Summary
यह प्रोटोकॉल एक मूल सेटअप का वर्णन करता है जो सीधे मोटी पौधे के वर्गों में रोडामिन-आधारित फ्लोरोसेंट जांच और लिगिन बहुलक के बीच Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) का मूल्यांकन करने के लिए स्पेक्ट्रल और फ्लोरेसेंस आजीवन मापन का संयोजन करता है।
Abstract
लिग्नोसेल्यूलोसिक बायोमास (एलबी) में, एंजाइमों की गतिविधि हाइड्रोलिसिस प्रक्रिया के दौरान लिग्निन के साथ गैर-विशिष्ट बातचीत की उपस्थिति से सीमित होती है, जो एंजाइमों को उनके सब्सट्रेट से दूर रखता है। इन जटिल बातचीत का लक्षण वर्णन इस प्रकार पौंड जैसे जटिल सब्सट्रेट्स में एक चुनौती है। यहां विधि फ्लोरोफोर-टैग किए गए अणुओं और देशी ऑटोफ्लोरोसेंट लिग्निन के बीच आणविक बातचीत को मापता है, जो Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) द्वारा प्रकट किया जाएगा। दो एक्सोजेनस फ्लोरोफोरस का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में एफआरआई माप के विपरीत, लिग्निन का उपयोग करके पौधों में एफआरआई माप इसके जटिल ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण तुच्छ नहीं है। फ्लोरेसेंस उत्सर्जन और जीवनकाल: हमने फ्लोरेसेंस के दो पूरक गुणों के सहसंबद्ध अवलोकन के साथ एक मूल अधिग्रहण और विश्लेषण पाइपलाइन विकसित की है। एसएफआईआईम (स्पेक्ट्रल और फ्लोरोसेंट लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी) उच्च संवेदनशीलता के साथ इन बातचीत की मात्रा प्रदान करता है, जिससे बायोमॉलिक्यूल्स और लिग्निन के बीच विभिन्न इंटरैक्शन स्तरों का खुलासा होता है।
Introduction
ग्लूकोज जैसे मोनोमेरिक शर्करा में हाइड्रोलिजिंग लिग्नोसेल्यूलोज को एंजाइमों की आवश्यकता होती है। उनकी गतिविधि एंजाइमों और लिग्निन1,2के बीच गैर - विशिष्ट बातचीत की स्थापना से संयमित मानी जाती है , बाद में हाइड्रोफोबिक बहुलक और लिग्नोसेल्यूलोस3का एक प्रमुख घटक है । इस प्रकार, सेलुलर पैमाने पर सीधे इस तरह की बातचीत को मापने के लिए मात्रात्मक रूप से एक चुनौती है जिसे एंजाइम उत्प्रेरक गतिविधि और लिगनोसेल्यूलोज प्री-ट्रीटमेंट4को अनुकूलित करने के लिए संबोधित किया जाना चाहिए।
Förster (या फ्लोरेसेंस) अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) माप सीटू में गधे जैव अणुओं बातचीत के लिए पसंद की एक विधि है। यह गैर रेडिएटिव ऊर्जा हस्तांतरण एक दाता और एक स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर के बीच हो सकता है यदि वे विभिन्न शर्तों को पूरा करते हैं। दाता उत्सर्जन स्पेक्ट्रम को कम से आंशिक रूप से, स्वीकारकर्ताओं को उत्तेजना स्पेक्ट्रम को ओवरलैप करना चाहिए । इस प्रकार इस तरह के प्रयोगों के लिए फ्लोरोफोरस का चुनाव महत्वपूर्ण है। फिर, स्थानांतरण दक्षता उनकी दूरी5 की छठी शक्ति के साथ कम हो जाती है और केवल तभी होती है जब दोनों अणु निकट आस में होते हैं (आमतौर पर नैनोमीटर रेंज में)। अन्य आकस्मिकता डाइपोल-डाइपोल ओरिएंटेशन जैसे हस्तांतरण दक्षता को बदल सकती है लेकिन अगर फ्लोरोफोरस में लचीलापन है तो इसे कम किया जाता है।
एफआरईटी को विभिन्न तकनीकों से मापा जा सकता है और विस्तृत विवरण साहित्य6,7में पाए जा सकते हैं । संक्षेप में, मुख्य विधियां भरोसा करती हैं: i) संवेदनशील उत्सर्जन जिसमें स्वीकार्य उत्सर्जन फ्लोरेसेंस में भिन्नता का पालन किया जाता है और मुख्य रूप से गुणात्मक परिणाम प्रदान करता है; ii) स्वीकारकर्ता फोटोब्लीचिंग जिसमें दाता उत्सर्जन फ्लोरेसेंस को स्वीकारकर्ता फोटोब्लीचिंग से पहले और बाद में मापा जाता है (इस मामले में, अधिक सटीक FRET अनुमान प्राप्त किए जा सकते हैं लेकिन निश्चित नमूनों पर लागू मजबूत लेजर शक्ति की आवश्यकता होती है); और iii) आजीवन माप जो स्वीकारकर्ता की उपस्थिति में दाता के लिए कम हो जाता है। इस विधि के लिए विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता होती है और फ्लोरोफोर्स के बीच सटीक और संवेदनशील बातचीत माप की अनुमति देता है। फ्लोरोसेंट जांच और लिग्नोसेल्यूलोज के बीच एफआरटी माप को ध्यान में रखते हुए, मुख्य कठिनाई यह है कि लिग्नोसेल्यूलोस एक अच्छी तरह से विशेषता फ्लोरोफोर नहीं है: इसमें एक मजबूत देशी और स्पेक्टरैली-व्यापी ऑटोफ्लोरेसेंस है, जो मुख्य रूप से लिग्निन से उत्पन्न होता है, और बायोमास प्रजातियों8,9पर निर्भर करता है।
