Summary
يصف هذا البروتوكول الاعداد الأصلي الذي يجمع بين قياسات مدي الحياة الطيفية والفلورية لتقييم نقل الطاقة بالرنين فورستر (الحنق) بين المجسات الفلورية القائمة علي الرورامين والليغنين البوليمر مباشره في الأقسام النباتية السميكة.
Abstract
في الكتلة الحيوية ليغنوسيلولوسيك (LB), نشاط الانزيمات محدود بظهور تفاعلات غير محدده مع اللينين اثناء عمليه التحلل المائي, الذي يحافظ علي الانزيمات بعيدا عن الركيزة الخاصة بهم. التالي فان توصيف هذه التفاعلات المعقدة يشكل تحديا في ركائز معقده مثل LB. يقيس الأسلوب هنا التفاعلات الجزيئية بين الجزيئات الموسومة بالفلور والليغنين الفلورية الاصليه ، ليتم الكشف عنها بواسطة نقل الطاقة بالرنين فورستر (الحنق). وخلافا لقياسات التاكل في الخلايا الحية باستخدام اثنين من الفلوروبيورس الخارجية ، وقياسات التاكل في النباتات باستخدام الليبين ليست تافه بسبب الفلورية المعقدة. لقد قمنا بتطوير خط أنابيب الاستحواذ والتحليل الأصلي مع ملاحظه مترابطة من اثنين من الخصائص التكميلية للفلوري: الانبعاثات الفلورية ومدي الحياة. يوفر sFLIM (المجهر التصوير مدي الحياة الطيفية والفلورسنت) القياس الكمي لهذه التفاعلات مع حساسية عاليه ، والكشف عن مستويات التفاعل المختلفة بين الجزيئات الحيوية والليغنان.
Introduction
التحلل الحراري للقشور السكرية في السكريات الاحاديه مثل الجلوكوز يتطلب الانزيمات. ومن المعروف ان نشاطهم مقيد بإنشاء تفاعلات غير محدده بين الانزيمات والليغولين1،2، وهذا الأخير هو البوليمر مسعور والمكونة الرئيسية لليغنوسيلولوسي3. التالي ، فان القياس الكمي لهذه التفاعلات مباشره علي النطاق الخلوي يشكل تحديا يجب التصدي له لتحسين النشاط الحفاز الانزيمي والمعالجة المسبقة لليغنوسيلولوسي4.
فورستر (أو فلوري) قياس نقل الطاقة بالرنين (الحنق) هو وسيله للاختيار لتقويم التفاعل الجزيئات الحيوية في الموقع. ويمكن ان يحدث هذا النقل غير الإشعاعي للطاقة بين المتبرع والفلوريد المتقبل إذا كانت تستوفي شروطا مختلفه. المانحة أذاعه طيف ينبغي تداخلت, علي الأقل جزئيا, المتقبلات أثاره طيف. التالي فان اختيار الفلوروبيورس حاسم لمثل هذه التجارب. ثم ، تنخفض كفاءه النقل مع القوه السادسة من المسافة5 ويحدث فقط إذا كانت كل الجزيئات في منطقه قريبه (عاده في نطاق نانومتر). ويمكن للطوارئ الأخرى ان تغير كفاءه النقل ، مثل الاتجاه ثنائي القطب والثنائي القطب ، ولكن يتم تخفيفها إذا كانت الفلور الفلورية تتمتع بالمرونة.
ويمكن قياس التاكل عن طريق تقنيات مختلفه ويمكن الاطلاع علي أوصاف مفصله في الأدب6،7. وباختصار ، تعتمد الطرق الرئيسية علي: ' 1 ' الانبعاثات الواعية التي يتبع فيها التباين في مضان الانبعاثات المتقبلة ويوفر نتائج نوعيه أساسا ؛ ' 2 ' الرشح الضوئي الذي يقاس فيه مضان انبعاثات المتبرع قبل وبعد النض الضوئي المتقبل (في هذه الحالة ، يمكن تحقيق تقديرات أكثر دقه لل "ولكنها تتطلب قوه ليزر قويه مطبقه علي العينات الثابتة) ؛ والثالث) قياس مدي الحياة التي تنخفض للمانح في وجود متقبل. هذا الأسلوب يتطلب أدوات محدده ويسمح قياسات التفاعل الدقيقة والحساسة بين الفلوروبيورس. النظر إلى قياس الحنق بين المجسات الفلورية والليغنوسيلوللوز ، فان الصعوبة الرئيسية هي ان اللينوكريبوللوز ليست فلوكوفيري واحده تتميز بشكل جيد: فهي تحتوي علي الفلورية الاصليه القوية والطيفية ، والتي تنبع أساسا من اللينوسين ، وتعتمدعلي أنواع الكتلة ال
في هذه الورقة ، نقترح اجراء جديد والأصلي تكييفها لأجزاء من الخشب/عينات النباتات. هذه الطريقة القائمة علي sFLIM يفتح الطريق إلى قياسات التاكل الكمية بين مجسات الفلورسنت والليغولين في عينات اللينوكولوللوز الاصليه.
