Summary
Vi visar en metod för att bestämma framgångsrik eller misslyckad befruktning på grundval av spermier nukleär morfologi i Arabidopsis dubbel befruktning med hjälp av en epifluorescens Mikroskop.
Abstract
Blommande växter har ett unikt sexuellt reproduktionssystem som kallas "dubbel befruktning", där var och en av spermacellerna exakt säkringar med en äggcell eller en central cell. Sålunda äger två oberoende fertiliserings händelser rum nästan samtidigt. Den befruktade äggcell och Central cell utvecklas till zygot och Endosperm, respektive. Därför är exakt kontroll av dubbel befruktning viktigt för den efterföljande utsädesutveckling. Dubbel befruktning sker i den kvinnliga gametofyten (embryo SAC), som är djupt gömd och täckt med tjocka fröämnet och äggstock vävnader. Denna pistill vävnad konstruktion gör observation och analys av dubbel befruktning ganska svårt och har skapat den nuvarande situationen där många frågor om mekanismen för dubbel befruktning förbli obesvarade. För funktionell utvärdering av en potentiell kandidat för befruktning regulator, fenotypisk analys av befruktning är viktigt. För att döma slutförandet av befruktning i Arabidopsis thaliana, formerna av fluorescens signaler märkning spermier kärnor används som indikatorer. En spermie cell som misslyckas med att befrukta indikeras av en kondenserad fluorescens signal utanför de kvinnliga könsceller, medan en spermie cell som framgångsrikt befruktas indikeras av en dekondenserad signal på grund av karyogamy med den kvinnliga könsceller kärna. Den metod som beskrivs här ger ett verktyg för att bestämma lyckad eller misslyckad befruktning under in vivo villkor.
Introduction
Blommande växter producera frön genom dubbel befruktning, en process som styrs direkt av interaktioner mellan proteiner lokaliserade på könscell plasmamembran1,2. Blommande växt manliga könsceller, ett par spermier, utvecklas i pollen. Ett pollen rör som växer efter pollinering levererar ett par spermier till kvinnliga könsceller, en äggcell och en central cell, som utvecklas i ett embryo SAC. Efter de manliga och kvinnliga könsceller möts, proteiner på könscell ytan främja erkännande, kvarstad och fusion att slutföra dubbel befruktning. I tidigare studier, den manliga könscell membranproteiner generativ cell specifik 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4 och könscell uttryckte 2 (GEX2)5 identifierades som fertilisering regulatorer inblandade i könscell fusion och respektive bilaga. Vi identifierade nyligen en manlig könscell-specifika membranprotein, DUF679 domän membranprotein 9 (DMP9), som en befruktning regulator inblandade i könscell interaktion. Vi fann att en minskning av DMP9 uttrycket resulterar i betydande hämning av äggcell befruktning under dubbel befruktning i a. thaliana6.
Som dubbel befruktning sker i ett embryo SAC, som är inbäddad i en fröämnet som ytterligare insvept med äggstock vävnad, är det svårt att observera och analysera de stater av dubbel befruktning processer. Av denna anledning finns det fortfarande många oklara punkter som hindrar en fullständig förståelse av hela mekanismen för dubbel befruktning kontroll. Inrättandet av observationsmetoder för att spåra beteendet hos könsceller under dubbel befruktning under in vivo villkor är oumbärlig för funktionell analys av potentiella kandidater för befruktning regulatorer. Nyligen genomförda studier har gett markör linjer där könscell subcellulära strukturer är märkta med fluorescerande proteiner. I den här artikeln visar vi ett enkelt och snabbt protokoll för att observera dubbel befruktning som har inträffat i ett embryo SAC härrör från artificiellt pollinerade pistiller. Använda spermier cell Nucleus markör linje HTR10-MRFP7, gödsling tillstånd av varje kvinnlig könscell kan diskrimineras på grundval av spermier nukleär signal morfologi. Vårt protokoll med fokus på en sådan morfologisk förändring av spermiernas kärnor vid befruktning kan effektivt få en tillräcklig mängd data för statistiska bevis. En DMP9-knockdown linje med HTR10-MRFP bakgrund (DMP9KD/HTR10-MRFP) användes som manliga växter för att visa en enda befruktning mönster. Protokollet lämpar sig också för funktionell analys av andra gödsling regulatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. artificiell pollinering
Anmärkning: Innan du påbörjar processen, krävs ett par av No. 5 pincett.
- Grow a. thaliana (Col-0) vid 22 ° c under en 16-h ljus/8-h mörk cykel i en tillväxt kammare.