इस पत्र में, हम लकड़ी/पौधों के नमूनों के वर्गों के अनुकूल एक नई और मूल प्रक्रिया का प्रस्ताव करते हैं । यह एसएफआईएम आधारित विधि देशी लिग्नोसेल्यूलोज नमूनों में फ्लोरोसेंट जांच और लिग्निन के बीच मात्रात्मक एफआरटी मापन का रास्ता खोलती है।
Protocol
1. नमूना तैयारी
नोट: नमूनों को तैयार करने के लिए लगातार कदम चित्रा 1में वर्णित हैं ।
- पौधे के नमूने की तैयारी
- लकड़ी के चड्डी या टुकड़ों से, उनकी संरचना को नुकसान पहुंचाए बिना रेजर ब्लेड के साथ 1 सेमी लंबे नमूने काट लें।
- पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) माध्यम में नमूने एम्बेड, उन्हें 100% खूंटी तक पहुंचने तक पानी में पतला खूंटी एकाग्रता बढ़ाने के लगातार समाधान में सूई द्वारा।
- पानी निकालने के लिए वैक्यूम के नीचे नमूना रखें।
- धीरे से 24 घंटे के लिए 30% v/v खूंटी में नमूनों हलचल ।
- धीरे से 24 घंटे के लिए ५०% v/v खूंटी में नमूनों हलचल ।
- धीरे से 70 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 100% खूंटी में नमूने हलचल (शुद्ध खूंटी कमरे के तापमान पर ठोस है).
- कैप्सूल में नमूने 70 डिग्री सेल्सियस (गर्म प्लेट पर) रखें और कमरे के तापमान तक पहुंचने तक उत्तरोत्तर तापमान में कमी करें।
- माइक्रोटोम और डिस्पोजेबल ब्लेड का उपयोग करके इन खूंटी ब्लॉकों से ध्यान से 30-60 माइक्रोन मोटाई फ्लैट अनुभाग तैयार करें।
- धाराओं से खूंटी को हटाने के लिए 5 मिन के लिए पानी के लगातार तीन स्नान में वर्गों को इकट्ठा करें और धोएं।
- फ्लोरोसेंट जांच की तैयारी
- पीएच 6.0 पर 30 एमएम फॉस्फेट का बफर सॉल्यूशन तैयार करें।
- खूंटी rhand dextran rhodamine जांच पाउडर वजन ।
- 0.1 ग्राम/एल की अंतिम एकाग्रता पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए एक ग्लास शीशी में निरंतर सरगर्मी के साथ बफर में जांच पाउडर भंग करें।
- पौधे का नमूना धुंधला
- फ्लोरोसेंट जांच के 500 माइक्रोन के साथ इनक्यूबेट अनुभाग (अंधेरे में प्लास्टिक ट्यूब (प्रति ट्यूब 3 वर्गों से अधिक नहीं) में 72 एच (कोई सरगर्मी) के लिए 1.2.3 देखें।
- ब्रश के साथ एक अनुभाग उठाओ, एक साफ चादर के साथ बफर को एसोर्ब करें (अनुभाग को सुखाने से बचें), और फिर एक कवर ग्लास और #1.5 H कवरस्लिप के बीच इनक्यूबेटेड अनुभागों को माउंट करें।
2. फ्लोरेसेंस लाइफटाइम और स्पेक्ट्रल मेजरमेंट सिस्टम अंशांकन
नोट: एसफ़िम माप नप के लिए पूरा कार्यप्रवाह चित्रा 2में प्रस्तुत किया गया है।
- एसएफलिम डिटेक्टर की स्पेक्ट्रल विंडो चौड़ाई निर्धारित करें।
- 0.17 माइक्रोन ग्लास बॉटम के साथ कल्चर बॉक्स में यूरिया क्रिस्टल लगाएं।
- एक माइक्रोस्कोप नमूना धारक पर संस्कृति बॉक्स प्लेस और 20x उद्देश्य का चयन करें ।
- 900 एनएम तरंगदैर्ध्य और 2% शक्ति के साथ एक टीआई: एसए लेजर का चयन करें, और स्कैनिंग चालू करें।
- एसएफआईआईम डिटेक्टर पर दूसरा हार्मोनिक सिग्नल एकत्र करें।
नोट: दूसरा हार्मोनिक संकेत 450 एनएम की बिल्कुल आधी उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर उत्सर्जित होता है; तात्कालिक होने के साथ-साथ यह उपाय सिस्टम का इंस्ट्रूमेंटल रिस्पांस फंक्शन भी प्रदान करता है। - धीरे-धीरे लेजर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य को 900 से 980 एनएम तक समायोजित करें जब तक कि दूसरा हार्मोनिक संकेत दूसरे स्पेक्ट्रल चैनल (462.5 एनएम) में एकत्र नहीं हो जाता।
- स्पेक्ट्रल विंडो की लंबाई (12.5 एनएम) निर्धारित करें।
- यदि स्पेक्ट्रल रेंज उम्मीद से अलग है, तो निम्नलिखित कार्य करके समस्या निवारण करें।
- लेजर को 910 एनएम में एडजस्ट करें।
- केवल पहले चैनल (पहली चैनल सीमा) पर दूसरे हार्मोनिक संकेत को मापने के लिए स्क्रॉल व्हील के साथ झंझरी स्थिति को स्थानांतरित करें।
