Summary
בשל החפיפה הספקטרלית של עירור ואורכי גל הפליטה של NADH וfura-2 אנלוגיות, הפרעות האות משני הכימיקלים בתאים חיים הוא בלתי נמנע במהלך המדידה הכמותית של [Ca2 +]. לפיכך, שיטת התיקון המקוונת הרומן של הפרעה באות NADH למדידה [Ca2 +] פותחה.
Abstract
כדי למדוד [Ca 2 +] כמותית, fura-2 אנלוגיים, אשר משמשים לעתים קרובות משתמשיםבשתישדות פלואורומטרים. עם זאת, השימוש בצבע הוא מוגבל בתאים חיים בגלל הפרעה פלואורסצנטית אוטומטי, בעיקר מפני הפרעות מסוימות (NADH). באופן ספציפי יותר, זהו מכשול גדול כאשר מדידת מיטוכונדריאלי [Ca2 +] ככמת באמצעות fura-2 האנלוגיים כי רוב הרוב של nadh הוא המיטו,. אם הריכוז צבע פלורסנט זהה, עוצמת עירור מסוים צריך לייצר את עוצמת הפליטה זהה. לכן, יחס עוצמת הפליטה של שני אורכי גל עירור שונים צריך להיות קבוע. מבוסס על עיקרון זה, שיטת תיקון מקוון הרומן של הפרעה האות NADH הפרעות למדוד [Ca2 +] פותחה, ואת עוצמת האות האמיתית של nadh ו fura-2 ניתן להשיג. עוד, משוואה הרומן לחשב [Ca2 +] פותחה עם עירור isosbestic או עירור ב 400 nm. עם שיטה זו, שינויים מיטוכונדריאלי [Ca2 +] יכול להיות נמדד בהצלחה. בנוסף, עם קבוצה שונה של העירור ואת אורכי הגל, פרמטרים מרובים, כולל NADH, [Ca2 +], ו-pH או הממברנה מיטוכונדריאלי פוטנציאל (ענבלm), ניתן למדוד בו. מיטוכונדריאלי [Ca2 +] ו ענבלm או pH נמדדו באמצעות fura-2-FF ו טטרמתירומתיל אתיל אסתר (tmre) או קרבוקטרוקסי-סמיטואפאפופלויור-1 (קרבוXY-סנאפ -1).
Introduction
התפקיד המשמעותי של הרשות התאיים2 + מוכר באופן נרחב1. הקוונפיקציה של [Ca2 +] חיוני כדי להבין את התהליכים של פונקציות פיזיולוגיות הסלולר. האנלוגית fura-2 הם שימושיים למדי משום שהם נרגשים בטווח UV (< 400 ננומטר), ואת השיטה הטימטרית ניתן להחיל על המדידה הכמותית. לכן, פרמטרים פיזיולוגיים אחרים כגון pH, פוטנציאל הממברנה, וכו ', ניתן למדוד עם צבעי פלורסנט אחרים. Ca מיטוכונדריאלי2 + ריכוז ([Ca2 +]m) היה הדיווחים 0.08-20 μm2,3,4,5. בין fura-2 אנלוגיות, fura-2-FF מתאים למדידת טווח זה של [Ca2 +]. עם זאת, התאים החיים למרבה הצער מכילים NADH/NADH עבור תהליכי חילוף החומרים שלהם, ו-NADH יוצר הפרעות האות בגלל העירור החופף וספקטרום הפליטה עם האנלוגי fura-2. הפרעה זו מגבילה מאוד את השימוש באנלוגיות של fura-2. במיוחד, אם האנלוגי מוחל על מדידת מיטוכונדריאלי [Ca2 +], הפרעה זו היא המכשול הגדול ביותר, כי הסכום הגבוה ביותר של nadh הוא במיטו,. זה מסובך עוד יותר על ידי שינויים nadh להיות קשור הפוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ענבלm) ושינוי של ענבלm משפיע [Ca2 +]m6,7,8 , 9. יתר על כן, עבור לימוד [Ca2 +]m דינמיקה, חיוני לדעת את מעמדם של פרמטרים מיטוכונדריאלי אחרים, כגון nadh, ענבלm, ו-pH.
