Summary
この記事では、周囲質量分析に基づく独自のリアルタイム分析方法のサンプル調製方法を紹介します。この方法により、特別な前処理を行うことなく生体内の生体分子のリアルタイム分析を行うことができます。
Abstract
質量分析(MS)は、分子量や構造を推測するのに役立つ質量電荷比(m/z)など分子に関する非常に正確な情報を提供するため、分析化学において強力なツールです。それは本質的に破壊的な分析方法ですが、最近の周囲イオン化技術の進歩により、組織は完全性の面で比較的無傷の状態に置かれながらデータを取得することができました。プローブ電気スプレーイオン化(PESI)は、サンプルの複雑で時間のかかる前処理を必要としないため、いわゆる直接法です。細かい針は、サンプルピッカーだけでなく、イオン化エミッタとして機能します。プローブ先端の非常に鋭く微細な性質に基づいて、サンプルの破壊は最小限であり、その場で生き物からリアルタイムの分子情報を取得することができます。ここでは、生物医学の研究開発に役立つPESI-MS技術の3つの用途を紹介します。一つは、医学診断のためのこの技術の基本的なアプリケーションである固体組織への適用を含みます。この技術は、サンプルの10mgのみを必要とするので、ルーチン臨床設定において非常に有用であり得る。第二のアプリケーションは、人間の血清が測定される体外医療診断用です。また、従来の分析技術に十分な量のサンプルが提供できない様々な生物学的実験においても、流体試料を測定する能力は重要である。第3のアプリケーションは、特定の器官における代謝産物または薬物のリアルタイムダイナミクスを得ることができる生きている動物におけるプローブ針の直接適用に傾いている。各アプリケーションでは、MSによって検出された分子を推測したり、人工知能を使用して医学的診断を得ることができます。
Introduction
質量分析法(MS)は、還元主義の技術的実現である。これは、分子種やカスケードに基づいて解釈することができる単位に分析の対象を減少させます。従って、分析化学の代表的な方法である。イオン化、解析、検出、スペクトル集録の4つのプロセスで構成されています。分子のイオン化は質量分析の最初のプロセスであるため、一般的に処理される検体の形態を制限する。ほとんどのイオン化手順では、有機サンプルの構造、形態、およびリアルタイムの生物学的プロセスの破壊が必要です。例えば、エレクトロスプレーイオン化(ESI)MSは、サンプルが効率的なイオン化のために液体状態にあることを必要とする1。したがって、サンプルは、分子の組成を変化させる複雑な生化学的調製物を通過する必要があります。あるいは、マトリクス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)MSは薄い切片組織2,3の分子マップを再構築できるが、そのイオン化効率が低すぎてサンプル中のすべての分子を検出できない、特に脂肪酸の分析が不十分である。これらの制限を考慮すると、プローブエレクトロスプレーイオン化(PESI)4は、構造完全性5を破壊することなく、その生体系のリアルタイム変化を観察するために使用することができるが、観察されている生物は技術的に生きている状態にある。この場合、非常に細かい針が使用され、サンプルピッカーとイオンエミッタとして同時に機能します。これは、複雑なサンプル前処理配列をバイパスして、リビングシステムの分子成分をその場で反射する質量スペクトルを得ることができることを意味します。
PESI-MSに匹敵する他のいくつかの電イオン化方法があります。1つは急速な蒸発イオン化質量分析(REIMS)6です。この技術は、電気ナイフで組み立てられ、切開中に発生するイオンプルームを収集するため、手術中にうまく機能します。REIMSは手術に非常に有用であるが、それは本質的に組織の電気的なアブレーションを必要とする破壊的な方法である。したがって、分離サンプルまたは実験室での分析において、細胞および組織の詳細な分析には有用ではありません。さらに、組織の破片を含むプルームを大量に収集するため、使用後の装置のメンテナンスが長く必要となり、この機械の使用を特別な手術に限定します。同様の方法は、レーザー脱離イオン質量分析(LDI-MS)7と呼ばれ、非侵襲的で表面分析に有用なもう1つの技術である。この技術は試料の表面をスキャンするのが得意なので、MALDIイメージング質量分析8、9のような包括的な2次元解析を実現します。