- लेजर को 935 एनएम में समायोजित करें।
- केवल पहले चैनल (दूसरी चैनल सीमा) पर दूसरे हार्मोनिक संकेत को मापने के लिए स्क्रॉल व्हील के साथ झंझरी स्थिति को स्थानांतरित करें।
- समग्र स्पेक्ट्रोमीटर चैनलों का अंशांकन
- माइक्रोस्कोप स्टेज पर मिरर डालें।
- दिखाई सतत लेजर (458 एनएम, 1% शक्ति) का चयन करें।
- एसएफआईएल डिटेक्टर पर प्रतिबिंब संकेत एकत्र करें और जांच करें कि क्या फोटॉन ों को उपयुक्त स्पेक्ट्रल चैनल में मापा जाता है।
- सभी उपलब्ध निरंतर लेजर (514 एनएम, 561 एनएम और 633 एनएम) के साथ चरण 2.2.2 और 2.2.3 दोहराएं।
- यदि स्पेक्ट्रल चैनल उम्मीद से अलग है, तो स्क्रॉल व्हील के साथ झंझरी स्थिति को स्थानांतरित करें और चरण 2.1 और 2.2 दोहराएं।
3. नमूना फ्लोरेसेंस लक्षण वर्णन
- एक फिल्म धारक गौण (जैसे, जैस्को एफपी-8500 उपकरण) से लैस स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर में, पौधे अनुभाग नमूना (फ्लोरोसेंट जांच के साथ इनक्यूबेटेड नहीं) रखें।
- उपाय फ्लोरेसेंस उत्सर्जन आमतौर पर रेंज 300-600 एनएम पर जबकि नमूना रोमांचक आम तौर पर सीमा 250-550 एनएम पर ।
- 3 डी फ्लोरेसेंस मानचित्र आकर्षित करने के लिए फ्लोरेसेंस तीव्रता बनाम उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य को प्लॉट करें।
- भूखंड से अधिकतम उत्तेजना/उत्सर्जन क्षेत्र निर्धारित करें।
4. स्पेक्ट्रल एफआरटी माप
- ऑटोफ्लोरेसेंस अंशांकन
- उद्देश्य 20x (एनए: 0.8) का चयन करें।
- 750 एनएम पर दो फोटॉन लेजर उत्तेजना सेट करें।
- स्लाइड और कवरस्लिप के बीच गेहूं के भूसे (डब्ल्यूएस) को अकेले पौधे अनुभाग रखें।
- सॉफ्टवेयर में निम्नलिखित मापदंडों को लागू करें। लैम्ब्डा मोड पर स्विच करें। 9.7 एनएम रिज़ॉल्यूशन के साथ स्पेक्ट्रल डिटेक्टर सीएसएस का चयन करें। 420 से 722 एनएम के बीच स्पेक्ट्रल रेंज का चयन करें।
- छवि प्राप्त करें।
- दाता उत्सर्जन शिखर (इस सेटअप के साथ 470 एनएम) निर्धारित करें।
- स्वीकारकर्ता का अंशांकन
- 0.17 माइक्रोन ग्लास बॉटम के साथ संस्कृति बॉक्स में रोडामिन-आधारित फ्लोरोसेंट जांच रखें।
- एक ही सेटिंग के साथ छवि प्राप्त करें।
- स्वीकारकर्ता उत्सर्जन शिखर (इस सेटअप के साथ 570 एनएम) निर्धारित करें।
- अधिकतम "अकेले WS" संकेत और दाता के रूप में कोई स्वीकारकर्ता संकेत के साथ स्पेक्ट्रल रेंज निर्धारित केवल sFLIM माप (इस सेटअप के साथ 460-490 एनएम) के लिए उत्सर्जन ।
- नमूना माप
- स् लीवऔर कवरस्लिप के बीच दाग दार पौधे सेक्शन रखें।
- एक ही सेटिंग के साथ छवि प्राप्त करें।
- एलएसएम फाइल को सेव कर लें।
- गुणात्मक रूप से "WS अकेले नमूना" और रोडामिन नमूने की तुलना में स्वीकारकर्ता उत्सर्जन शिखर में वृद्धि की तुलना में दाता उत्सर्जन शिखर में कमी के साथ एक मजबूत FRET घटना सहयोगी ।
5. एसएफलिम माप
नोट: एसएफलिम सेटअप के लिए, उपयोग किया गया सिस्टम एक समय डोमेन एसएफलिम सेटअप है जैसा कि पहले10वर्णित है। एक ईमानदार माइक्रोस्कोप और विभिन्न समय सहसंबद्ध एकल फोटॉन काउंटिंग कार्ड और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप निर्माताओं का उपयोग किया जा सकता है और प्रोटोकॉल को तदनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।
- सिस्टम को एसएफलिम मोड पर स्विच करें।
- 4.1.1 और 4.1.2 में वर्णित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सेट करें।
- एसएफआईएम डिटेक्टर पर फ्लोरोसेंट फोटॉन भेजने के लिए सॉफ्टवेयर में नॉन-डेसकैंड मोड पर स्विच करें।
- SPC150 पर फोटॉन गिनती की अनुमति देने के लिए सक्षम मोड के लिए sFLIM अधिग्रहण सेट करें।
- SPC150 पर 30 s समय संग्रह का चयन करें।
- चेक करें कि सीएफडी 1 x 105 और 1 x 106के बीच है।
सावधानी: सुनिश्चित करें कि TCSPC कार्ड पर मापा फोटॉनकी हमेशा लेजर उत्तेजना आवृत्ति का 1% से कम है (इस सेटअप में, लेजर उत्तेजना आवृत्ति 80 मेगाहर्ट्ज है और पता लगाने की दर किसी भी पिक्सेल में 800 किलोवाट से अधिक नहीं हो सकता है एक ढेर प्रभाव11से बचने के लिए) ।
- स्लाइड और कवरस्लिप के बीच "अकेले WS" संयंत्र अनुभाग रखें।