פליטות ב 450 ננומטר ו 500 nm עם ההתרגשות ב 353 nm, 361 nm, ו-400 nm מכילים את האותות מ-NADH ו-fura-2-FF, והמשוואות הן כדלקמן. בזאת, 353 nm ו 361 nm הם נקודות isosbestic של fura-2-FF עבור פליטות ב 450 nm ו ב 500 nm, בהתאמה.
F361,450 = f361450, nadh + F361450, משוואת פרא 1
F353,500 = f353500, nadh + F353500, משוואת פרא 2
F400,500 = f400500, nadh + F400500, משוואת פרא 3
כאשר Fx, y היא עוצמת הפליטה הנמדדת ב-y-nm על-ידי עירור ה-x-Nm, fx, y, nadh מייצגת את עוצמת הפליטה הטהורה התלוית התלות, ו-fx, y, fura מייצגת את עוצמת הפליטה הטהורה של fura-2-FF. תחת הריכוז זהה של צבע פלורסנט, אינטנסיביות עירור מסוים צריך לייצר את עוצמת פליטה זהה. לכן, יחס עוצמת הפליטה של שני אורכי גל עירור שונים צריך להיות קבוע. Ca2 + ו fura-2 לא השפיעו על מאפייני הזריחה של nadh; לכן, את היחס של הפליטה ב 450 ננומטר ו ב 500 ננומטר של NADH היה קבוע באורך גל כל עירור. אותו כלל ניתן להשתמש עבור fura-2-FF מבוסס על ההנחה כי NADH או [Ca2 +] אינו משפיע על הפליטה ואת מהווה ספקטרום של fura-2-ff. עם זאת, Ca2 + גרם שינוי ספקטרלי של הפליטה fura-2-FF. לכן, כדי להסיר את ההשפעה של Ca2 +, הריגוש isosbestic אשר אינו תלוי ca2 +, צריך להיות בשימוש. כל אורך הגל (כלומר, 450 nm ו 500 ננומטר) יש נקודה isosbestic ומתוך ההתקנה הניסיונית שלנו, 353 nm ב 500 nm ו-361 nm ב 450 nm נבחרו. מאלה, המשוואות הבאות תקפים10.
Rf = f361450, fura/F353500, משוואת fura 4
RN1 = F400500, nadh/F361450, משוואת נדיה 5
RN2 = F353500, nadh/F361450, משוואת נדיה 6
עם קבועים אלה, המשוואות הבאות מ (משוואה 1) (משוואה 2) ו (משוואה 3) הן חוקיות.
F361,450 = f361450, nadh + RF × f353500, משוואת fura 7
F353,450 = RN2 × f361450, nadh + f353500, משוואת fura 8
F400,500 = RN1 × f361450, nadh + f400500, משוואת fura 9
ממשוואות אלה, אם Rf, rN1ו-rN2 ידועים, אותות טהורים של nadh ו fura-2 ניתן להשיג כדלקמן.
F361450, NADH = (F361,450 -Rf × f353,500)/(1-rf × rN2) משוואה 10
F353500, Fura = (rN2 × f361,450 -f353,500)/(rF × rN2 -1) משוואה 11
F400500, Fura = F400,500 -RN1 × f361450, משוואת נדיה 12
Rfura = F353500, fura/F400500, משוואת fura 13
Ca2 +הטופס מאוגד של fura-2-FF היה כמעט לא פלורסנט ב 400 הריגוש ננומטר גל. בהתבסס על מאפיין זה, ניתן לגזור את משוואת הכיול החדשה הבאה.
[Ca2 +] = Kd ∙ (F400500, max/f353500, מקסימום) × (Rfura -rדקות) משוואה 14
כאשר Kd הוא קבוע הדיסוציאציה,f 400500, Max ו-f 353500, max הם הערכים המרביים של האותות הנפלטים ב 500 ננומטר עם ההתרגשות ב 400 nm ו 353 Nm, בהתאמה, ו rדקות הוא מינימום rfura ב Ca2 +-תנאי פנוי. מאחר שנעשה שימוש בהתרגשות, המשוואה יכולה להיות פשוטה יותר כדלקמן.
