Summary
アラビドプシス二重受精における精子核形態に基づいて成功または失敗した受精を決定する方法をエピ蛍光顕微鏡で示す。
Abstract
開花植物は、「二重受精」と呼ばれるユニークな性的再生システムを持っており、それぞれの精子細胞が卵細胞または中央細胞と正確に融合します。したがって、2つの独立した受精イベントがほぼ同時に起こる。受精卵細胞と中枢細胞はそれぞれザイゴットとエンドスパームに発達する。したがって、二重受精の正確な制御は、その後の種子開発のために不可欠です。二重受精は、深く隠され、厚い卵巣および卵巣組織で覆われている女性のゲームトフィート(胚嚢)で起こる。この雌しべ組織構造は、二重受精の観察と分析を非常に困難にし、二重受精のメカニズムに関する多くの疑問が未解決のままである現状を作成しました。受精レギュレータ候補の機能評価には、受精の見型分析が重要である。アラビドプシス・タリアナにおける受精の完了を判断するために、精子核を標識する蛍光シグナルの形状が指標として用いられる。受精に失敗した精子細胞は、メスのゲーテの外側に凝縮された蛍光信号によって示されるのに対し、正常に受精する精子細胞は、女性のゲーテの核を持つカルヨガミーによる凝縮信号によって示される。ここで説明する方法は、生体内条件下での受精の成功または失敗を決定するツールを提供する。
Introduction
開花植物は、二重受精を介して種子を生成し、ゲーム血漿膜1、2に局在するタンパク質間の相互作用によって直接制御されるプロセスである。開花植物オスのガメ、精子細胞のペアは、花粉で発症します。受粉後に成長する花粉管は、雌のゲーム、卵細胞、胚嚢で発達する中央細胞に精子細胞のペアを提供します。オスとメスのゲームが出会った後、ゲームの表面のタンパク質は、認識、付着、融合を促進し、二重受精を完了します。これまでの研究では、オスのガメテ膜タンパク質生成細胞特異的1(GCS1)/HAPLESS2(HAP2)3、4、およびGAMETE発現2(GEX2)5は、ガメ融合に関与する受精調節剤として同定され、 添付ファイルは、それぞれ。我々は最近、男性のガメテ特異的膜タンパク質、DUF679ドメイン膜タンパク質9(DMP9)を、ゲームと相互作用に関与する受精調節器として同定した。我々は、DMP9発現の減少は、A.タリアナ6における二重受精中の卵細胞受精の有意な阻害をもたらすことを見出した。
卵巣組織でさらに包まれた卵巣に埋め込まれた胚嚢に二重受精が起こるので、二重受精プロセスの状態を観察し、分析することは困難である。このため、二重受精制御のメカニズム全体を完全に理解するのを妨げる多くの不明確な点が依然として存在する。生体内条件下での二重受精中のガメテの挙動を追跡する観察技術の確立は、受精レギュレータの候補候補の機能解析に不可欠である。最近の研究では、ガメの細胞内構造が蛍光タンパク質で標識されるマーカーラインが得られた。この記事では、人工的に受粉した雌しべに由来する胚嚢で発生した二重受精を観察するための簡単で迅速なプロトコルを示す。精子細胞核マーカーラインHTR10-mRFP7を用いて、各メスの受精状態は精子核信号形態に基づいて判別することができる。受精時の精子核の形態的変化に焦点を当てた我々のプロトコルは、統計的証拠のために十分な量のデータを効率的に得ることができる。HTR10-mRFPの背景(DMP9 KD/HTR10-mRFP)を持つDMP9-ノックダウンラインを男性植物として使用し、単一の受精パターンを示した。このプロトコルは、他の受精レギュレータの機能解析にも適しています。
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Protocol
1. 人工受粉
注:プロセスを開始する前に、5番鉗子のペアが必要です。
- 成長室で16時間/8-hの暗いサイクルの下で22 °CでA.タリアナ(Col-0)を成長させる。