Protocol
1. اعداد العينة
ملاحظه: يتم وصف الخطوات المتتابعة لاعداد العينات في الشكل 1.
- اعداد عينه المعمل
- من جذوع الخشب أو شظايا ، وقطع عينات طويلة 1 سم مع شفرات الحلاقة دون الاضرار بنيتها.
- تضمين العينات في البولي إيثيلين غليكول (PEG) المتوسطة ، من خلال غمس لهم في الحلول المتعاقبة لزيادة تركيز PEG المخفف في الماء حتى تصل إلى 100 ٪ PEG.
- وضع عينه تحت فراغ لأزاله المياه.
- يحرك العينات برفق في 30% v/v PEG لمده 24 ساعة.
- يحرك العينات برفق في 50% v/v PEG لمده 24 ساعة.
- يحرك العينات برفق في 100 ٪ PEG ل 24 ساعة في 70 درجه مئوية (PEG النقي هو صلب في درجه حرارة الغرفة).
- ضع عينات في كبسولات في 70 درجه مئوية (علي صفيحه ساخنه) وخفض درجه الحرارة تدريجيا حتى تصل إلى درجه حرارة الغرفة.
- اعداد بعناية 30-60 ميكرومتر سماكه المقاطع المسطحة من هذه الكتل PEG باستخدام شفرات ميكروتومي والمستهلكة.
- جمع وغسل المقاطع في ثلاثه حمامات متتالية من الماء لمده 5 دقائق لأزاله PEG من الأقسام.
- تحضير المسبار الفلوري
- اعداد حل العازلة من الفوسفات 30 مم في 6.0 pH.
- تزن الوتد rhand ديديكسان رونامامين المسبار مسحوق.
- تذوب مسحوق المسبار في المخزن المؤقت مع التحريك المستمر في قارورة زجاجيه لمده 1 ساعة في الظلام عند تركيز نهائي من 0.1 g/L.
- مصنع تلطيخ عينه
- احتضان أقسام مع 500 μL من المسبار الفلورسنت (انظر 1.2.3) ل 72 h (لا أثاره) في أنبوب من البلاستيك (لا يزيد عن 3 أقسام لكل أنبوب) في الظلام.
- البيك أب قسم مع فرشاه ، كثف العازلة مع ورقه نظيفه (تجنب تجفيف القسم) ، ومن ثم تحميل المقاطع المحتضنة بين زجاج الغطاء وال#1.5H coverslip.
2. عمر مضان ومعايره نظام القياس الطيفي
ملاحظه: يتم عرض سير العمل الكامل للقياس sFLIM في الشكل 2.
- تحديد عرض النافذة الطيفية للكشف sFLIM.
- وضع بلورات اليوريا في مربع الثقافة مع أسفل الزجاج 0.17 μm.
- ضع مربع الثقافة علي حامل عينه المجهر وحدد الهدف 20x.
- حدد Ti: Sa الليزر مع الطول الموجي 900 nm و 2 ٪ السلطة ، وتشغيل المسح الضوئي.
- جمع الاشاره التوافقية الثانية علي كاشف sFLIM.
ملاحظه: تنبعث الاشاره التوافقية الثانية في الطول الموجي بالبالضبط نصف الاثاره من 450 نانومتر; بينما لحظيه ، يوفر هذا الاجراء أيضا وظيفة الاستجابة الفعالة للنظام. - ضبط الطول الموجي الليزر الاثاره تدريجيا من 900 إلى 980 نانومتر حتى يتم جمع الاشاره التوافقية الثانية في القناة الطيفية الثانية (462.5 nm).
- تحديد طول الإطار الطيفي (12.5 نانومتر).
- إذا كان النطاق الطيفي يختلف عن ما هو متوقع ، استكشاف الأخطاء وإصلاحها عن طريق القيام بما يلي.