[Ca2 +] = Kd ∙ (1/Rדקות) ∙ (Rfura -rדקות) משוואה 15
לכן, רק ערכי K ו- Rמינימום נדרשים לחישוב [Ca2 +].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי שימוש בבעלי חיים מוסדיים מקומיים וועדת השימוש.
1. הכנת התמיסה
- הכינו מיציטים חד-לבבית.
הערה: כל מעבדה עשויה להיות בעלת פתרון אחסון תאים שונה. כאן, המיציטים מאוחסנים במדיום התרבותי (DMEM). - הכן 100 mL של Ca2 +-פתרון חינם (שולחן 1).
- הכן 50 mL של מדיום התרבות בגביע 50 mL. . ושים אותו באמבט מים ב-37 ° c שמור את הפתרון הנותר בטמפרטורת החדר.
- להכין 50 mL של הפתרון סאפונין על ידי הוספת 5 מ ג סאפונין כדי 50 mL של Ca2 +-פתרון חינם.
הערה: Saponin משמש לחלחל מיאלוציטים לב, כדי להסיר תאי ציטוסולג, ולדמיין את הזריחה המידריתית בלבד. - הכן 16 μL של 1 מ"מ fura-2-FF-AM מומס diמתיל סולפוקסיד (DMSO).
הערה: הפוך פתרון מניות 1 מ"מ של fura-2-FF-AM מומס dmso ו סדרת מחלקים 16 μl בשפופרת 2 מ ל. אחסן אותם ב-20 ° צ' עד השימוש. - הכינו 50 mL של NADH-free Ca2 +פתרון חינם (שולחן 1) ו 50 מ ל של Nadh-חינם ca2 +פתרון רווי (שולחן 1) כאשר נקודות isosbestic יש למדוד. להתאים את ה-pH ל 7.0 עם KOH.
הערה: NADH-free Ca2 +-פתרון חינם (שולחן 1) מכיל 10 μm fccp ו-100 μm ADP ללא כל מצעים מיטוכונדריאלי כדי למזער את nadh ב המיטואום. - הכינו 50 ml של Ca2 +פתרון חינם, 50 ml של פתרון ארמיטה, 50 ml של פתרון פירובט, 50 ml של פתרון ארמיטה-פירובט, ו 50 ml של הפתרון rotenone לשמש מדידות גורם תיקון nadh (שולחן 1).
2. fluoroprobe העמסה ההליך לתוך המיטו,
- הכינו את פתרון טעינת הצבע על ידי הוספת 2 מ ל של מדיום התרבות עד 16 μL של 1 מ"מ fura-2-FF-אם.
הערה: צבע פלורסנט הוא שברירי מתחת לאור. הכן את הפתרון בדיוק לפני השימוש. שמור את הפתרון המכיל את צבע הפלורסנט במקום חשוך. הריכוז הסופי של fura-2-FF-AM הוא 8 μM. אם נעשה שימוש בקרבוקסיב-1, הכן את פתרון טעינת הצבע עם 2 מטרים בקרבוקסירוקסי-סנאפ -1. - קח 2 מ ל של תאים מבודדים ומקום במבחנה 5 מ ל במצב זקוף.
- חכו 15 דקות כדי שהציטים שלי. ישקע לתחתית ותסיר את הסופרנטאנט
הערה: הסופרנטאנט עשוי להכיל פסולת תא. אל צנטריפוגה את הצינור כדי למנוע נזק לתאים. - הוסף 2 מ ל של פתרון טעינת הצבע.
- מודיית את פתרון טעינת הצבע עם תאים עבור 60 דקות ב-4 ° c.
- ואז, לשים את המבחנה באמבטיה מים 37 ° c עבור 30 דקות במצב זקוף.