Anmärkning: Skär och ta bort den första utvecklade Blomstjälken med sax för att främja utvecklingen av axillär knoppar. Kraftigt växande växter (2-3 veckor efter kapning av den första stjälken; Plant höjd ca 25 cm) är lämpliga för analys. - För att försvaga, avlägsna sepal (figur 1b), kronblad (figur 1c) och ståndare (figur 1d) av blomknoppar vid etapp 118 (figur 1a) med hjälp av No. 5 tång. Knopp med bitar av kronblad ses på toppen är bäst.
Anmärkning: Använd en lämplig kvinnlig könscell markör linje. I detta protokoll använde vi en vild typ växt som den kvinnliga föräldern. - Femton till arton timmar efter emasympning, ta ståndare av en DMP9KD/HTR10-MRFP blomma på etapp 138 genom att nypa glödtråden med pinpett.
- Att pollinera, försiktigt klappa stigmatiseringen av en emasokulerade pistill flera gånger med en dehiscent anther.
2. beredning av Ovule för observation
Anmärkning: Följande objekt krävs: ett glid glas med dubbelhäftande tejp fäst, nr 5 tång, en 27 G injektionsnål, och en dissekera Mikroskop.
- 7 till 8 h efter pollinering (HAP), samla upp pistill och placera den på dubbelhäftande tejp, tryck sedan försiktigt med pinpetten för att fixa pistill på bandet (figur 2A, A).
Anmärkning: De flesta fröämnen i en pistill får minst ett pollen rör 10 HAP9. Om båda eller någon av spermacellerna från den första pollen röret inte befrukta, skulle en andra pollen röret lockas av fröämnet på grund av fertilisering Recovery system10. För att analysera spermier kärnor morfologi från första pollen röret, det rekommenderas att slutföra fröämnet beredning av 10 HAP senast. - Klipp av de övre och nedre ändarna av äggstockarna med hjälp av en injektionsnål under ett dissekera Mikroskop (figur 2b, B ').
- Slits äggstockarna väggen längs båda sidor av replum (figur 2C, C) genom att flytta spetsen på injektionsnålen.
Anmärkning: För in injektionsnålen för att förhindra fröämnet separation från septum. - Genom att använda injektionsnålen (figur 2D, D).
- Nyp basen av septum som fröämnen är anslutna, och lyft upp den försiktigt med tång (figur 2e).
- Överför fröämnen till en droppe vatten på ett glid glas och täck försiktigt med ett täckglas för observation under ett fluorescensmikroskop (figur 2e, E).
3. mikroskopi
Anmärkning: I detta protokoll använde vi ett epifluorescensmikroskop försett med en fluorescensfilterkub (se tabell över material), en digitalkamera och medföljande programvara.
- Förvärva bilder av fröämnen innehåller spermier kärnor märkta med MRFP med en 20x eller 40x objektiv objektiv och den utrustade digitalkamera.
- Bekräfta antalet mRFP-märkta spermie kärnor i ett embryo SAC.
Anmärkning: Ovules som innehåller två mRFP-märkta spermie kärnor kan inkluderas i befolkningsstorleken för statistisk analys. - Bekräfta formen och positionen för varje mRFP-märkt spermie kärna i ett embryo SAC.
Anmärkning: Omedelbart efter att ha släppts från ett pollen rör, ett par kondenserade mRFP-märkta spermier kärnor är lokaliserade mellan ägget och den centrala cellen. En dekondenserad mRFP-märkt spermie kärna detekteras vid sidan av chalazal slutet indikerar Central cell befruktning, till exempel. Genom att använda en lämplig kvinnlig könscell membran markör linje, som visas i kompletterande figur 1, oavsett om spermier cell genomgår plasmogami (efter membran fusion men innan karyogamy) kan övervakas tydligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovules från en pistill pollineras med DMP9KD/HTR10-MRFP samlades in vid 7-8 HAP och observerades.
De flesta fröämnen innehöll två dekondenserade MRFP-märkta spermie kärnor vid äggcell (micropylar sida) och Central cell (charazal end Side) Nucleus positioner, respektive (figur 3a), vilket indikerar framgångsrik dubbel befruktning. Dessutom, fröämnen innehåller en dekondenserad MRFP-märkta spermier kärna i centrala cellkärnan plus en kondenserad MRFP-märkta spermier kärna utanför äggcellen (figur 3b) observerades, vilket indikerar en enda befruktning. När det gäller misslyckad dubbel befruktning observerades två kondenserade mRFP-märkta spermie kärnor vid gränsen av äggcellen och den centrala cellen (figur 3c), som i gcs1 muterade spermie celler (figur 3D)3,4 .
I analysen med DMP9KD/HTR10-MRFP pollen, fröämnen innehåller en enda kondenserad MRFP-märkta spermier kärna (figur 4a) eller tre eller fler MRFP-märkta spermier kärnor (figur 4b) observerades sällan.