- ضبط الليزر إلى 910 نانومتر.
- نقل موقف صريف مع عجله التمرير لقياس الاشاره التوافقية الثانية علي القناة الاولي فقط (حدود القناة الاولي).
- ضبط الليزر إلى 935 نانومتر.
- نقل موقف صريف مع عجله التمرير لقياس الاشاره التوافقية الثانية علي القناة الاولي فقط (الحدود القناة الثانية).
- معايره قنوات مطياف العامة
- ادراج المراه علي مرحله المجهر.
- حدد الليزر المستمر مرئية (458 nm ، 1 ٪ الطاقة).
- جمع اشاره انعكاس علي كاشف sFLIM ومعرفه ما إذا كان يتم قياس الفوتونات في القناة الطيفية المناسبة.
- كرر الخطوة 2-2-2 و 2-2-3 مع جميع الليزر المستمر المتاحة (514 nm ، 561 nm و 633 nm).
- إذا كانت القناة الطيفية تختلف عن ما هو متوقع ، حرك موضع صريف مع عجله التمرير وكرر الخطوات 2.1 و 2.2.
3. نموذج التوصيف الفلوري
- في مقياس الطيف مجهزه حامل الفيلم التبعي (علي سبيل المثال ، Jasco FP-8500 الصك) ، وضع عينه القسم النباتي (لا حضن مع مسبار الفلورسنت).
- قياس الانبعاثات الفلورية عاده علي مدي 300-600 nm في حين مثيره العينة عاده علي مدي 250-550 nm.
- ارسم كثافة الفلورية مقابل الاثاره والانبعاثات الموجية لرسم خريطة فلورية ثلاثية الابعاد.
- تحديد الحد الأقصى الاثاره/منطقه الانبعاثات من المؤامرة.
4. قياس التاكل الطيفي
- معايره الفلورية التلقائية
- حدد الهدف 20x (NA: 0.8).
- تعيين الاثاره الليزر اثنين فوتون في 750 نانومتر.
- وضع قش القمح (WS) وحده قسم النبات بين الشريحة والشفة.
- تطبيق المعلمات التالية في البرنامج. التبديل إلى وضع لأمدا. حدد الكاشف الطيفي ChS مع قرار 9.7 nm. حدد النطاق الطيفي بين 420 إلى 722 نانومتر.
- الحصول علي الصورة.
- تحديد ذروه الانبعاثات المانحة (470 نانومتر مع هذا الاعداد).
- معايره متقبل
- ضع التحقيقات الفلورية القائمة علي الروراامين في مربع الثقافة مع أسفل الزجاج 0.17 μm.
- الحصول علي الصورة مع نفس الاعداد.
- تحديد الذروة الانبعاثات متقبل (570 nm مع هذا الاعداد).
- تحديد النطاق الطيفي مع الحد الأقصى "WS وحدها" اشاره ولا اشاره متقبل كالانبعاثات المانحة فقط لقياسات sFLIM (460-490 nm مع هذا الاعداد).
- قياس العينة
- وضع قسم النبات الملون بين الشريحة والشفة.
- الحصول علي الصورة مع نفس الاعداد.
- حفظ ملف lsm.
- الاقتران نوعيا حدث الحنق قويه مع انخفاض في ذروه انبعاثات المانحين مقارنه "عينه WS وحدها" وزيادة في الذروة الانبعاثات متقبل مقارنه مع عينه رونامين.
5. قياسات sFLIM
ملاحظه: بالنسبة للاعداد sFLIM النظام المستخدم هو المجال الزمني sFLIM الاعداد كما هو موضح سابقا10. ويمكن استخدام المجهر تستقيم ومختلف الوقت المرتبطة بطاقات العد فوتون واحد والشركات المصنعة المجهر البؤري وينبغي تكييف البروتوكول وفقا لذلك.
- قم بتبديل النظام إلى وضع sFLIM.
- تعيين المجهر البؤري علي النحو الموصوف في 4-1-1 و 4-1-2.
- التبديل إلى وضع غير المعلبة في البرنامج لإرسال الفوتونات الفلورسنت إلى كاشف sFLIM.
- تعيين الاستحواذ sFLIM إلى وضع تمكين للسماح الفوتون العد علي SPC150.
- حدد مجموعه الوقت 30 ق علي SPC150.
- تحقق من ان العقود مقابل الفروقات بين 1 × 105 و 1 × 106.