- लेजर स्कैन की अनुमति देने के लिए सॉफ्टवेयर को निरंतर मोड में सेट करें।
- नमूने पर माप क्षेत्र चुनें।
- क्लिक करें SPC150 पर शुरू करें।
- एसडीटी फाइल को सेव करें।
- प्रति कंडीशन कम से कम 10 नमूनों के लिए प्रक्रिया दोहराएं।
- स् लीवऔर कवरस्लिप के बीच दाग दार पौधे सेक्शन रखें।
- दोहराएं कदम 5.2.1 - 5.2.5।
6. एसएफलिम विश्लेषण
- "अकेले WS" पर एसएफआईएम डेटा अधिग्रहीत फ़ाइल का चयन करें और फाइल का उपयोग करके उन्हें SPCImage सॉफ्टवेयर में आयात करें। आयात।
- फिट मापदंडों का चयन करें।
- विकल्प से । मॉडल, अधूरा बहुघातोंका चयन करें: 12.5 एनएस।
- विकल्प से । वरीयताएं, गणना इंस्ट्रूमेंटल रिस्पांस काचयन अपने आप चुनें .
- मुख्य पैनल के सही मेनू से, 2 घातीय फिट मॉडल का चयन करें:
- प्रत्येक चैनल के लिए, फिटिंग मॉडल लागू करें और एक स्प्रेडशीट (एक1,एक2,टी1,टी2)के लिए फिट मापदंडों को बचाने के लिए ।
- चैनलों और प्रयोगों के बीच तुलना के लिए, स्प्रेडशीट (टीएम)में मतलब फ्लोरेसेंस लाइफटाइम की गणना करें:
- सभी चैनलों में सभी नमूनों (कम से कम 10) के लिए औसत जीवनकाल की गणना करें।
- दाता चैनलों पर टीएम का विश्लेषण करें (चैनल 1 से 3 तक: 460-490 एनएम) और समर्पित चैनल (चैनल 2 467.5 - 480 एनएम के अनुरूप) निर्धारित करें जो उच्चतम फोटॉन संख्या दिखाता है और लिगिन अधिकतम उत्सर्जन से मेल खाता है। चैनल 2 से मान 6.7 कदम में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- दाग डब्ल्यूएस पर एसएफआईएम डेटा अधिग्रहीत फ़ाइल का चयन करें और उन्हें SPCImage सॉफ़्टवेयर में आयात करें।
- 6.1-6.4 कदम दोहराएं।
- पिछले चयनित चैनल WS अकेले (टीएमडी) में दाता के लिए FRET दक्षता ईFRET की गणना करें और दाग संयंत्र नमूना (टीएमडीए)से):
- डब्ल्यूएस और नमूने के बीच एसएफलिम और ईएफआरटी मूल्यों की तुलना करें।
- डब्ल्यूएस और नमूने के बीच एक सजातीय आजीवन कमी से जुड़े एक सकारात्मक ईFRET पर विचार करें एक FRET घटना के रूप में विश्लेषण किया जाएगा (प्रतिनिधि परिणाम देखें और Spriet एट अल.12 और टेरीन एट अल10 विवरण के लिए) द्वारा काम करता है।
- एक जीवन भर की कमी पर विचार अलग ढंग से वितरित करने के लिए FRET और lignin कॉम्पैक्टेशन स्तर के मिश्रण के कारण हो और आणविक बातचीत के रूप में व्याख्या नहीं है ।
- मापने योग्य FRET संकेत की अनुपस्थिति के रूप में कोई आजीवन संशोधन पर विचार करें, लेकिन लिग्निन के साथ बातचीत की कमी के रूप में नहीं
Representative Results
लिग्निन और फ्लोरोसेंटी टैग किए गए अणुओं के बीच आणविक बातचीत को विच्छेदन करने के लिए sFLIM क्षमता प्रदर्शित करने के लिए, हमने पहले तीन अलग-अलग नमूनों का उपयोग किया(चित्रा 3):देशी गेहूं भूसे (WS), देशी गेहूं के भूसे को रोडामिन (PR10) के साथ टैग किए गए खूंटी के साथ इनक्यूबेटकिया गया, और रोडामिन (DR10) के साथ टैग किए गए dextran के साथ देशी गेहूं भूसे। PR10 को लिग्निन के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है जबकि DR10 को निष्क्रिय13,14,15माना जाता है । sFLIM घटता(चित्रा 3,शीर्ष) कुछ संशोधनों कि संदर्भ नमूना (WS) और दो बातचीत के मामलों (DR10 और PR10) के बीच प्राप्त किया जा सकता है दिखाते हैं । दरअसल, एक पहले आसानी से रोडामिन उत्सर्जन रेंज के अनुरूप स्पेक्ट्रल क्षेत्रों में फ्लोरेसेंस वृद्धि नोटिस कर सकते हैं । तीन पहले चैनल फोटॉन क्षय घटता के सावधान अवलोकन भी PR10 के लिए की तुलना में DR10 के लिए एक मजबूत मोड़ से पता चलता है । फोटॉन क्षय घटता फिटिंग और प्रत्येक चैनल की गणना के बाद फ्लोरेसेंस जीवनकाल का मतलब है, FRET हस्ताक्षर अधिक स्पष्ट हो जाता है(चित्रा 3,नीचे) । दरअसल, जबकि फ्लोरेसेंस लाइफटाइम वैकल्पिक रूप से डब्ल्यूएस नमूने के लिए फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम के साथ बढ़ता और घटता है, एक स्पष्ट FRET हस्ताक्षर दोनों PR10 और DR10 के साथ के लिए मनाया जाता है: 1) दाता में एक निरंतर जीवन भर का मूल्य केवल उत्सर्जन चैनल (3 पहले चैनल, नीले रंग में); और 2) उच्च आजीवन दाता फ्लोरोफोर के बढ़ते योगदान के अनुरूप स्पेक्ट्रल चैनल में एक बढ़ती फ्लोरेसेंस जीवनकाल।
