μm colocado em um tubo cônico de polipropileno 50 mL limpo, após a conclusão da digestão de Collagenase 1. Tenha cuidado para não aspirar quaisquer fragmentos de tecido existentes.
Nota: Guarde os fragmentos de tecido visíveis restantes no tubo. Estes serão submetidos a segunda digestão da colagenase (passo 8).
7. têmpera Collagenase digestão tampão
- Encha o tubo de polipropileno 50 mL completamente com o tampão de cólon refrigerado.
Nota: A Collagenase está ativa a 37 ° c; assim, o tampão refrigerado inactiva esta enzima. - Centrifugue o tubo a 4 ° c a 800 x g durante 5 min.
- Descarte o sobrenadante via aspiração a vácuo. Lave as células com 25 mL de tampão de cólon fresco e Centrifugue a 800 x g durante 5 min.
- Ressuscitem a pelota em menos de 1 mL de tampão de cólon fresco refrigerado.
- Coloque o tubo cônico de polipropileno 50 mL no gelo.
8. digestão 2 de Collagenase
- Repita a etapa 4 (digestão 1) com os fragmentos restantes do tecido retidos da etapa 6,1.
9. desagregação tecidual após digestão 2
- Lave os fragmentos de tecido vigorosamente para frente e para trás entre o tubo e uma seringa de 10 mL através de uma agulha de extremidade sem corte de 18 G.
- Repita este flush para um mínimo de 7-8 passagens completas, continuando até que nenhum fragmento de tecido bruto ou detritos sejam visíveis.
10. filtrar células
- Passe a suspensão de desagregação tecidual através de um filtro de célula de tecido de filtração de poros de 40 μm em um tubo de polipropileno 50 mL limpo.
- Lave o filtro de célula de tecido de filtração com 10 mL de tampão de cólon refrigerado para recuperar todas as células enreadas no filtros.
11. têmpera Collagenase digestão
- Encha o tubo cônico de polipropileno 50 mL para a jante com tampão de cólon refrigerado.
Nota: A temperatura do tampão dos dois pontos é crítica para assegurar a têmpera da atividade do colagenase. - Girar a 4 ° c e 800 x g por 5 min.
- Descarte o sobrenadante via aspiração a vácuo.
- Lave com resuspensão em 25 mL de tampão cólon fresco refrigerado, seguido de centrifugação a 4 ° c, 800 x g por 5 min.
- Descarte o sobrenadante via aspiração a vácuo.
- Agrupe a pelota ressuscipended da digestão 1 de Collagenase (etapa 7) a seu tubo correspondente da etapa 11,4.
- Repetir o passo 11,4 (lavagem e centrifugação).
12. separação sílica-baseada da separação dos media do inclinação da densidade
Nota: Execute as etapas 12-18 o mais rapidamente possível, para assegurar a têmpera rápida da atividade do colagenase.
- Após a etapa 11,7, ressuscite cada pellet em 24 mL de total de 44% de separação de sílica-based densidade Media por cólon.
- Mergulhe lentamente 8 mL da mídia da etapa 12,1 em cada um dos três tubos preparados na etapa 5,2 (contendo 66% de mídia de separação de densidade baseada em sílica), usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Mantenha um fluxo constante e lento dos meios de separação da densidade de 44% ao mergulhar o inclinação a fim evitar a interrupção da relação.
- Balance cuidadosamente todos os tubos dentro das caçambas de centrifugação usando uma balança ou balança.
- Gire os tubos 20 min a 859 x g em uma centrífuga sem freio a 20 ° c. Permita que os rotores venham terminar o descanso antes de remover os tubos, tomando o cuidado para não interromper as pilhas na relação do inclinação.
13. colete células mononucleares da interface de gradiente
- Visualize a interface de gradiente (perto da marca de 5 mL), onde normalmente uma faixa branca grossa de 1-2 mm (contendo MNC) está presente.