注:軸芽の開発を促進するために、ハサミで最初に開発された花の茎をカットし、削除します。活発に成長する植物(最初の茎の切断後2〜3週間、植物の高さ約25センチメートル)は、分析に適しています。 - エミュレートするには、第5鉗子を使用して、ステージ11 8(図1A)で花芽のセパル(図1B)、花びら(図1C)、およびスタメン(図1D)を取り除きます。上部に見られる花びらのビットを持つ芽が最適です。
注:適切な女性のゲームマーカーラインを使用してください。このプロトコルでは、野生型植物を女性の親として使用しました。 - 15~18時間後に、鉗子でフィラメントをつまんでステージ138でDMP9KD/HTR10-mRFPの花のスタメンを取る。
- 受粉するには、消化された雌しべの汚名を、脱気剤で数回軽くたたきます。
2. 観察のための排卵の準備
注:両面テープが付いているスライドガラス、第5の鉗子、27 Gの注入針および解剖顕微鏡は必要である。
- 受粉(HAP)の後7〜8時間、雌しべを収集し、両面テープ上に置き、その後、テープ上の雌しべを固定するために鉗子で穏やかに押します(図2A、A')。
注:雌しわのほとんどの卵管は、少なくとも1つの花粉管10 HAP9を受け取る。第1の花粉管からの精子細胞の両方またはいずれかの1つが受精に失敗した場合、第2の花粉管は受精回復システム10に起因する排卵によって引き付けられるであろう。最初の花粉管から精子核形態を分析するには、遅く10HAPまでに卵管調製を完了することをお勧めします。 - 解剖顕微鏡下で注射針を用いて卵巣の上端と下端を切り取る(図2B,B')。
- 注射針の先端を動かして、リプラムの両側に沿って卵巣壁をスリットする(図2C、C')。
注:中隔からの卵の分離を防ぐために注射針を浅く挿入します。 - 注射針を使用して卵巣壁をエバート(図2D,D')。
- 排卵が接続されている中隔の基部をつまみ、鉗子で慎重に持ち上げます(図2E)。
- 卵管をスライドガラス上の水滴に移し、蛍光顕微鏡下で観察するためのカバーガラスで優しく覆う(図2E,E')。
3. 顕微鏡検査
注:このプロトコルでは、蛍光フィルターキューブ(材料の表を参照)、デジタルカメラ、および付属のソフトウェアを備えたエピ蛍光顕微鏡を使用しました。
- 20倍または40倍の対物レンズと装備されたデジタルカメラを使用して、mRFPで標識された精子核を含む卵丘の画像を取得します。
- 胚嚢におけるmRFP標識精子核の数を確認する。
注:2つのmRFP標識精子核を含む卵子は、統計分析のために母集団サイズに含めることができる。 - 胚嚢内の各mRFP標識精子核の形状と位置を確認する。
注:花粉管から放出された直後に、凝縮されたmRFP標識精子核のペアが卵と中央細胞の間に局在する。例えば、カラザル側で検出された非凝縮されたmRFP標識精子核は、中央細胞受精を示す。適切な女性のガメテ膜マーカーラインを用いることによって、補足図1に示すように、精子細胞がプラスモグミー(膜融合後であるが、カルヨガミーの前)を受けているかどうかが明確に監視することができる。
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Representative Results
DMP9KD/HTR10-mRFPで受粉した雌ししから卵黄を7-8 HAPで採取し、観察した。
ほとんどの卵子は、卵子細胞(マイクロパイラー側)と中心細胞(カラザル側)核位置に2つの凝縮されたmRFP標識精子核を含み、それぞれ(図3A)、二重受精に成功したことを示す。さらに、中央細胞核に非凝縮されたmRFP標識精子核を含む卵子と卵子細胞外の凝縮されたmRFP標識精子核(図3B)が観察され、単一受精を示した。二重受精に失敗した場合、gcs1変異精子細胞(図3D)3、4のように、卵細胞と中心細胞の境界で2つの凝縮されたmRFP標識精子核が観察された(図3C)。.