एक बार स्पष्ट FRET निर्धारित किया गया है, लिग्निन फ्लोरेसेंस लाइफटाइम (चैनल 2) की तुलना WS (०.४७ ns), DR10 (०.४२ ns) और PR10 (०.३६ ns) के बीच आजीवन कमी की मात्रा की अनुमति देता है और इस तरह, लिग्निन और के बीच आणविक बातचीत का पता चलता है PR10 के लिए एक मजबूत आत्मीयता के साथ PR10 और DR10 दोनों।
विभिन्न बातचीत के स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस विधि की प्रासंगिकता को समझाने के लिए, हम तीन अन्य नमूनों का चयन करते हैं, इलाज संयंत्र के नमूनों पर एंजाइम पहुंच की नकल करते हैं: एसिड-इलाज डब्ल्यूएस (एडब्ल्यूएस), 5 केडीए और 20 केडीए (पीआर 5 और पीआर20) के दो विपरीत आणविक वजन के पीआर के संयोजन में। sFLIM हस्ताक्षर के सावधानीपूर्वक निरीक्षण के बाद, लिग्निन फ्लोरेसेंस लाइफटाइम निकाला जाता है(चित्रा 4)। जैसा कि पहले कहा गया है, लिग्निन फ्लोरेसेंस जीवनकाल को इसके पर्यावरण16,17से बदला जा सकता है। एसिड उपचार के बाद, एडब्ल्यूएस (0.28 एनएस) में फ्लोरेसेंस आजीवन उपाय डब्ल्यूएस (0.47 एनएस) के लिए पहले से मापा जाता है, जो आजीवन कमी की स्पष्ट व्याख्या के लिए एसएफआईएम प्रक्रिया की आवश्यकता और प्रत्येक परीक्षण स्थिति के लिए नकारात्मक नियंत्रण की आवश्यकता की पुष्टि करता है। जैसा कि उम्मीद थी, एडब्ल्यूएस में पीआर जोड़ते समय एक मजबूत जीवनकाल में कमी देखी जाती है, जबकि यह लिग्निन के साथ बातचीत करता है। इसके अलावा, बातचीत PR20 (0.16 ns) की तुलना में PR5 (0.14 एनएस) के साथ मजबूत है, जो उनके हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या माप (2.3 एनएम और पीआर 5 और पीआर 20 के लिए 4.8 एनएम, क्रमशः, विभिन्न स्ट्रिक बाधाओं को प्रेरित करता है और इस प्रकार लिग्निन के लिए पीआर 5 की उच्च पहुंच है।
दोनों प्रयोग एंजाइमों के साथ लिग्निन इंटरैक्शन का बारीक आकलन करने के लिए इस विधि की प्रासंगिकता को प्रदर्शित करते हैं, जो उनके आकार और पौधों के नमूनों पर पूर्व-उपचार पर निर्भर करता है।
चित्रा 1: नमूनों के विभिन्न तैयारी कदम। गेहूं के भूसे (डब्ल्यूएस)(ए)को पहले आकार(बी)में कम किया जाता है जो खूंटी माध्यम(सी)में एम्बेडेड होता है । ब्लॉक डिस्पोजेबल ब्लेड(डी)से लैस माइक्रोटोम का उपयोग करके काटा जाता है। धोने के बाद, परिणामस्वरूप वर्गों(ई)खूंटी या dextran टैग-rhodamine समाधान(एफ)में ऊष्मायन के लिए रखा जाता है । लेबल किए गए अनुभागों को एसएफलिम मापन(जी)के लिए रखा गया है। स्केल बार 2 सेमी(ए),1 सेमी(बी और सी),200 माइक्रोन(ई और जी)हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: स्पेक्ट्रल FRET-आधारित इंटरैक्शन माप न का पूरा कार्यप्रवाह। आंकड़ा स्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस तीव्रता और आजीवन माप के संयोजन सेटअप प्रस्तुत करता है । स्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया जाता है, और प्रत्येक स्पेक्ट्रल रेंज के लिए क्रमिक रूप से फ्लोरेसेंस जीवनकाल को एसएफआईआईएन डिटेक्टर के साथ मापा जाता है। फोटॉन क्षय घटता का विश्लेषण नमूना और ब्याज के अणुओं के बीच बातचीत के सटीक निर्धारण की अनुमति देता है। कलाकृतियों से बचने के लिए कैलिब्रेशन पर कार्रवाई करनी होगी। सबसे पहले, एसएफआईएम डिटेक्टर को स्पेक्ट्रैली कैलिब्रेटेड करने की आवश्यकता है और इसके वाद्य प्रतिक्रिया समारोह की जांच की जानी चाहिए। दूसरा, एक स्वीकारकर्ता अणु के अलावा से पहले प्रत्येक चैनल में फ्लोरेसेंस जीवनकाल निर्धारित करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए जटिल ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल को ठीक से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: प्रतिनिधि sFLIM माप। sFLIM घटता (शीर्ष पैनल) देशी गेहूं भूसे (WS) पर अधिग्रहीत किया गया, WS खूंटी के साथ टैग रोडामिन (WS + खूंटी) और देशी गेहूं भूसे के साथ रोडामिन (WS + DEX) के साथ टैग किया गया । प्रत्येक नमूने के