しかし、LDI-MSは表面分析にのみ適用可能であるため、PESI-MSは、例えば、組織内のサンプルを分析する上で有利である。もう一つの技術であるMasSpec Pen10は、甲状腺癌の診断において高い特異性および感受性を達成すると報告されたが、プローブの直径はmmのオーダーであり、表面分析に特異的であり、癌の小さな結節または深く局在化した病変を検出できないことを意味する。さらに、この方法はプローブペンに埋め込まれたマイクロキャピラリー流路を使用するので、LDI-MSと同様にクロスコンタミネーションを考慮する必要があります。他にも、フロープローブやイオン化形態スワブ11などの臨床現場に適用された技術が存在するが、それらは広く普及していない。
PESIはESIの極端な微細化であり、ナノエレクトロスプレーの毛細管は数百nmの先端湾曲半径を有する固体針上に収束する。イオン化は、テーラーコーンを形成することにより針先の極めて制限された領域で起こり、その上で試料は先端上のすべての流体のイオン化が完了するまで12に留まる。検体が金属針の先端にとどまっている場合、金属針と検体の間の界面で過剰な電荷が連続的に発生する。そのため、分子の逐次イオン化は、その表面活性に応じて生じる。このプロパティは、針先をクロマトグラムの一種にし、表面の活性に応じて検体を分離します。より技術的には、より強い表面活性を有する分子は、テイラーコーンの表面に来て、イオン化プロセスの終わりまで針の表面に付着する弱い表面活性を有するものよりも早くイオン化される。これにより、針によって拾われたすべての分子の完全なイオン化が達成される13。また、この技術は、試料に余分な溶媒を添加することを伴わないので、数百個のフェムトリットルは、さらに分析14のために十分な強さの質量スペクトルを得るのに十分である。これらの特性は、無傷の生物学的試料の分析に有利である。しかし、PESI-MSの大きな欠点は、ソーイングマシンと同様に、垂直軸に沿った針の往復運動のためにイオン化の不連続性にある。イオン化は、イオンオリフィスの高さが横軸上に揃っているときにプローブの先端が最も高い点に達した場合にのみ起こる。針がサンプルを拾っている間イオン化は止まるので、イオン化の安定性は従来のESIと等しくない。したがって、PESI-MSはプロテオミクスにとって理想的な方法ではありません。
これまで、PESI-MSは主に生体システムの分析に応用されており、基礎研究から臨床現場まで幅広い分野をカバーしています。例えば、手術中に調製されたヒト組織の直接分析により、腎細胞癌15および咽頭扁平上皮癌16の両方におけるトリアシルグリセロールの蓄積を明らかにすることができた。この方法はまた、血液などの液体試料を測定し、脂質プロファイルに焦点を当てることができる。例えば、いくつかの分子は、ウサギの食事の変化の間に線引きされています。これらの分子の一部は実験の非常に初期段階で減少し、臨床診断のためのこのシステムの高感度および有用性を示す17.さらに、生きている動物への直接適用は、断食5のちょうど一晩後に肝臓の生化学的変化の検出を可能にした。Zaitsu et al.18は、この実験5を再検討し、ほぼ同じ方法で肝臓の代謝プロファイルを分析し、その結果、当社の元の方法の安定性と再現性を強化した。さらに、この技術19を用いてマウスの非癌性肝を取り囲む癌組織を判別することができた。従って、これは、生体内とインビトロの両方の様々な設定で有用である汎用性の高い質量分析技術である。別の観点から、PESIモジュールは、取り付けアタッチメントを調整することによって、様々な質量分析計に適合させることができます。この短い記事では、生きている動物を使ったアプリケーションを含むアプリケーションの基礎と例 (図 1)を紹介します。
各国の規制や法律に従って、このプロトコルの一部は、各機関の基準を満たす必要があります。生物への応用は、生きている動物の組織や器官の生化学的または代謝的変化をその場所で提供することができるため、最も興味深く、困難です。この申請は山梨大学の動物ケア機関委員会によって承認されましたが、2013年5月には、動物実験の規制の最近の変更により、もう一度承認が必要になります。実験計画の幾つかの修正が推奨される。実験で得られた質量スペクトルに関しては、各測定間の質量スペクトルの変動を考慮して、ヌクレオチドシーケンシングコミュニティに共通するスペクトル情報共有システムはありません。特に針ホルダーから針を取り外す場合は、針の事故を避けるために、オペレータが針を取り扱う際には注意が必要です。針を取り外す特別な装置は、この目的のために非常に有用である。PESIモジュールのコンパートメントは気密、閉室、質量分析計が指示に従って作動した場合にイオンプルームの漏れは発生しない。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