- הסר את הסופרנטאנט, והוסף 4 מ ל של מדיום התרבות הקדם-שחומם של 37 ° c. מודיית את התאים עבור 60 דקות באמבטיה 37 ° c המים.
- לבסוף, להסיר את הסופרנטאנט, להוסיף 4 מ ל של מדיום התרבות בטמפרטורת החדר ולשמור את הצינור בטמפרטורת החדר.
3. מבוא למערכת המדידה הרב-פרמטרית
הערה: איור 1 מציג דיאגרמה של המערכת כולה.
- עבור מקור האור עירור, השתמש monochromator מהיר (polychrome II) שיכול לשנות את האור בתוך 3 ms.
- השתמש בעדשה טבילה שמן (40x, NA 1.3) עם מיקרוסקופ הפוך כדי להגדיל את עוצמת האות.
- השתמש במסנן כמעט אינפרא-אדום ובמצלמת התקן מצמידים (CCD) כדי לפקח על שדה האובייקט ללא הפרעה של אותות פלורסנט.
- לכוד את תמונת שדה האובייקט כדי לקבל את האזור.
- כוונן את שדה האובייקט במסך הצג עם דיאפרגמה של שדה רק כדי להציג את התא להפחתת הרקע.
- השתמש בארבעה צינורות פוטופוטיפלייר עם כל מסנן פס-לעבור (450, 500, 590, ו 640 nm) כדי לזהות אורכי גל פליטה עם שיטת ספירת פוטון. השתמש במראות הדיקרואיק המתאימות לפיצול ולניתוב מחדש של אור הפליטה.
הערה: האור עירור חזק מאוד בהשוואה לאור הפליטה. לפיכך, בחר במסנן הרצועות עם המאפיינים החוסמים הגבוהים ביותר כדי להקטין את הרקע. מערכת ספירת פוטון כוללת שילוב של PMTs, יחידות מונה פוטון, ומונה במהירות גבוהה. כדי לשלוט במערכת ולדגום את הנתונים, נעשה שימוש בתוכנת הנהיגה שנעשתה בהתאמה אישית. יש צורך למצוא דרך להחיל שיטה זו עם מערכות אחרות.
4. שיטות תיקון של NADH עם מערכת מדידה רב-פרמטרית
- זיהוי של נקודות isosbestic של Fura-2-FF באתרו.
הערה: דיווחים רבים הצהירו כי מאפייני פלורסנט משתנים בתאים. לכן, בצע את כל ההליכים כדי לקבל את הפרמטרים כדי לתקן את ההפרעה באתרו.- הר את התא טעון על המיקרוסקופ ולחכות 3 דקות להטביע את התאים לתחתית.
הערה: התאם מספרי תאים כדי לראות סביב תא אחד לכל שדה יעד אחד עם עדשת היעד 40x. - מבשם NADH-free Ca2 +-פתרון חינם ב 37 ° c.
- לאחר תא מיקוד, למדוד את הרקע ללא תא ואת שטח התא כפי שמוצג בסעיף 4.1. חשב את רקע התא מאזור התא.
הערה: יש לתקן את שני אותות הרקע בכל ניסוי. - מבשם את הפתרון סאפונין עבור 60 s ולחזור ל-nadh חינם Ca2 +-חינם הפתרון.
- למדוד Fura-2-FF-פולט אותות ב 450 ננומטר ו 500 ננומטר בו זמנית על ידי סריקת עירור מ 350 nm כדי 365 nm עם 0.1 הצעד nm בשנת.
- מבשם NADH-free Ca2 +פתרון רווי וחזור על 4.2.5 שלב.
- הפחת את האותות בתמיסה של Ca2 +רוויה מתוך האותות בתנאים של ca2 +-free.
- חזרו על ההליכים מ4.2.2. ל4.2.7 עם תאי-לב בודדים אחרים
הערה: אם עוצמת האות נחלשת, חזור מ4.2.1. חזור על ההליך עבור, לפחות, 5 תאים שונים. - מכל האותות שהושגו, לחשב את הסטיות הסטנדרטיות של הפליטה בכל עירור ולבחור את אורך הגל מראה את סטיית התקן המינימלית (SD) ערך כנקודת isosbestic.