लिए, sFLIM घटता एक द्वि-घातीय क्षय मॉडल के साथ फिट किया गया था और मतलब फ्लोरेसेंस जीवनकाल प्रत्येक चैनल (नीचे पैनल) के लिए गणना की गई थी । डब्ल्यूएस + खूंटी और डब्ल्यूएस + डेक्स नमूने ऑटोफ्लोरेसेंस और रोडामिन के मिश्रित उत्सर्जन के अनुरूप चैनल में आजीवन वृद्धि के साथ जुड़े केवल (तीन पहले बार) ऑटोफ्लोरेसेंस के अनुरूप चैनल में फ्लोरेसेंस जीवनकाल में कमी पेश करते हैं। यह व्यवहार लिग्निन और रोडामिन-टैग किए गए अणुओं के बीच एक एफआरटी घटना की विशेषता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: लिग्निन ऑटोफ्लोरेसेंस के अनुरूप चैनल का फ्लोरेसेंस लाइफटाइम विश्लेषण। SFLIM हस्ताक्षर के आधार पर एक FRET घटना को मान्य करने के बाद, मतलब फ्लोरेसेंस लाइफटाइम एसिड-इलाज डब्ल्यूएस (एडब्ल्यूएस) पर मापा गया था, PR5 या PR20 (5 kDa और 20 केडीए, क्रमशः) के साथ संयोजन में । जबकि दोनों पीआर नमूने एक जीवन भर की कमी मौजूद है, छोटे एक मजबूत जीवन भर में कमी की विशेषता है, लिग्निन के साथ एक मजबूत आणविक बातचीत का खुलासा । विधि इस प्रकार दोनों के बीच भेदभाव करने के लिए काफी संवेदनशील है (मतलब मूल्य और मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, n>10 प्रति शर्त) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
कॉर्परेज़ फ्लोरेसेंस लाइफटाइम और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम माप दोनों तरीकों के फायदे को मिलाने की अनुमति देता है। दरअसल, अकेले स्पेक्ट्रल माप न होने से संवेदनशीलता की कमी होती है और गुणात्मक बने रहते हैं । दूसरी ओर, फ्लोरेसेंस लाइफटाइम पारंपरिक मात्रात्मक एफआरटी मापन के लिए पसंद की विधि है, लेकिन यह प्रदर्शित किया गया था कि लिग्निन ऑटोफ्लोरेसेंस लिग्निन संरचना और पर्यावरण16के आधार पर भिन्न हो सकता है। इस प्रकार, एक स्वीकारकर्ता या लिग्निन संरचनात्मक परिवर्तनों के साथ लिग्निन बातचीत में भेदभाव नहीं किया जा सकता है क्योंकि वे दोनों जीवन भर कम हो जाते हैं। जैसा कि प्रदर्शन किया गया है, विकसित विधि पौधों के वर्गों में लिग्निन और स्वीकारकर्ता अणुओं के बीच बातचीत की स्पष्ट, संवेदनशील और मात्रात्मक माप प्रदान करती है। यहां तक कि अगर विधि के विभिन्न चरणों को कड़ाई से अनुकूलित किया गया था, तो निम्नलिखित बिंदुओं के लिए विशेष रूप से सावधानी बरती जानी चाहिए।
नमूनों के बारे में, संयंत्र अनुभाग की गुणवत्ता में ध्यान केंद्रित इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । खूंटी एम्बेडिंग के लिए अलग कदम कड़ाई से पालन किया जाना चाहिए। अंतिम वाशिंग कदम के नमूनों में शेष खूंटी से कोई हस्तक्षेप सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, बफर एकाग्रता और पीएच को सभी मापों के लिए कड़ाई से समान रखा जाना चाहिए क्योंकि किसी भी परिवर्तन का फ्लोरेसेंस गुणों पर मजबूत प्रभाव पड़ सकता है।
लाइफटाइम मेजरमेंट भी नाजुक हो सकता है। दाता के फ्लोरेसेंस जीवनकाल अस्थिर हो सकता है, उदाहरण के लिए एक उच्च उत्तेजना की वजह से । ऐसे में लेजर पावर और जूम ट्यूनिंग से इश्यू ठीक हो सकता है। टीसीएसपीसी मापन में कलाकृतियों का एक और प्रसिद्ध स्रोत फोटॉन पल्स पाइल-अप है। दरअसल, टीसीएसपीसी एक ही दो लेजर दालों के बीच उत्सर्जित दो फोटॉनों की गति को माप नहीं सकता है। जबकि पौधों के नमूने अत्यधिक संरचित होते हैं, फ्लोरेसेंस सजातीय नहीं होता है और एक छिपी हुई नाड़ी पाइअप प्रभाव का कारण बन सकता है। जबकि प्रति सेकंड फोटॉनों की संख्या 1% उत्तेजना सीमा से नीचे बनी हुई है, यह कुछ नमूना क्षेत्रों में अधिक हो सकती है। कोई pileup प्रयोगों को सुनिश्चित करने के लिए, एक अलग फोटॉन प्रवाह पर दाता फ्लोरेसेंस जीवनकाल को मापने पर विचार किया जा सकता है । यदि प्रवाह कम होने पर जीवनकाल बढ़ता है, तो एक पाइअप प्रभाव माप में फेरबदल कर रहा है। इष्टतम फोटॉन प्रवाह दाता के जीवनकाल स्थिरता के साथ पहुंच गया है।