تحذير: تاكد من ان عدد الفوتونات المقيسة علي بطاقة TCSPC هو دائما اقل من 1 ٪ من تردد الاثاره الليزر (في هذا الاعداد ، تردد الاثاره الليزر هو 80 ميغاهيرتز ومعدل الكشف لا يمكن ان يتجاوز 800 كيلوهرتز في اي بكسل لتجنب كومه يصل تاثير11).
- ضع قسم "WS وحدها" بين الشريحة والمقطع المختلط.
- تعيين البرنامج إلى الوضع المستمر للسماح للمسح الضوئي بالليزر.
- اختر منطقه القياس علي العينة.
- انقر فوق أبدا علي SPC150.
- حفظ ملف الخرطوم.
- كرر العملية للحصول علي 10 عينات علي الأقل لكل حاله.
- وضع قسم النبات الملون بين الشريحة والشفة.
- كرر الخطوات 5.2.5.
6. تحليل sFLIM
- حدد ملف بيانات sFLIM المكتسبة علي "WS وحدها" واستيرادها إلى برنامج SPCImage باستخدام ملف | استيراد.
- حدد المعلمات المناسبة.
- من الخيار | نموذج، حدد غير مكتملة متعددة نخمن: 12.5 ns.
- من الخيار | التفضيلات، حدد حساب الاستجابة الفعالة تلقائيا.
- من قائمه اللوحة الرئيسية اليمني ، حدد نموذج الاحتواء الاسي 2:
- لكل قناه ، تطبيق النموذج المناسب وحفظ المعلمات تناسب إلى جدول بيانات (1،2، t1، t2).
- للمقارنة بين القناات والتجارب ، احسب متوسط عمر الفلورية في جدول بيانات (Tm):
- احسب متوسط العمر لجميع العينات (10 علي الأقل) في جميع القناات.
- تحليل Tm علي القناات المانحة (من القناة 1 إلى 3:460-490 nm) وتحديد قناه مخصصه (القناة 2 المقابلة ل 467.5-480 nm) التي تظهر اعلي عدد الفوتون ويقابل الليبين الحد الأقصى للانبعاثات. يجب استخدام القيم من القناة 2 في الخطوة 6.7.
- حدد sFLIM البيانات المكتسبة الملف علي WS الملون واستيرادها إلى برنامج SPCImage.
- كرر الخطوات 6.1-6.4.
- حساب التاكل الكفاءة Eالحنق للمانح في قناه WS المختارة السابقة وحدها (رmD) ومن عينه النبات الملون (tmDA):
- قارن بين sFLIM و Eالحنق القيم بين WS والعينة.
- النظر ايجابيه Eالحنق المرتبطة بانخفاض مدي الحياة متجانسة بين WS والعينة ليتم تحليلها كحدث الحنق (انظر النتائج التمثيلية ويعمل من قبل Spriet et al.12 و terryn et al.10 للحصول علي التفاصيل).
- النظر في انخفاض مدي الحياة موزعه بشكل مختلف لتكون بسبب مزيج من الحنق ومستوي الضغط الليبين ولا تفسر التفاعلات الجزيئية.
- النظر في اي تعديل مدي الحياة كغياب اشاره الحنق القابلة للقياس ، ولكن ليس كعدم التفاعل مع اللينان
Representative Results
لإظهار القدرة sFLIM لتشريح التفاعلات الجزيئية بين اللينات والجزيئات فلوريسسينتلي الموسومة ، استخدمنا لأول مره ثلاث عينات مختلفه (الشكل 3): قش القمح الأصلي (WS) ، تبنت قش القمح الأصلي مع شماعة الموسومة مع رونامامين (PR10) ، والقش القمح الأصلي مع ديديكسان ومن المعروف PR10 للتفاعل مع اللينان في حين DR10 من المفترض ان تكون خاملة13,14,15. تظهر منحنيات sFLIM (الشكل 3، الأعلى) بعض التعديلات التي يمكن تحقيقها بين العينة المرجعية (WS) وحالتي التفاعل (DR10 و PR10). في الواقع ، يمكن للمرء ان يلاحظ أولا بسهوله زيادة الفلورية في المناطق الطيفية المقابلة لنطاق الانبعاثات رونامامين. المراقبة الدقيقة من الثلاثة الاولي قناه الفوتون تسوس منحنيات تكشف أيضا عن انقلاب اقوي ل DR10 من ل PR10. بعد تركيب منحنيات تسوس الفوتون وحساب كل قناه يعني عمر مضان ، يصبح التوقيع الحنق أكثر وضوحا (الشكل 3، أسفل). في الواقع ، في حين ان عمر مضان يزيد بدلا من ذلك والنقصان علي طول الطيف مضان للنموذج WS ، لوحظ توقيع الحنق واضحة لكل من PR10 و DR10 مع: 1) قيمه ثابته مدي الحياة في قناه الانبعاثات المانحة فقط (3 القناات الاولي ، باللون الأزرق) ؛ و 2) زيادة عمر الفلورية في القناة الطيفية المقابلة لزيادة مساهمه المتبرعين بالفلور عاليه العمر.