הערה: נתוני הנציג מוצגים באיור 2.
- הר את התא טעון על המיקרוסקופ ולחכות 3 דקות להטביע את התאים לתחתית.
- זיהוי אותות הרקע ושיטות התיקון באזור התאים
הערה: קיימים שני סוגים של הרקעים. אחד בא מן התאים והשני מגיע השתקפות על מכסה המכסה (הרקע ללא תא). יש לתקן את שני הרקעים בכל ניסוי.- הר את התאים ללא צבע באמבט על המיקרוסקופ ולחכות 3 דקות להטביע את התאים לתחתית. מבשם NADH-free Ca2 +-פתרון חינם עבור כ 5 דקות.
הערה: שיעור הפרזיה של הפתרון הוא 2-3 mL/min ב-37 ° c.
הערה: התאם מספרי תאים כדי לראות סביב תא אחד לכל שדה יעד אחד עם עדשת היעד 40x. - הגדר את שדה האובייקט כך שיכסה את התא המיועד.
- לאחר הזזת התא אל מחוץ לשדה, למדוד את אותות הרקע של החלון ללא תא ולהגדיר אותם כהיסטים.
הערה: האות משמעו שהאות האור יתגלה במערכת ספירת הפוטון. - החזר את התא למיקום ההתחלתי וממד את אותות הרקע של התא ואת אזור התא.
הערה: למרות שאור העירור מסונן עם המסנן ' מעבר בנדנה ', הוא עדיין מכיל כמות גדולה מאוד של האור המסונן. אור זה מפוזר כאשר להכות את התאים וגורם לאות רקע ניכר כי מערכת ספירת הפוטון הוא רגיש מאוד. . צריך לתקן את זה
הערה: ניתן לחשב את אזור התא עם תמונת תא שנלכדה ותוכנת דימות זמינה. יחידת התאים יכולה להיות כל יחידה כולל ספירת פיקסלים. . רק סטנדרטיזציה זה הכרחי - חזור על ה4.1.1 ל4.1.4 במשך 10 פעמים כדי לקבל את הקשר בין אזור התא לבין אותות הרקע של התא.
הערה: מאוחר יותר, ניתן לחשב את אותות הרקע של התא מאזור התא מקשר הגומלין. מכיוון שנורת האור עירור הופכת להזדקנות, הליך זה צריך לחזור על עצמו, לפחות בכל חודש.
- הר את התאים ללא צבע באמבט על המיקרוסקופ ולחכות 3 דקות להטביע את התאים לתחתית. מבשם NADH-free Ca2 +-פתרון חינם עבור כ 5 דקות.
- מדידה של מקדמי R
- לחשב Rf עם המשוואה 4 מן האותות המתקבלים בסעיף 4.2.
- הר את התאים ללא צבע על המיקרוסקופ ומבשם Ca2 +-חינם הפתרון.
- למדוד את האותות כגון F361, 450, nadh, F400, 500, nadh, f361, 450, nadh, ו-f353, 500, Nאד.
- מבצע את הפתרון המלף וחזור על 4.3.3. ולמדוד את האותות.
- מבשם הפתרון הפירובט ולחזור על ה4.3.3. ולמדוד את האותות.
- מבצע את התמיסה המל4.3.3 וחוזר על עצמו. ולמדוד את האותות.
- באמצעות הפתרון rotenone ולחזור על 4.3.3. ולמדוד את האותות.
הערה: הדוגמה של האות nadh הוקלט על פירובט 5 מ"מ, 5 מ"מ ארמיטה פלוס 5 מ"מ פירובט, ו 10 μm rotenone תוספת מוצג באיור 3. - לחשב כל שיפוע של F361, 450, nadh vs. F400, 500, nadh ו-f361, 450, nadh vs. f353, 500, nadh. בדומה למוצג באיור 3. כל מדרון מציין RN1 ו-rN2.