sFLIM क्षय वक्र विश्लेषण के बारे में, हम यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक व्यक्तिवक्र फिट पर निर्भर करने की सलाह देते हैं कि मॉडल माप का सही वर्णन करता है। यदि यह मामला नहीं है, तो पहले यह सुनिश्चित करें कि पहले उल्लिखित कलाकृतियों में से किसी ने भी डेटा को भ्रष्ट नहीं किया है। फिर, चरण 2.1.4 सिस्टम का इंस्ट्रूमेंटल रिस्पांस फंक्शन (आईआरएफ) प्रदान करता है। यदि आईआरएफ कुछ विसंगतियों को प्रस्तुत करता है, तो उन्हें कम करने के लिए ऑप्टिकल पथ का अनुकूलन करें। चरण 6.2 के दौरान फिटिंग के लिए एक मापा आईआरएफ भी इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, स्वतंत्रता के फिटिंग मॉडल की डिग्री चरण ६.२ में एक तीन घातीय क्षय करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । हालांकि, व्यक्तिगत जीवनकाल और अनुपात निर्धारण के लिए आवश्यक फोटॉनों की संख्या अधिक है और इस प्रकार केवल चरण 6.4 से अधिक स्थिर औसत जीवनकाल प्राप्त करने के लिए उनका उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। FLIM पर अधिक संपूर्ण जानकारी, इसके लक्षण वर्णन18,sFLIM और उसके आवेदन12 विशेष रूप से लिग्निन10के लिए, साहित्य में पाया जा सकता है ।
हालांकि चुनौतीपूर्ण, देशी ऑटोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके पौधों के ऊतकों में FRET माप कुछ फायदे दिखाता है। जीवित ऊतकों पर किए गए FRET माप की तुलना में, जिसमें जैव अणुओं के बीच बातचीत अध्ययन अक्सर आंतरिक फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक इंजीनियरिंग की आवश्यकता होती है, यहां प्रस्तुत लोगों के रूप में लिग्निफाइड पौधे के ऊतकों, प्राकृतिक प्रदान करते हैं ऑटोफ्लोरेसेंस, और बाह्य साथी फ्लोरोसेंट जांच आसानी से जोड़ा जा सकता है, जिससे अधिक समय की बचत होती है। हालांकि, विश्लेषण किए गए पौधों की प्रजातियों के आधार पर और किए गए संभावित पूर्व-उपचारों के आधार पर, ऑटोफ्लोरेसेंस को संशोधित किए जाने की संभावना है, ताकि इसे सावधानीपूर्वक विशेषता और फ्लोरोफोर की आवश्यकता हो क्योंकि जांच को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
एसएफआईएम विधि उत्प्रेरक गतिविधि (खूंटी और dextran) की कमी फ्लोरोसेंट जांच के लिए लागू किया जाना चाहिए। पौधे लिग्नोसेल्यूलोस हाइड्रोलिसिस के फ्रेम में, विभिन्न बायोमास नमूनों में एंजाइमों की बातचीत की जा सकती है, संभवतः बातचीत की ताकत पर स्थानीयकरण (कोशिकाओं और ऊतकों) के प्रभाव का निर्धारण किया जा सकता है। अगला अनुकूलन कदम विश्लेषण चरण का स्वचालन होगा। दरअसल, पर्याप्त विश्लेषण डेटा के साथ, एक मशीन लर्निंग आधारित विश्लेषण प्रक्रिया स्वचालित फेनोटाइप विश्लेषण के लिए तैनात किया जा सकता है, जो तेजी से एंजाइम-बायोमास दक्षता स्क्रीनिंग के लिए अपनी amenability में वृद्धि होगी । इसके अलावा, एसएफआईआईम को नमूने के निर्धारण की आवश्यकता नहीं है और इसे आसानी से गतिशील एंजाइम-लिग्निन इंटरैक्शन अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है। इस तरह की अनूठी विधि से लिगनोसेल्यूलोस वीरता को अनुकूलित करने के लिए एंजाइम इंजीनियरिंग रणनीति और बायोमास प्री-ट्रीटमेंट का मार्गदर्शन करने की संभावना है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
आंकड़ों की तैयारी के लिए फैनी लॉरेंट (किराया) का गर्मजोशी से शुक्रिया अदा किया जाता है । अनुसंधान महासंघ FRABio (लील विश्वविद्यालय, CNRS) तकनीकी इस काम को प्राप्त करने के लिए अनुकूल वातावरण प्रदान करने के लिए स्वीकार किया है । धन फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (LIGNOPROG परियोजना ANR-14-CE05-0026) से प्राप्त किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
| fine brush | to collect sections | ||
| glass vials | for incubations | ||
| high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
| Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
| Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
| Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
| Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
| microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
| mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
| mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
| mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
| nail polish | for mounting | ||
| pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
| poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
| razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
| rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
| sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
| sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
| sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
| tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |
References
- Inouye, H., et al. Multiscale deconstruction of molecular architecture in corn stover. Scientific Reports. 4, 3756 (2014).
- Li, X., Zheng, Y. Lignin-enzyme interaction: Mechanism, mitigation approach, modeling, and research prospects. Biotechnology Advances. 35 (4), 466-489 (2017).
- Vogel, J. Unique aspects of the grass cell wall. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 301-307 (2008).
- Lynd, L. R. The grand challenge of cellulosic biofuels. Nature Biotechnology. 35, 912 (2017).
- Clegg, R. M.
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Pietraszewska-Bogiel, A., Gadella, T. W. J. FRET microscopy: from principle to routine technology in cell biology. Journal of Microscopy. 241 (2), 111-118 (2011).
- Herbaut, M., et al. Multimodal analysis of pretreated biomass species highlights generic markers of lignocellulose recalcitrance. Biotechnology for Biofuels. 11, 52 (2018).
- Chabbert, B., et al. Fluorescence techniques can reveal cell wall organization and predict saccharification in pretreated wood biomass. Industrial Crops and Products. 123, 84-92 (2018).
- Terryn, C., Paës, G., Spriet, C. FRET-SLiM on native autofluorescence: a fast and reliable method to study interactions between fluorescent probes and lignin in plant cell wall. Plant Methods. 14 (1), 74 (2018).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry. Kohen, E. , Academic Press. 99-117 (1989).
- Spriet, C., et al. Correlated fluorescence lifetime and spectral measurements in living cells. Microscopy Research and Technique. 70 (2), 85-94 (2007).
- Donaldson, L. A., Newman, R. H., Vaidya, A. Nanoscale interactions of polyethylene glycol with thermo-mechanically pre-treated Pinus radiata biofuel substrate. Biotechnology and Bioengineering. 111 (4), 719-725 (2014).
- Herbaut, M., Zoghlami, A., Paës, G. Dynamical assessment of fluorescent probes mobility in poplar cell walls reveals nanopores govern saccharification. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 271 (2018).
- Paës, G., Chabbert, B. Characterization of arabinoxylan / cellulose nanocrystals gels to investigate fluorescent probes mobility in bio-inspired models of plant secondary cell wall. Biomacromolecules. 13, 206-214 (2012).
- Donaldson, L. A., Radotic, K. Fluorescence lifetime imaging of lignin autofluorescence in normal and compression wood. Journal of Microscopy. 251 (2), 178-187 (2013).
- Auxenfans, T., Terryn, C., Paës, G. Seeing biomass recalcitrance through fluorescence. Scientific Reports. 7, 8838 (2017).
- Waharte, F., Spriet, C., Héliot, L. Setup and characterization of a multiphoton FLIM instrument for protein-protein interaction measurements in living cells. Cytometry A. 4, 299-306 (2016).