Nota: Um pode ou não pode ver uma faixa branca. Entretanto, o MNC estará nesta relação e deve nuvem a claridade da relação do inclinação. - Aspirar a vácuo e descartar o Top 7 mL do gradiente superior para permitir o acesso mais fácil pipeta para a interface.
- Usando a sucção manual contínua e o movimento de giro constante do pulso, colete a camada de relação das pilhas em um tubo cónico do polypropylene 50 mL limpo. Colete até que a interface entre os 2 gradientes é clara e corpos (clara de células).
- Encha o tubo de recolha com 50 mL de tampão FACS refrigerado. Girar a 4 ° c, 800 x g por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante através de aspiração a vácuo e suspender o pellet em 1 mL de FACS buffer.
- Conte as células em um hemocitômetro em uma diluição 1:2 usando métodos apropriados de exclusão de células mortas.
- Proceder à coloração de FACS ou outros ensaios com MNC Colônico recém-isolado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ao trabalhar com modelos de doença de cólon murino, é útil ser capaz de quantificar e avaliar qualitativamente, entre os MNC do cólon, múltiplos subconjuntos de células imunes envolvidas no processo inflamatório. A suspensão de uma única célula de MNC obtida através da aplicação deste protocolo facilita a caracterização fenotípica de forma robusta e reprodutível. Como prova de princípio para a aplicação deste método de isolamento diversas configurações experimentais, foi obtida a MNC Colônica utilizando este método e realizou citometria de fluxo multiparâmetro em células isoladas de camundongos com (Figura 1 e Figura 2 , BMT allogeneic) e sem (Figura 2a, BMT syngeneic) ferimento relativo ao cólon imune-negociado significativo que segue BMT.
A citometria de fluxo e as análises de dados foram realizadas para comparar as frações de linfócitos mortos apoptóticos e necróticos ao usar Collagenase E ou D para o isolamento, com ou sem tratamento com DNase 1. A estratégia de gating utilizada durante a citometria de fluxo é fornecida na Figura 1a. Na sequência de anexina v (marcador de apoptose) e corante vivo/morto azul fixo (marcador de necrose) que se mancha em suspensões de células simples após cada isolamento, a Collagenase e sem DNAse apresentou uma percentagem significativamente mais elevada de anexina Vneg Live/Dead Blueneg células ao vivo (mediana 43,3%, intervalo de 26,5%-59,9%, n = 3) após o isolamento quando comparado à Collagenase D sem DNase (mediana 8,7%, intervalo 3,6%-10,2%, n = 3), mesmo quando comparado com Collagenase E + DNase (mediana 8,18%, intervalo 4,7%-20,4%, n = 3) ou Collagenase D + DNAse (mediana 15.10%, intervalo 9,9%-21,4%, n = 3). Além disso, identificamos células necróticas de anexina VnegLive/Dead Blue + em uma porcentagem mediana de 41,0% no grupo Collagenase e (intervalo 37,1%-58,8%, n = 3) versus 90,0% no grupo Collagenase D (intervalo 69.7%-95,5%, n = 3), 75,9% na Collagenase e + DNAse grupo, e 80,3% no grupo Collagenase D + DNAse, respectivamente (variação de 2, 6%-79,5%, variação de 2, 9%-89,9%, n = 3). As parcelas representativas do FACS de n = 1 animal em cada grupo são mostradas na Figura 1b).