5. מבחר עירור ואור הפליטה עבור TMRE או קרבוקסיב-1
- אם TMRE עבור מדידת פוטנציאל מיטוכונדריאלי נעשה שימוש בנוסף, השתמש 530 הריגוש ננומטר גל ו 590 הפליטה ננומטר גל.
- אם השימוש בקרבוקסיב-1 למדידת הפוטנציאל המיטוכונדריאלי נעשה בשימוש בנוסף, השתמש באורך הגל של 540 ננומטר ואורכי גל פליטה של 590 ננומטר ו640 ננומטר12.
6. בחירת ערך K-d של fura-2-FF
- השינוי של ה-pH יכול להשפיע על ערכי Kd עבור Ca2 + קשירה על fura-2-FF10. השתמש בערך Kd של 5.28 ב-pH 7.5 עבור המיטו,.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ca מיטוכונדריאלי2 + שינויים עקב תיקון10
איור 4 מציג את השינויים ב [Ca2 +]m לפני ואחרי התיקון. התוצאות הראו בבירור את השינויים הניכרים ב [Ca2 +]m. מיטוכונדריאלי מונח ריכוז סידן ללא cytosolic Ca2 + ([Ca2 +]c) היה 1.03 ± 0.13 μm (ממוצע ± S.E., n = 32), ואת המקסימום [ca2 +]m ב 1-μm [ca2 +]c היה 29.6 ± 1.61 μm ( אומר ± S.E., n = 33) (איור 5).
מדידה בו של NADH,2 +Ca] ו-ענבלm10
TMRE טעונה באופן חיובי ניתן להפיץ בצורה ממברנה התלוי בפוטנציאל. ניתן לחשב פוטנציאל ממברנה באמצעות משוואת נרנסט עם הריכוז בכל תא. TMRA מיטוכונדריאלי היה מפוקח עם הפרזיה של 2 ננומטר TMRA. ההנחה הראשונית ענבלm הייתה להיות על-ידי 150 mV, והשינוי של ענבלm חושבה בהתבסס על זה. היישום של Ca2 + מופחת nadh אבל מושפע ענבלm רק negligibly (איור 6).
PH שינויים מיטוכונדריאלי על ידי שינוי [Ca2 +] m10
PH מיטוכונדריאלי עם הטעינה הנוספת של קרבוxy-סנאפ -1 הייתה תחת פיקוח בעקבות Ca2 + שינויים (איור 7). PH מיטוכונדריאלי לא הושפע על ידי העלייה ב [Ca2 +]m. הנחה מיטוכונדריאלי היה 7.504 ± 0.047 (ממוצע ± S.E., n = 13). מתוצאות אלה, 5.28 μM היה ערך Kd שנבחר של fura-2-FF ב-pH 7.5.
איור 1: מערכת מיקרופלואורומטריה למדידה רב-פרמטרית
התרשים הסכמטי של. מערכת המיקרופלואורומטריה הוצג התאים רכוב היו דמיינו באמצעות מצלמת CCD. ארבע נורות פליטה שונות זוהו עם ארבעה PMTs באמצעות מערכת ספירת פוטון. דמות זו שוחזר באישור כתב העת הקוריאני לפיזיולוגיה & פרמקולוגיה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זיהוי הנקודות האיזואוסטיסטית
(א) החץ האדום מצביע על הנקודה האיזוביסטית ב-450-גל של פליטת ננומטר. Fura-2 FF במצב לא מאוגד מוצג עם קו מנוקד ובמצב Ca2 + מאוגד עם קו אחיד. (ב) החץ האדום מצביע על הנקודה האיזוביסטית ב-500-גל של פליטת ננומטר. (ג) הנתונים המופטרים של האות ב 450 ננומטר ב-ca2 +-ללא תנאים בתנאי רוויה של ca2 +-חינם מוצגים. (ד) הנתונים המופטרים של האות ב 500 ננומטר ב-ca2 +-ללא תנאים בתנאי רוויה של ca2 +-חינם מוצגים. (ה) נתוני סטייה סטנדרטית מהגרף C מוצגים. (F) נתוני סטיית תקן מהגרף D מוצגים. דמות זו שוחזר באישור כתב העת הקוריאני לפיזיולוגיה & פרמקולוגיה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מדידת הגורמים RN .