Figur 1: blomknoppar som lämpar sig för emasympning. (A) en blomma knopp på etapp 11, visar bitar av kronbladen på toppen. (B-D) En blomma knopp där avlägsnades foderblad (B) och kronblad (C) och det var sedan emasokuleras helt (D). Den anther sårruptur har inte inträffat ännu. Scale bar = 1 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: flöde av fröämnet provberedning. Procedurerna visas med illustrationer (a-e) och fotografier (a "-e"). (a, a) En pistill placeras på dubbelhäftande tejp fäst på ett glid glas, och dess övre och nedre ändar är avskurna med en injektionsnål. (b, b ') Äggstockarna väggen är anskäras längs båda sidor av replum. (c, c) Båda sidor av äggstockarna väggarna öppnas, everted, och pressas på tejpen för fixering. (d, d) Septum där fröämnen är anslutna i matriser exponeras. (e, e) Ena änden av septum kläms och lyfts upp med pinkoppar. Septum med anslutande fröämnen överförs till en droppe vatten på ett glid glas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: fertilisering fenotyper bedöms av spermier nukleär signal morfologi i ovule. (A) lyckad dubbel befruktning som indikeras av två Dekondenserade MRFP-märkta spermie kärnor (pilspetsar). B) enkel befruktning av DMP9KD/HTR10-MRFP spermie celler som indikeras av en dekondenserad MRFP-märkt spermie kärna (pilspets) och en kondenserad MRFP-märkt spermie kärna (pil). (C) misslyckad dubbel befruktning av DMP9KD/HTR10-MRFP spermier som indikeras av två kondenserade MRFP-märkta spermie kärnor (pilar). (D) ett exempel på misslyckad dubbel befruktning av Gcs1HTR10-MRFP spermier celler. En markör linje där ägg cells kärnan (EN) är märkt med RFP användes. Två kondenserade mRFP-märkta spermie kärnor (pilar) arresteras utan befruktning vid 18 HAP. E) Schematisk illustration av en ovule. EC = äggcell, CC = Central cell, SC = synergid celler, ES = embryo SAC, MP = micropyle, CHZ = chalazal. Skalstreck = 20 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: andra potentiella fertilisering fenotyper. Ovules från en pistill pollineras med DMP9KD/HTR10-MRFP innehåller sällan en enda kondenserad MRFP-märkt spermier kärna (a), eller tre eller fler kondenserade MRFP-märkta spermier kärnor (B) (pilar). Skalstreck = 20 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: kondenserad spermie kärnor vid plasmogami under befruktningen, bedömas genom kombination med en kvinnlig plasmamembran markör linje. Pfwa:: GFP-pip där det centrala cell plasmamembranet visualiseras användes som kvinnlig förälder (GFP). GFP-PIP har även etiketter endo-membran12. Den fröämnet innehåller två kondenserade MRFP-märkta spermier kärnor (pilar; RFP). Den RFP signalen vid charazal slutet sida (pil) visas i den centrala cellen (sammanfoga), vilket indikerar att spermie kärnan är i plasmogami (efter könscell membran fusion, men innan karyogamy). Panelen till höger är en förstoring av området omgivet av streckade linjer i den sammanslagna bilden. Ett tomt område som är markerat med en asterisk motsvarar positionen för den centrala cellkärnan. Den streckade linjen indikerar konturerna av den centrala cellen mot äggcellen. Skalstapel = 20 μm. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HTR10-mRFP etiketter faderlig kromatin (dvs, visualiserar spermier cellkärnor), och dynamiken i dubbel befruktning har rapporterats7. Omedelbart efter utsläpp från ett pollen rör, HTR10-mRFP-märkta spermier kärnor är fortfarande kondenserad. Emellertid, var och en av spermiernas kärnor är dekondenseras vid sammanslagning med en befruktad kvinnlig könscell kärna vid karyogamy tre till fyra timmar efter könscell membran fusion7. Obefruktade spermaceller förblir kondenserade, som visas i ett embryo SAC där gcs1 spermier är arresterad utan befruktning (figur 3D). Vanligtvis, när den fertila HTR10-MRFP används som pollen förälder, 57,9% ± 17,8% (medelvärde ± SD; n = 16 pistiller) av fröämnen i en pistill på 7-8 HAP innehåller två MRFP-märkta spermier kärnor signaler, och nästan alla av signalerna (97,2%) avkondenseras, vilket återspeglar en lyckad dubbel befruktning (ett liknande signal mönster visas i figur 3a). När det gäller DMP9KD/HTR10-MRFP, fröämnen innehåller två MRFP-märkta spermier kärnor observerades vid en liknande frekvens som för HTR10-MRFP, men 17,6% av dem visade enda befruktning6. Vi antog HTR10-MRFP Dynamics för observation av ett stort antal fröämnen under in vivo villkor med hjälp av ett epifluorescensmikroskopi Mikroskop. Protokollet är enkelt och snabbt, vilket gör det möjligt att samla in tillräckliga uppgifter för statistiska bevis. Med hjälp av detta protokoll som första instans, var betydelsen av enkel befruktning av den centrala cellen av DMP9KD/HTR10-MRFP spermier visade sig vara6.