Como mais uma prova de princípio da consistência e rendimento de MNC viável utilizando este procedimento em camundongos doentes, a citometria de fluxo Multiparamétrico foi aplicada ao MNC isolado de ratos de receptor de CD 45,2 BALB/c no dia 7 após receber TMO de ambos os alogênicos (CD C57BL/6 doador) ou syngeneic (CD de b Usando números absolutos de MNC multiplicados por subconjuntos imunes de porcentagem gated obtidos por análises de citometria de fluxo, números absolutos médios das células CD4+ e CD8+ T do doador extraídos do cólon do receptor de BMT podem ser calculados e comparados (n = 4 por grupo, Figura 2a). Uma vez que pode ser importante identificar e/ou quantitar populações raras de células imunes em tais modelos de camundongo, avaliamos subconjuntos raros, incluindo células reguladoras derivadas de doadores (CD Foxp3 +)+ T (TREG) emmodelos de BMT singeneic e alogênico. A estratégia de gating para alcangar pilhas de TREG do doador (CD4+CD25+FoxP3+) da suspensão anticorpo-manchada da única pilha é mostrada (seqüência dos portões delineados por uma seta vermelha; Figura 2b). Usando este método, mesmo os subconjuntos raros tais como o doador derivado Colônica de TREG que infiltram os dois pontos do rato do receptor após BMT poderiam ser analisados (Figura 2C, parcela representativa; n = 1).
A Figura 3 mostra uma aplicação prolongada deste método em dados históricos de nosso grupo usando o protocolo apresentado para comparar a acumulação de pilhas de T doador-derivadas de GVHD-induzindo versus CD4 + nos dois pontos de camundongos Balb/c protegidos ou não protegidos de GVHD pelo regime preparativo de tratamento pré-BMT (condicionamento)20. Os regimes preparativa testados incluíram 800 cgy/irradiação total myeloablative do corpo (TBI800) ou TBI não-myeloablative (400tbi), assim como o condicionamento nonmyeloablative usando a irradiação lymphoid total (tli) em que a irradiação foi entregada à linfa nódulos, Timo e baço com blindagem do crânio, pulmões, membros, pélvis e cauda. Todo o condicionamento foi combinado com o soro anti-thymocyte (ATS), um agente imunomodulador. Tão cedo quanto o dia 6 após o BMT, este protocolo relativo ao cólon do isolamento de MNC conduziu às análises citométricas robustas do fluxo em comparação às análises idênticas em uns órgãos mais enriquecidos do alvo da GVHD do linfócito tais como o spleen e os nós de linfa mesentérica (mln) (Figura 3a)20 . A isolação reprodutível de MNC relativo ao cólon através dos receptores de BMT (n = 7-10 por o grupo do tratamento) permitiu uma comparação estatística robusta de números absolutos de pilhas T do doador CD8+ do efetoras entre grupos de tratamento condicionantes diferentes do condicionamento de pré-transplante ( Figura 3B), produzindo dados importantes sobre fenótipos imunes que levaram a estudos-chave revelando os mecanismos imunes inatos da proteção da GVHD da tli em oposição ao condicionamento TBI pré-BMT. 20 anos de
Figura 1: análise citométrica de fluxo de MNC Colônica no dia 7 após BMT em sistemas allogeneic do modelo do rato quando isolados com Collagenase e e D com e sem DNase 1. Camundongos do tipo Wild (WT) (CD 45,2+) Balb/c (H2Kd +) receberam BMT de CD45 CONGÊNICAS (CD-2 +) C57Bl/6 camundongos doadores (BMT alogênico, n = 3 por grupo). Os camundongos destinatários do WT (CD 45,2+) Balb/c foram administrados 800cGy TBI (Balb/c) 1 dia antes do BMT. No dia 7 após BMT, suspensões de células individuais de cólon receptor foram preparadas seguindo os métodos deste manuscrito com o uso de Collagenase E (100 U/mL), Collagenase E (100 U/mL) com DNAse 1 (500 μg/mL), Collagenase D (500 μg/mL), ou Collagenase D (500μg/mL) com DNAse 1 (500μg/mL) (n = 3 por grupo). As células foram coradas com anticorpos Live/Dead-UV450 (Live/Dead Blue), Anexin