مره واحده وقد تم تحديد الحنق لا لبس فيها ، والمقارنة بين العمر الفلوري اللينان (القناة 2) يسمح التقدير الكمي لانخفاض مدي الحياة بين WS (0.47 ns) ، DR10 (0.42 ns) و PR10 (0.36 ns) ، التالي ، يكشف التفاعلات الجزيئية بين الليبين علي حد سواء PR10 و DR10 مع تقارب اقوي ل PR10.
لتوضيح اهميه هذه الطريقة لقياس مستويات التفاعل المختلفة ، نختار ثلاث عينات أخرى ، تحاكي امكانيه الوصول إلى الانزيمات علي عينات النباتات المعالجة: WS المعالجة بالحمض (اوس) ، بالاقتران مع العلاقات العامة للوزنين الجزيئيين المتناقضين لخمسه كيلو ده و 20 ده (PR5 و PR20) بعد الفحص الدقيق للتوقيعات sFLIM ، يتم استخراج العمر الفلوري اللينان (الشكل 4). كما ذكر سابقا ، يمكن تغيير العمر الفلوري اللينان ببيئته16،17. بعد العلاج الحمضي ، والتدابير عمر مضان في اوس (0.28 ns) يصبح اقل مما كان يقاس سابقا ل WS (0.47 ns) ، والذي يؤكد علي متطلبات الاجراء sFLIM لتفسير لا لبس فيه من انخفاض مدي الحياة والحاجة إلى الضوابط السلبية لكل حاله اختبار. كما هو متوقع ، لوحظ انخفاض عمري قوي عند أضافه PR إلى اوس بينما يتفاعل مع اللينان. وعلاوة علي ذلك ، فان التفاعل اقوي مع PR5 (0.14 ns) بالمقارنة مع PR20 (0.16 ns) ، وهو ما يتسق مع قياس نصف قطرها الهيدروديناميكي (2.3 نانومتر و 4.8 نانومتر لPR5 و PR20 ، علي التوالي) ، مما ادي إلى قيود مختلفه فراغي التالي اعلي امكانيه الوصول من PR5 إلى اللجنان.
وتبين كلا التجربتين مدي ملاءمة هذه الطريقة لتقييم التفاعلات الليلينات بدقه مع الانزيمات ، اعتمادا علي حجمها وعلي عينات النباتات قبل المعالجة.
الشكل 1: خطوات اعداد مختلفه من العينات. يتم تخفيض قش القمح (WS) (A) لأول مره في الحجم (B) ليتم تضمينه في متوسط الربط (C). يتم قطع الكتلة باستخدام ميكروتومي مجهزه شفرات المتاح (D). بعد الغسيل ، يتم وضع المقاطع الناتجة (E) للحضانة في PEG أو ديكسديكان الموسومة-رونامامين الحل (F). يتم تركيب المقاطع الموسومة لقياسات sFLIM (G). قضبان المقياس هي 2 سم (A) ، 1 سم(B و C) ، 200 μm (E و G). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سير العمل الكامل لقياسات التفاعلات الطيفية القائمة علي التاكل. ويعرض الشكل الاعداد الجمع بين كثافة الفلورية الطيفية وقياسات مدي الحياة. يتم الحصول علي صور الفلورية الطيفية مع المجهر البؤري ، وتقاس اعمار الفلورية بالتتابع لكل نطاق طيفي مع كاشف sFLIM. تحليل منحنيات تسوس الفوتون يسمح تحديد دقيق للتفاعلات بين العينة وجزيئات الفائدة. ويجب معالجه المعايرة لتجنب المصنوعات اليدوية. أولا ، يحتاج كاشف sFLIM إلى معايره طيفيه ويجب فحص وظيفة الاستجابة الفعالة الخاصة به. ثانيا ، يجب ان تكون اشاره الفلورية المركبة معايره بدقه لكل عينه لتحديد عمر الفلورية في كل قناه قبل أضافه جزيء متقبل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: قياسات sFLIM التمثيلية. تم الحصول علي منحنيات sFLIM (اللوحة العليا) علي قش القمح الأصلي (WS) ، وحضنت WS مع ربط الموسومة مع رونامامين (WS + PEG) والقش القمح الأصلي مع ديكسكان الموسومة مع رونامامين (WS + DEX). بالنسبة لكل عينه ، تم تركيب منحنيات sFLIM مع نموذج اضمحلال ثنائي الاسي وتم