Baserat på de morfologiska skillnaderna HTR10-mRFP-märkta spermie kärnor härledda från ett pollen rör, är befruktningen mönster klassificeras i tre fenotyper: (1) framgångsrik dubbel befruktning, som kännetecknas av två dekondenserade HTR10-mRFP-märkta spermie kärnor (figur 3a); (2) enkel befruktning, som har en kondenserad HTR10-mRFP-märkt spermie kärna och en dekondenserad HTR10-mRFP-märkt spermie kärna (figur 3b); och (3) misslyckades dubbel befruktning, som har två kondenserade HTR10-mRFP-märkta spermier kärnor (figur 3c).
Andra potentiella orsaker till fenotyper (2) och (3) bör övervägas. Det har rapporterats att spermaceller respektive börjar plasmogami med en äggcell eller Central cell flera minuter efter att ha släppts ut i ett embryo SAC under semi-in vitro odlingsförhållanden11. Dessutom finns det en fördröjning på några minuter mellan den första och andra befruktningen, även om det inte finns någon preferens för befruktnings ordningen i äggcellen och den centrala cellen11. Därför kan ett par kondenserade och dekondenserade spermie kärnor i fenotyp (2) tyda på en tidsfördröjning mellan befruktningen i stället för enkel befruktning. För att bekräfta förekomsten av en enda befruktning med en signifikant frekvens av fenotyp (2) bör ett antal prover som är tillräckliga för statistisk analys undersökas. Fenotyp (3), som har två kondenserade spermier kärnor (figur 3c), kan återspegla en period av orörlighet av spermier före plasmamembran fusion12 eller perioden mellan plasmogami och karyogamy. Därför, två kondenserad spermie kärnor på 7-8 HAP inte helt återspeglar "misslyckande" av dubbel befruktning, och det är nödvändigt att iaktta fröämnen vid en senare tidpunkt efter pollinering att bedöma framgång eller misslyckande dubbel befruktning. I detta avseende, fröämnet observation vid 16-18 HAP rekommenderas, eftersom de flesta av de fröämnen skulle ha avslutat dubbel befruktning med spermier som levereras av den första pollen röret, och HTR10-MRFP signaler av obefruktade spermier kärnor skulle förbli tills nästa dag för pollinering, som visas i figur 3D.
Ett mönster av enstaka kondenserade HTR10-MRFP-märkta spermier kärna (figur 4a) upptäcktes sällan, vilket var sannolikt på grund av det snabba försvinnandet av en annan paternal HTR10-MRFP signal i den befruktade kvinnliga könscell som en följd av enkel befruktning. I denna analys, tre eller flera HTR10-mRFP-märkta spermier kärnor upptäcktes också som ett sällsynt fall (figur 4b), på grund av andra pollen röret acceptans av fertilisering Recovery system10. I detta protokoll var dessa fall uteslutna från data, eftersom spåra beteenden av två spermier som härrör från ett pollen rör är avgörande för noggrann bedömning.
Eftersom polariteten för positionerna för de kvinnliga könsceller i ett embryo SAC är väl reglerad (dvs., äggcellen och den centrala cellen differentierar vid micropylar och chalazal sida, respektive), som kvinnliga könscell är gödslings kan bedömas av den relativa positionerna för mRFP-märkta spermie kärnor. Det finns dock en begränsning i att skilja mellan obefruktad och plasmogamy stater, eftersom båda staterna indikeras av den kondenserade spermie Atom signalen. Att utvärdera exakt om plasmogami efter könscell membran fusion har inträffat eller inte när spermierna kärnor kondenseras, är det nödvändigt att använda kvinnliga könscell membran markör linjer, som rapporterats av Takahashi et al. (2018)6. Till exempel, när en Pfwa:: GFP-pip Plant12 där Central cell plasmamembranet visualiserades användes som en kvinnlig förälder, är det tydligt att en spermie cell smält med den centrala cellen var i Plasmogami (kompletterande figur 1 ).
Sammanfattnings, vårt protokoll som beskrivs här kan användas för statistisk bedömning av framgång eller misslyckande av befruktning i varje kvinnlig gamete. Även om anställning av den kvinnliga plasmamembran markör krävs för att döma plasmogami, vår metod är användbar för funktionell analys av fertilisering regulator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Japan Society för främjande av vetenskap KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) och genom finansiering från den strategiska prioriterade forsknings främjande program om fytokemiska växt molekylära vetenskaper, Chiba University (Japan).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
||
| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 G |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA 0.75), dry |
References
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H.
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M.
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
- von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
- Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
- Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
- Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
- Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
- Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).