(א) שינויים באות nadh ללא צבע פלורסנט על ידי החלת מצעים מיטוכונדריאלי שונים נמדדו ב 361 העירור nm ו 450 גל פליטת ננומטר. (ב) הפרעה nadh ב-fura-2-FF אותות, F400,500 (∙ ∙ ∙) ו-F353,500 (—), היו בו מנוטרים. (ג) היחסים בין f361450, Nadh ו-f400500, nadh (○) וביןה361450 f, ה353500, nadh ו-f, נדיה (●) מוצגים. המדרונות המתקבלים מיוצגים כ-RN1 ו-rN2, בהתאמה. דמות זו שוחזר באישור כתב העת הקוריאני לפיזיולוגיה & פרמקולוגיה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות תיקון ההפרעות של NADH ו-fura-2-FF
שינוי האותות מלפני התיקון (המוצג בחלוניות השמאלית) לאחר התיקון (המוצג בחלוניות הנכונות). (א) nadh אותות על הגל 450 ננומטר גל. (ב) fura-2-FF אותות בשנת 500 ננומטר גל פליטה. האיור מראה F400, 500 (למעלה), F353,500 (----), ואת היחס של fura-2-FF (—). (ג) ריכוז הסידן היטוכונדריאלי. הקו האדום המנוקד מציין את האפס. דמות זו שוחזר באישור כתב העת הקוריאני לפיזיולוגיה & פרמקולוגיה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: נח [Ca2 +]m ללא ציטוסולג Ca2 + ומצב יציב מקסימאלי [ca2 +]m ב 1 μm cytosolic ca2 +
מיטוכונמיטוט היו במרץ עם המיזוג של הפתרון מלאכל-פירובט. המצב היציב [Ca2 +]m בתנאי ca2 +-Free ו-1 μm Ca2 + תנאים הוצגו. התוספת של 5 mM Na+ nadh התאושש והופחת [Ca2 +]m לתוכנית הבסיסית. דמות זו שוחזר באישור כתב העת הקוריאני לפיזיולוגיה & פרמקולוגיה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מדידה בו של NADH, [Ca2 +]m, ו ענבלm
מיטוכונמיטוט היו במרץ עם המיזוג של הפתרון מלאכל-פירובט. השינויים של NAHD, [Ca2 +]m ו ענבלm הוצגו. תוספת של 1 μM Ca2 + ירד nahd וגדל [Ca2 +]m אבל ענבלm לא השתנה באופן משמעותי. דמות זו שוחזר באישור כתב העת הקוריאני לפיזיולוגיה & פרמקולוגיה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: מדידה בו של NADH, [Ca2 +]m, ו-pH
היישום החוזר של Ca2 + יכול לזרז את הירידה של nadh ואת הגידול של [Ca2 +]m אבל ה-pH מיטוכונדריאלי לא הושפע על ידי היישום של Ca2 +. התוספת של Na + יכולה להחזיר את ה-NADH ו [Ca2 +]מ' לקו הבסיס. דמות זו שוחזר באישור כתב העת הקוריאני לפיזיולוגיה & פרמקולוגיה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שם הפתרונות | ריכוז (ממ) | |||||||||
| אשלגן כלורי | מיכל ביטון | מיכל בגין | מיכל2 | M | P | R | FCCP | ADP | סאפונין | |
| Ca2 +-חינם | 150 | 10 | 1 | |||||||
| נדיה בחינם | 150 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2 +-חינם | ||||||||||
| נדיה בחינם | 135 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2 +-רווי | ||||||||||
| סאפונין | 150 | 10 | 1 | 0.1 מ"ג/ml | ||||||
| ארמיטה | 145 | 10 | 1 | מיכל 5 | ||||||
| פירובט | 145 | 10 | 1 | מיכל 5 | ||||||
| מלטה-פיבט | 140 | 10 | 1 | מיכל 5 | מיכל 5 | |||||
| Rotenone | 140 | 10 | 1 | מיכל 5 | מיכל 5 | 0.01 | ||||
| מדיום לתרבות | בינונית של הנשר השונה של dulbecco (DMEM) | |||||||||
| טעינת צבע | הוסף מלאי של 1mM-2-FF-אם (16 מ"ל) באמצעי התרבות (2 מ"ל) | |||||||||
טבלה 1: פתרונות