حساب متوسط عمر الفلورية لكل قناه (لوحه سفليه). WS + الوتد وعينات WS + DEX تقدم انخفاضا في عمر الفلورية في القناة المقابلة الفلورية فقط (ثلاثه القضبان الاولي) المرتبطة بزيادة مدي الحياة في القناة المقابلة لانبعاثات مختلطة من الفلورية وروبامامين. هذا السلوك هو سمه من الحدث الحنق بين الجزيئات الليبين والرومين الموسومة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل مضان لمدي الحياة للقناه المقابلة للفلورية الليبين. بعد التحقق من صحة حدث "الحنق" استنادا إلى توقيع sFLIM ، تم قياس متوسط عمر الفلورية علي WS المعالجة بالحمض (اوس) ، بالاشتراك مع PR5 أو PR20 (5 ده كده و 20 كده ، علي التوالي). في حين ان كلا من عينات العلاقات العامة تقدم انخفاضا مدي الحياة ، ويتميز أصغر من خلال خفض مدي الحياة اقوي ، والكشف عن التفاعل الجزيئي اقوي مع اللينان. التالي فان الأسلوب حساس بما فيه الكفاية للتمييز بين الاثنين (يعني القيمة المتوسطة والخطا المعياري ، n > 10 لكل حاله). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وتسمح القياسات الطيفية لمدي الحياة والانبعاثات بالجمع بين مزايا كلا الأسلوبين. والواقع ان القياسات الطيفية وحدها تفتقر إلى الحساسية وتظل نوعيه. ومن ناحية أخرى ، فان عمر الفلورية هو الطريقة المفضلة لقياسات التاكل الكمية التقليدية ، ولكن ثبت ان الليبين التلقائي يمكن ان يختلف تبعا لتكوين اللينان والبيئة16. التالي ، لا يمكن التمييز بين التفاعلات الليلينان مع التغييرات الهيكلية المتقبلة أو الليقبين لأنهما يؤديان إلى انخفاض مدي الحياة. وكما هو موضح ، فان الطريقة المطورة توفر قياسا واضحا وحساسا وكميا للتفاعلات بين جزيئات الليبين والمتقبلين في الأقسام النباتية. حتى لو كانت الخطوات المختلفة للأسلوب الأمثل بصرامة ، يجب توخي الحذر بشكل خاص للنقاط التالية.
وفيما يتعلق بالعينات ، فان نوعيه قسم النبات أمر بالغ الاهميه لضمان التصوير في التركيز. يجب اتباع الخطوات المختلفة لتضمين PEG بدقه. خطوه الغسيل النهائية ضرورية لضمان عدم وجود تداخل من PEG المتبقية في العينات. وعلاوة علي ذلك ، يجب ان تبقي تركيز العازلة ودرجه الحموضة متطابقة تماما لجميع القياسات لان اي تغيير يمكن ان يكون لها تاثير قوي علي خصائص الفلورية.
قياس مدي الحياة يمكن أيضا ان تكون حساسة. العمر الفلوري للمتبرع يمكن ان يكون غير مستقر ، علي سبيل المثال بسبب أثاره عاليه. في مثل هذه الحالة ، وضبط قوه الليزر والتكبير يمكن إصلاح هذه المسالة. وثمة مصدر آخر معروف جيدا للقطع الاثريه في قياسات TCSPC هو تراكم نبض الفوتون. في الواقع ، TCSPC لا يمكن قياس سرعه اثنين من الفوتونات المنبعثة بين نفس النبضات الليزر اثنين. في حين ان العينات النباتية عاليه التنظيم ، فان الفلورية ليست متجانسة ويمكن ان تؤدي إلى تاثير النبض الخفي. في حين ان عدد الفوتونات في الثانية لا يزال دون حد الاثاره 1 ٪ ، فانه يمكن ان يكون اعلي في بعض المناطق عينه. ولضمان عدم اجراء تجارب الاختبار ، يمكن النظر في قياس مدي عمر المتبرع بالفلورية في تدفق فوتون مختلف. إذا زاد العمر اثناء انخفاض التدفق ، فان تاثير الاصطدام هو تغيير القياسات. يتم التوصل إلى تدفق الفوتون الأمثل مع استقرار المتبرع مدي الحياة.