DMP9KD/HTR10-mRFP花粉を用いた分析では、単一の凝縮されたmRFP標識精子核(図4A)または3つ以上のmRFP標識精子核(図4B)を含む卵子はめったに観察されなかった。
図1:あわて物に適した花芽。(A) ステージ11の花芽で、上部に花びらの一部を示す。(B-D)セパル(B)と花びら(C)を取り除き、その後完全に凝らされた花芽(D)。アンサーの脱姿はまだ起こっていない。スケールバー = 1 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:卵硫サンプル調製の流れ。手順は、イラスト(A-E)と写真(A' -E') で示されています。(A, A')雌しべはスライドガラスに取り付けられた両面テープに置かれ、その上端および下端は注射針によって切り取けられる。(B, B ')卵巣壁は、リプラムの両側に沿って切開されます。(C, C')卵巣壁の両側が開かれ、絶え間ない、そして固定するためにテープに押される。(D, D')排卵が配列で接続されている中隔が露出する。(E, E')中隔の一方の端はつままれ、鉗子で持ち上げられる。卵管を接続する中隔は、スライドガラス上の水滴に転送されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:精子核信号形態によって判断される受精型卵で。(A) 2つの凝縮されたmRFP標識精子核(矢頭)によって示される二重受精に成功した。(B) DMP9 KD/HTR10-mRFP精子細胞による単一受精は、1つの凝縮されたmRFP標識精子核(矢印)と1つの凝縮されたmRFP標識精子核(矢印)によって示される。 (C) DMP9KD/HTR10-mRFP精子細胞による二重受精に失敗し、2つの凝縮されたmRFP標識精子核(矢印)によって示された。(D) gcs1HTR10-mRFP精子細胞による二重受精失敗の一例。卵細胞核(EN)をRFPで標識したマーカーラインを用いた。2つの凝縮されたmRFP標識精子核(矢印)は18 HAPで受精なしで逮捕される。(E) 卵子の模式図。EC=卵細胞、CC=中心細胞、SC=相乗細胞、ES=胚嚢、MP=マイクロパイル、CHZ=カラザル末端。スケールバー = 20 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: その他の可能性受精のフェノタイプ。 DMP9 KD/HTR10-mRFPで受粉した雌しし細かからの卵子は、単一の凝縮されたmRFP標識精子核(A)、または3つ以上の凝縮されたmRFP標識精子核(B)(矢印)を含むことはほとんどない。 スケールバー = 20 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:受精中のプラスモガミーにおける凝縮精子核を、女性の血漿膜マーカーラインとの組み合わせにより判定する。pFWA::中央細胞血漿膜が可視化されたGFP-PIPを女性親(GFP)として用いた。GFP-PIPはまた、エンド膜12を標識する。卵子には、2つの凝縮されたmRFP標識精子核(矢印;RFP)。カラザル側(矢印)のRFP信号は、中央細胞(Merge)に示され、精子核がプラスモガミー(ゲーム膜融合後、しかしカルヨガミーの前)であることを示す。右側のパネルは、マージされたイメージ内の破線で囲まれた領域の拡大です。アスタリスクでマークされた空白領域は、中央細胞核の位置に対応します。破線は、卵細胞に面した中心細胞の輪郭を示す。スケールバー = 20 μm.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
HTR10-mRFPは、父方クロマチン(すなわち、精子細胞核を可視化する)を標識し、二重受精におけるダイナミクスが7に報告されている。花粉管からの放出直後に、HTR10-mRFP標識精子核は依然として凝縮されている。しかし、各精子核は、カルヨガミーで受精したメスのガメ核と合併すると凝縮され、3~4時間後にゲーム膜融合7が行われている。未受精精子細胞は、gcs1精子細胞が受精せずに逮捕される胚嚢に示すように凝縮されたままである(図3D)。通常、肥沃なHTR10-mRFPを花粉親として使用する場合、7-8 HAPでピスティル内の排卵の57.9%±17.8%(平均±s.d.;n =16ピスティル)に2つのmRFP標識精子核信号が含まれており、ほぼすべての信号(97.2%)二重受精に成功した(図3Aに同様の信号パターンが示されている)を反映して、凝縮される。 DMP9KD/HTR10-mRFPの場合、2つのmRFP標識精子核を含む排卵はHTR10-mRFPと同様の頻度で観察されたが、そのうちの17.6%が単一受精6を示した。エピ蛍光顕微鏡を用いて生体内条件下で多数の排卵を観察するためにHTR10-mRFPダイナミクスを採用した。プロトコルはシンプルで迅速で、統計的証拠に十分なデータを収集できます。このプロトコルを最初の例として用いて、DMP9 KD/HTR10-mRFP精子細胞による中心細胞の単一受精の意義が6であることが証明された。