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת תיקון ההפרעות פותחה בהצלחה עבור מדידת האותות של NADH ו fura-2 אנלוגיות. מדידה מדויקת של האותות חיונית לתיקון מדויק. עם זאת, האופי הטבוע של מכשיר הפלורסנט מייצר אות רקע שאינו קשור לזה של NADH של fura-2. הפילטר האיכותי ביותר יכול להעביר עד 10 עד8 מאורכי הגל הלא רצויים של האור. עם זאת, אות הפלורסנט מתא בודד הוא קטן מאוד, ואת ההשתקפות של אור עירור לאחר מסנן הלהקה-pass עדיין חזק מספיק כדי לזהם את אותות פלורסנט בפועל. לכן יש צורך בתיקון מזהיר של אות הרקע.
Fura -2 יש בעיה העמסה למדוד מיטוכונדריאלי2 +. ראשית, זה לא קל לטעון את הצבע במיוחד לתוך המיטו, וטעינה לא ספציפית לתוך ארגונית אחרת יכול להיות מוטעה. Ca מיטוכונדריאלי2 + ריכוז הוא בדרך כלל גבוה יותר מזו של ציטוסול, והשימוש fura-2-FF עם ערך Kd גבוה יכול למנוע זיהום של ציטוסולג Ca2 + שינויים. מארגני הבעייתיות האחרים היא הsarcoplasmic רשת (SR). עם זאת, הבדלי אמצעי האחסון להפצה (SR 3.5% vs. מיטוa 34%-36% לפני החולדה החדרית)13,14 והסרת ATP בניסויים יכולים לפצות על הזיהום מ-SR.
משוואת הכיול שלנו (משוואה 14 ו-15) כוללת מאפיינים רבים ומועילים למשוואה הבאה של Grynkiewicz '15 כדלקמן:
1) הדבר דורש רק שלושה פרמטרים: Kd, F400500, max/f353500, מקסימוםו-Rדקות.
2) מיניאריות את ערך היחס לריכוז Ca2 + ברמת pH קבועה.
3) קיים פרמטר יחסי ללא שגיאה ב-F400500, max/f353500, max בהשוואה ל-Sf2/sb215.
4) במשוואה 15, רק Kd ו- Rדקות נדרשים אם הריגוש isosbestic משמש.
5) תהליך הכיול להשגת הפרמטר הוא הרבה יותר פשוט עם המשוואה 15.
עם זאת, יש הגבלה מכיוון Ca2 +רווי fura-2-FF יוצר פליטה קטנה מאוד. . זה גורם לשגיאה המשוואה החדשה ניתן להחיל על [Ca2 +] ריכוזי עד 50x של Kd.
לסיכום, פרוטוקול פותחה כדי לפתור בהצלחה את הבעיה הקיימת של NADH ו fura-2-FF הפרעה. שיטה זו יכולה למדוד את Ca2 + dynamics באופן מדויק יותר. מערכת מדידה רב פרמטרית, במיוחד במיטו, תסייע להבין את הפיזיולוגיה הדריבית באופן כמותי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי תוכנית בסיסית מחקר המדע באמצעות קרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2018R1A6A3A01011832), על ידי משרד המדע, מ& תכנון עתידי (NRF-2016M3C1A6936606) ועל ידי משרד המסחר, התעשייה & אנרגיה (10068076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
- Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
- Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
- Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
- Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
- Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
- Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
- Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
- Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
- Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
- Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
- Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
- Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