وفيما يتعلق تحليل منحني تسوس sFLIM ، نوصي بالاعتماد علي كل منحني الفردية تناسب لضمان ان النموذج يصف بدقه القياسات. وإذا لم يكن الأمر كذلك ، فتاكد أولا من ان أيا من المصنوعات اليدوية المذكورة سابقا قد أفسد البيانات. وبعد ذلك ، توفر الخطوة 2-1-4 وظيفة الاستجابة الفعالة (IRF) الخاصة بالنظام. إذا كان IRF يعرض بعض الشذوذ ، وتحسين المسار البصري للتقليل منها. ويمكن أيضا ان تستخدم IRF قياس لتركيب خلال الخطوة 6.2. وأخيرا ، يمكن زيادة درجات النموذج المناسب للحرية إلى اضمحلال ثلاثي الاسي في الخطوة 6.2. ومع ذلك ، فان عدد الفوتونات المطلوبة لمده الحياة الفردية وتحديد نسبه عاليه التالي فمن المستحسن استخدامها فقط لتحقيق متوسط عمر أكثر استقرارا من الخطوة 6.4. أكثر شامله معلومة علي [فلم], توصيفه 18, [سفليم] وتطبيقه12 بشكل خاص إلى [ليغسن]10, يستطيع كنت أسست في الأدب.
علي الرغم من التحدي ، وقياس التاكل في الانسجه النباتية باستخدام الفلورية الاصليه يظهر بعض المزايا. بالمقارنة مع القياسات التي أجريت علي الانسجه الحية التي التفاعل الدراسات بين الجزيئات الحيوية في كثير من الأحيان تتطلب الهندسة الوراثية للتعبير عن علامات الفلورسنت المتاصله ، والانسجه النباتية ليغنيفيد مثل تلك المعروضة هنا ، تقدم الطبيعية ويمكن بسهوله أضافه الفلورية ، والشريك الخارجي تحقيقات الفلورسنت ، وتوفير الكثير من الوقت. ومع ذلك ، اعتمادا علي الأنواع النباتية تحليلها وعلي العلاجات المسبقة الممكنة التي نفذت ، من المرجح ان يتم تعديل الفلورية ، بحيث انه يحتاج إلى ان تتميز بعناية والفلورية المستخدمة كتحقيقات قد تحتاج إلى تكييفها.
يجب تطبيق الأسلوب sFLIM علي تحقيقات الفلورسنت التي تفتقر إلى النشاط الحفاز (PEG و ديكسان). في اطار التحلل المائي النباتي ، يمكن اجراء تفاعلات الانزيمات في عينات الكتلة الحيوية المختلفة ، مما قد يؤدي إلى تحديد تاثير التعريب (الخلايا والانسجه) علي قوه التفاعل. ستكون خطوه التحسين التالية أتمته خطوه التحليل. في الواقع ، مع البيانات التي تم تحليلها بما فيه الكفاية ، يمكن نشر اجراء تحليل قائم علي التعلم الألى للتحليل التلقائي للنمط الظاهري ، والذي من شانه ان يزيد من قدرته علي الفحص السريع لكفاءة الانزيم الكتلة الحيوية. وعلاوة علي ذلك ، لا يتطلب sFLIM تثبيت العينة ويمكن تطبيقها بسهوله علي الدراسات التفاعلية انزيم-ليغنان التفاعل. ومن المرجح ان هذه الطريقة الفريدة لتوجيه استراتيجية هندسه الانزيم والكتلة الحيوية المعالجة المسبقة لتحسين تثمين الليكوسيلوللوز.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وأعرب عن شكره الحار فاني لوران (اجره) لاعداد الأرقام. ويعترف بالاتحاد البحثي FRABio (جامعه ليل ، CNRS) لتوفير البيئة التقنية المفضية إلى تحقيق هذا العمل. وتم الحصول علي التمويل من وكاله البحوث الوطنية الفرنسية (مشروع LIGNOPROG ANR-CE05-0026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | ZEISS | LSM 710 NLO | for confocal imaging |
| fine brush | to collect sections | ||
| glass vials | for incubations | ||
| high precision microscope cover glasses 170+/-5µm n°1,5# | Marienfeld | 0107032 | saled by Dutscher s.a in France |
| Infra-red pulsed laser | COHERENT | CHAMELEON VISION | For sample excitation |
| Micropipette Research Plus monocanal 20-200µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
| Micropipette Research Plus monocanal 2-20µL | Eppendorf | with corresponding tips | |
| Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end | Thermo Fisher Scientific | LR45D | |
| microtome blades disposable (pack of 50) | Agar Scientific | T5024 | saled by Oxford Instruments in France |
| mPEG-Rhodamine, 10 kDa | Creative Peg Works | PSB-2263 | |
| mPEG-Rhodamine, 20 kDa | Creative Peg Works | PSB-22642 | |
| mPEG-Rhodamine, 5 kDa | Creative Peg Works | PSB-2264 | |
| nail polish | for mounting | ||
| pH meter five easy plus | Mettler toledo | FEP20 | with electrode |
| poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450 | Merck (sigma-Aldrich) | P5402-1kg | for sample embedding |
| razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100 | Agar Scientific | T586 | for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France |
| rotary microtome | Microm Microtech | HM 360 | |
| sFLim detector | BECKER-HICKL | SPC 150 | for lifetime acquisition |
| sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 71500 | for buffer solution |
| sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O | Merck (sigma-Aldrich) | 30435-1kg | for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg |
| tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da | Merck (sigma-Aldrich) | R8881-100mg |
References
- Inouye, H., et al. Multiscale deconstruction of molecular architecture in corn stover. Scientific Reports. 4, 3756 (2014).
- Li, X., Zheng, Y. Lignin-enzyme interaction: Mechanism, mitigation approach, modeling, and research prospects. Biotechnology Advances. 35 (4), 466-489 (2017).
- Vogel, J. Unique aspects of the grass cell wall. Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 301-307 (2008).
- Lynd, L. R. The grand challenge of cellulosic biofuels. Nature Biotechnology. 35, 912 (2017).
- Clegg, R. M.
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Pietraszewska-Bogiel, A., Gadella, T. W. J. FRET microscopy: from principle to routine technology in cell biology. Journal of Microscopy. 241 (2), 111-118 (2011).
- Herbaut, M., et al. Multimodal analysis of pretreated biomass species highlights generic markers of lignocellulose recalcitrance. Biotechnology for Biofuels. 11, 52 (2018).
- Chabbert, B., et al. Fluorescence techniques can reveal cell wall organization and predict saccharification in pretreated wood biomass. Industrial Crops and Products. 123, 84-92 (2018).
- Terryn, C., Paës, G., Spriet, C. FRET-SLiM on native autofluorescence: a fast and reliable method to study interactions between fluorescent probes and lignin in plant cell wall. Plant Methods. 14 (1), 74 (2018).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry. Kohen, E. , Academic Press. 99-117 (1989).
- Spriet, C., et al. Correlated fluorescence lifetime and spectral measurements in living cells. Microscopy Research and Technique. 70 (2), 85-94 (2007).
- Donaldson, L. A., Newman, R. H., Vaidya, A. Nanoscale interactions of polyethylene glycol with thermo-mechanically pre-treated Pinus radiata biofuel substrate. Biotechnology and Bioengineering. 111 (4), 719-725 (2014).
- Herbaut, M., Zoghlami, A., Paës, G. Dynamical assessment of fluorescent probes mobility in poplar cell walls reveals nanopores govern saccharification. Biotechnology for Biofuels. 11 (1), 271 (2018).
- Paës, G., Chabbert, B. Characterization of arabinoxylan / cellulose nanocrystals gels to investigate fluorescent probes mobility in bio-inspired models of plant secondary cell wall. Biomacromolecules. 13, 206-214 (2012).
- Donaldson, L. A., Radotic, K. Fluorescence lifetime imaging of lignin autofluorescence in normal and compression wood. Journal of Microscopy. 251 (2), 178-187 (2013).
- Auxenfans, T., Terryn, C., Paës, G. Seeing biomass recalcitrance through fluorescence. Scientific Reports. 7, 8838 (2017).
- Waharte, F., Spriet, C., Héliot, L. Setup and characterization of a multiphoton FLIM instrument for protein-protein interaction measurements in living cells. Cytometry A. 4, 299-306 (2016).