1つの花粉管に由来するHTR10-mRFP標識精子核の形態学的な違いに基づいて、受精パターンは3つの現象に分類される:(1)成功した二重受精、2つの凝縮によって特徴付けられるHTR10-mRFP標識精子核 (図 3A);(2)単一受精は、1つの凝縮されたHTR10-mRFP標識精子核と1つの凝縮されたHTR10-mRFP標識精子核を特色にする(図3B);(3)2つの凝縮されたHTR10-mRFP標識精子核を有する二重受精に失敗した(図3C)。
その他の文型の潜在的な原因(2)と(3)を考慮する必要があります。精子細胞は、半インインインインビトロ培養条件11の下で胚嚢に放出された数分後に卵細胞または中央細胞でそれぞれプラスモガミーを開始すると報告されている。さらに、第1および第2の受精の間に数分のタイムラグが存在するが、卵細胞と中心細胞11の受精の順序に関する好みはない。したがって、表現型(2)における凝縮および凝縮された精子核のペアは、単一受精の代わりに受精間のタイムラグを示しう場合がある。表現型(2)において有意な頻度で単一受精の発生を確認するためには、統計分析に十分なサンプルを多数調べる必要がある。2つの凝縮精子核(図3C)を有する表現型(3)は、血漿膜融合12以前の精子細胞の不動期間またはプラスモガミーとカヨガミーの間の期間を反映し得る。したがって、7-8 HAPの2つの凝縮精子核は二重受精の「失敗」を完全に反映しておらず、二重受精の成否を評価するために受粉後に卵子を観察する必要がある。この点に関しては、16-18 HAPでの排卵観察が推奨され、ほとんどの卵子は最初の花粉管によって送達された精子細胞との二重受精を完了し、HTR10-mRFP信号は次の花粉核まで残るだろう。図 3Dに示すように、受粉の日。
単一凝縮されたHTR10-mRFP標識精子核(図4A)のパターンはほとんど検出されなかったが、これは単一受精の結果として受精した女性のゲーテにおける別の父方HTR10-mRFPシグナルの迅速な消失によるものである可能性が高い。この分析では、3つ以上のHTR10-mRFP標識精子核も稀な症例として検出された(図4B)、受精回収システム10による第2の花粉管受容による。このプロトコルでは、1つの花粉管から派生した2つの精子細胞の挙動を追跡することが正確な評価のために重要であるため、これらの症例はデータから除外された。
胚嚢内のメスのガメの位置に対する極性は十分に調節されているので(すなわち、卵細胞と中央細胞はそれぞれ微生物とカラザル側で分化する)、どのメスのガメが受精しているかを親戚で判断できる。mRFP標識精子核の位置。しかし、両方の状態が凝縮精子核信号によって示されるので、未受精状態とプラスモガミー状態の区別には制限がある。精子核が凝縮された場合に、ガメ膜融合後にプラスモガミーが起こったかどうかを正確に評価するためには、女性のガメ膜マーカーラインを用いる必要がある(2018)6。例えば、中心細胞血漿膜を可視化したpFWA::GFP-PIP植物12を女性の親として使用した場合、中心細胞と融合した精子細胞がプラスモガミーにあったことが明らかである(補足図1)).
要約すると、ここで説明する我々のプロトコルは、各女性のゲームにおける受精の成功または失敗の統計的評価に使用することができる。女性のプラズマ膜マーカーの採用は、プラズモガミーを判断するために必要であるが、我々の方法は受精レギュレータの機能分析に有用である。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
本研究は、日本学術振興会(JP17H05832 to T.I.)の支援を受け、千葉大学植物化学植物分子科学戦略優先研究推進プログラムの助成を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
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| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
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| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 G |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA 0.75), dry |
References
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