V-APC, H-2Kd-PE, CD BV605, CD3-FITC, CD4-BV711, CD8-APC-Cy7, FoxP3-Pacific Blue e CD11B-PE-Cy7. A) estratégia de gating para análises FACS. Portão 0, dispersão para frente (FSC-a) e dispersão lateral (SSC-a) sobre a suspensão de célula única de MNC usada para identificar leucócitos; Portão 1, exclusão de células não únicas utilizando SSC-A; Portão 2, exclusão de células não-únicas usando FSC-A; Porta 3, identificação de subconjuntos de células v-negativos (apoptóticos) e de viabilidade fixável ao vivo/morto-UV450+anexina (necrótica). (B) parcelas representativas de FACS de anexina V e coloração por corante de viabilidade fixável de leucócitos fechados entre MNC para os 4 grupos experimentais. N = 1 rato representativo por grupo em grupos: Collagenase E (100 U/mL), Collagenase E (100 U/mL) + DNAse 1 (500 μg/mL), Collagenase D (500 μg/mL) e Collagenase D (500 μg/mL) + DNAse 1 (500 μg/mL). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: caracterização citométrica do fluxo de MNC no dia 7 após o TMO em sistemas alogénicos e syngeneic do modelo do rato. Os camundongos WT (CD 45,2+) C57Bl/6 (H2Kd-neg) e Balb/c (H2Kd +) receberam TMO de camundongos doadores de CD45-congênicos (CD-2 +) C57Bl/6 e Balb/c (BMT singeneico ou alogênico, n = 4 por grupo experimental). Camundongos C57BL/6 e BALB/c receberam regimes preparativos de condicionamento de 950cGy (C57BL/6) e 800cGy (BALB/c) mielablativo TBI, entregues um dia antes do BMT. No 7º dia após o BMT, suspensões de células únicas de MNC Colônica destinatária foram preparadas seguindo os métodos deste manuscrito. As células foram coradas com anticorpos Live-Dead-BV510, H-2Kd-PE, CD BV605, CD4-FITC, CD8-APC-CY7, CD25-PacificBlue, FOXP3-AF647 e CD11B-PE-Cy7, N = 4 camundongos por grupo. (A) média ± sem número absoluto (log 10) CD-0 + h-2Kd-neg ou CD+ h-2Kd + (doador-tipo, em cada caso) CD11bnegCD4+ e CD8+ células T isoladas de cólon receptor no dia 7 após condicionamento e CD C57BL/6 (doador) → CD 45,2 BALB/c (recebedor) BMT. N = 4 por grupo. (B) estratégia de gating para análises FACS. Portão 0, dispersão para frente (FSC-a) e dispersão lateral (SSC-a) sobre a suspensão de célula única de MNC usada para identificar leucócitos; Portão 1, exclusão de células não únicas utilizando SSC-A; Portão 2, exclusão de células não-únicas usando FSC-A; Portão 3, portão de seleção de células ao vivo 4, separação de células hematopoiéticas do doador BMT versus origem do receptor BMT; Portão 5, seleção de células de linhagem não mielóide doadoras; Portão 6, gating seletivo de células T CD4+ ; Portão 7, separar a gating de CD4+CD25+FoxP3+ T reguladores (TREG) células. A seta vermelha denota a estratégia de gating da broca-para baixo. C) parcelas representativas de CD25 e coloração FoxP3 utilizando a estratégia de gating em (B) no dia 7 após condicionamento e BMT no cólon de um receptor Balb/c de BMT alogénico (C57Bl/6 → Balb/c). A percentagem de células em cada portão é dada dentro do portão. WT = tipo Wild; TBI = irradiação corporal total; BM = 10 x 106 CD C57Bl /6 ou Balb/c células de medula óssea congênicas; Teff = T células efetoras; Treg = Foxp3+ T células reguladoras. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: tli/ATS não mieloablativos, mas não TBI/ATS condicionantes diminui a acumulação de células T de tcrαβ+CD8+ efetoras. (A) parcelas representativas de FACS de coloração CD4 e CD8 de células h-2Kb +tcrαβ+ fechadas de camundongos doadores h-2Kb + C57Bl/6 no baço (fileira superior), linfonodo mesentérico (mln) (fileira média) e cólon (fileira inferior) de receptores no dia 6 após condicionamento e transplante. Percentagem de células em cada portão é dada acima do portão. (B) média ± sem número absoluto (log 10) H-2KB +tcrαβ+células CD8+ no baço (painel superior), mln (painel médio) e cólon (painel inferior) dos receptores no dia 6 após condicionamento e BMT. WT = Wild-tipo; TBI = irradiação corporal total; TLI =: irradiação linfoide total; ATS = soro anti-thymocyte; BM = 50 x 106 WT C57Bl/6 células doadoras de medula óssea; NPS = 60 x 106 WT C57Bl/6 células do baço do doador; TBI800, TBI400 = doses de cgy de TBI mieloablativa (TBI800) ou não-mieloablativa (TBI400). * Este número foi modificado de Van der Merwe et al.20. Copyright 2013. A associação americana de imunologistas, Inc. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | Fórmula |
| Tampão dos dois pontos | 500 mL RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS (calor-inactivated em 56oC para 60 minutos, pH ajustado a 7,3) |
| Sílica-based densidade gradiente Media 100% (por dois pontos) | 22,5 mL de meios de gradiente de densidade à base de sílica + 2,5 ml de PBS 10x. |
| Sílica-based densidade gradiente Media 66% (por dois pontos) | 10,72 mL de densidade baseada em sílica gradiente Media 100% + 5,28 ml buffer de cólon |
| Sílica-based densidade gradiente Media 44% (por dois pontos) | 11 mL de densidade baseada em sílica gradiente Media 100% + 14 ml buffer de cólon |
| Tampão da digestão do Collagenase (por dois pontos) | 100 U/mL de Collagenase E de Clostridium histolyticum, dissolvidos em 40 ml de tampão do cólon |
| Tampão de FACS | 500 mL 1X PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0,2 g azida sódica |
Tabela 1: tabela de preparação da solução.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo Visual descreve métodos bem tolerados para a isolação de pilhas mononucleares Colônica que incluem linfócitos do própria do lamina (LPL). Dado que este protocolo foi otimizado na avaliação de modelos graves de colite pós-transplante de camundongo, onde citocinas inflamatórias e lesão tecidual se prestam à má viabilidade da MNC recuperada, prevemos que esses métodos podem ser traduzidos para outros aplicações que exigem a análise fenotípica do MNC relativo ao cólon. Estes incluem, mas, não estão limitados a avaliar a inflamação dos dois pontos em modelos de rato de doença inflamatória intestinal, estudos de respostas imunes de tratamentos de colite-alvo, e colite produzida por agentes patogénicos infecciosos. Adicionalmente, nossos dados utilizando isolamentos em camundongos sadios (syngeneic BMT) indicam que o procedimento de isolamento não requer infiltrado inflamatório significativo para permitir a detecção de células imunes nos isolados de MNC. Na verdade, dados semelhantes foram obtidos usando ratos saudáveis não tratados (não-BMT) (dados não mostrados).
Várias etapas-chave deste protocolo diferenciam-na de outros métodos publicados e contribuem para o alto rendimento e viabilidade. Por exemplo, a otimização da atividade colagenase E derivada de Clostridium histolyticum(100 U/ml de nível de atividade final) permite cálculos consistentes para diferentes lotes de enzimas em experimentos de longo alcance26. Há 28 Membros diferentes na família do colagénio, conjuntamente constituindo quase 30% de todas as proteínas no corpo mamífero27. Além disso, diferentes tecidos têm distribuições distintas de subtipos de colágeno, cada um exigindo colagenases exclusivas para a digestão28. A colagenase de C. histolyticum inclui 6 diferentes proteínas classificadas em duas classes29,30. O tipo específico de colagenase utilizada pode alterar a viabilidade e a qualidade geral das células isoladas do cólon31. Estudos prévios demonstraram que a colagenase tipo C-2139 (colagenase E) permite um alto rendimento de linfócitos entre os MNC isolados do intestino delgado25. Entretanto, estes protocolos não endereçam a digestão dos dois pontos, um órgão muito mais muscular com composição significativamente mais complexa do colagénio do que o intestino pequeno.
A adequação e a confiabilidade da degradação tecidual enzimática é um fator estabelecido que influencia o rendimento e a viabilidade geral das células, minimizando a necessidade de rompimento mecânico recorrente (o que induz ao tecido um trauma mecânico aumentado). Devido à adequada digestão enzimática do colágeno intersticial e da mucosa usando um protocolo específico de colagenase (em comparação com os protocolos de digestão mediada pela colagenase D em uso padrão), este protocolo minimiza a quantidade de manipulação mecânica de os fragmentos de tecido necessários para interromper o interstício e liberar subconjuntos de células imunes em suspensão. Isso aumenta ainda mais a viabilidade da MNC isolada para ensaios subsequentes. Como demonstrado nos dados (Figura 1b), isso elimina a necessidade de DNase e outras manobras químicas ou mecânicas antiaglutinantes além da filtração padrão de uma única suspensão de células através de um filtro. Outros relatos que descrevem o isolamento das células linfoides intestinais utilizaram ditiothreitol (DTT) e EDTA como agentes mucolíticos para aumentar a produtividade e a viabilidade dos leucócitos mononucleares isolados24.
Outro aspecto único deste protocolo que melhora o rendimento celular é a aplicação de um gradiente de mídia de separação de densidade baseada em sílica fina. Outros métodos de digestão artigos publicados até à data não use tal gradiente de separação de densidade21,31. No entanto, na experiência dos autores e dos colaboradores que utilizam este protocolo para isolar células linfoides funcionalmente ativas, a purificação do gradiente de densidade melhora tanto a viabilidade quanto a pureza da MNC recuperada após a digestão19 , 20 anos de , 32.
Embora não seja um foco deste manuscrito, digno de menção para aqueles que trabalham com modelos de inflamação intestinal em camundongos é que os métodos Neste manuscrito podem ser modificados para permitir o isolamento de alta qualidade semelhante de MNC viável do intestino delgado. A modificação do protocolo Colônico primário necessário para conseguir isso é o uso de uma única digestão de 90 min (em vez de digestões de 2 60 min), com todas as outras etapas (incluindo o nível de atividade enzimática e as etapas de saciar) idênticas àquelas mostradas. Esta modificação produz tipicamente uma escala de 0.8-4 x 106 MNC por o intestino pequeno sem ou 1.5-2.5 x 106 MNC com a inclusão do íleo terminal que inclui o tampão cecal leucócito-rico. Conseqüentemente, uma novidade deste protocolo é que aplicando o protocolo preliminar aos dois pontos e ao protocolo modificado ao intestino pequeno, uma poderia isolar o MNC com reprodutibilidade elevada e a boa viabilidade do intestino pequeno e dos dois pontos do indivíduo animais experimentais no mesmo experimento.
Em resumo, o protocolo descrito permite o isolamento eficiente e reprodutível de células mononucleares do cólon ou, com modificações, o intestino delgado. Com os 2 operadores proficientes que trabalham junto, tantos como 10 dois pontos separados podem ser processados e analisados em um único dia, e as suspensões da único-pilha podem estar prontas para a análise fenotípica e funcional subseqüente dentro de 6-8 h da colheita do tecido. A aplicação deste protocolo pode revelar-se valiosa para outros objetivos da pesquisa que necessitam a avaliação imune da inflamação relativa ao cólon, permitindo que outros investigadores caracterizem o sistema imunitário dos dois pontos do rato em uma maneira rigorosa e reprodutível.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios #1K08HL088260 e #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) e pela Fundação Batchelor para pesquisa Pediátrica (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Os camundongos C57BL/6 e BALB/c utilizados neste estudo foram criados em nossas instalações ou fornecidos por Jackson Labs ou Taconic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15 mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18 G Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 μm pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5 M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
References
- Schneeman, B.
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J.
- Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F.
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M.
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