山梨大学の動物ケア機関委員会は、ここに記載されているすべてのプロトコルと実験動物の使用を承認しました。人間のサンプル使用法は、山梨大学の倫理委員会によって承認されました。
1. 固形組織製剤
注:サンプルは、組織の鮮度を維持するために、動物や人体から取り出した後、氷の上に保管する必要があります。測定が解剖にすぐに続かない場合は、-80°Cで組織を保存することをお勧めします。彼らは組織から特定の内容物を抽出する可能性があるため、任意の種類のバッファーまたは生理液に組織を配置することはお勧めできません。アルデヒドで固定された組織、またはパラフィン/ワックスまたはクライオゲルに埋め込まれた組織は、MS測定には適していません。
- メスまたはナイフを使用して、組織標本を約2 x 2 x 2mmに切ります。あるいは、皮膚検査に使用するトレパン(使い捨ての生検パンチ、ボアサイズ3mm)でサンプルをパンチアウトします。この場合、柱の長さを 2 mm にトリムします。
注:この方法を使用して、任意の組織を分析することができます。この実験では、肝臓15及び腎臓19が、質量スペクトルを得るために解析に成功した。一般的に、パレンキマル器官は良好な質量スペクトルを与えるが、繊維状成分を有するものはそうではない。 - 組織が血液で汚染されている場合は、氷冷リン酸緩衝生理食塩水で短時間洗浄してください。
注:死後の組織損傷を最小限に抑えるには、できるだけ早く室温でこのステップを完了してください。測定が直ちに行われなかった場合は、液体窒素で組織を凍結し、-80°Cで保存します。 - 切り取ったサンプル(約10mg)をプラスチック製のマイクロチューブに入れ、50%エタノールの100μLを加えます。
注: このシステムで使用される質量分析では定量的なデータが提供されないため、サンプルの正確な重量は決定されません。約10mgは、パレンキマル組織に最適です。 - マイクロペストルを使用してサンプルを均質化します。
- ホモジネートを10 μL入れ、カートリッジのウェルに入れる(図2)。
- カートリッジを質量分析計のイオン化チャンバに入れ、サンプルイオン化に使用するステンレス製のニードルプローブを取り付けます(図2)。
メモ:プローブ針は製造元から供給されています。それらはステンレス鋼から成り、およそ400 nmの曲率半径を有する。 - チャンバーのふたをしっかりと閉じて、安全装置を自動的にアクティブにします。
- [開始]アイコンをクリックしてオンボードコンピュータを起動し、分析します。画面上のパネルを使用して、2.3 kVの電圧を針に印加してエレクトロスプレーを発生させ、針の周波数が3Hzであることを確認します。
- 測定が完了するまで 30 s 待ちます。
注: データ取得が完了すると、セッションは自動的に停止します。分析の質は総イオンクロマトグラム(TIC)によって監視される。測定時間は代表的な質量スペクトルを得るために定義され、短縮または延長することができる。 - 各サンプルを測定した後、バイオハザードの処分器にカートリッジと針を処分します。
注: 一度に測定できるサンプルは 1 つだけです。すべての測定の前に機械を校正する必要はありません。校正は、6ヶ月に1回、サプライヤーによる定期的な検診に依存します。 - 質量スペクトルを分析し、以下の手順に示すように質量分析計に関連付けられたソフトウェアを使用してマススペクトルテキストデータをエクスポートします(図3)。
- ソフトウェアのデータファイルブラウザウィンドウでLCDファイルをクリックします。
- マススペクトルウィンドウ上の単一のピークを選択してクリックすると、抽出されたイオンクロマトグラム(EIC)が自動的に表示されます。
- TIC と EIC を確認し、平均スペクトル アイコンをクリックして、マススペクトルを生成するための時間範囲ウィンドウを選択します。
注: この解析では、ターゲット分子が質量電荷比 (m/z) ウィンドウに表示されます (図 3)。さらに、針の動きの1ストローク当たりのイオン化の持続時間は非常に短いため、得られるすべての質量スペクトルは、本質的に10s(300スキャン)にわたってスペクトルを平均化する。 - さらに詳しい分析を行う場合は、[エクスポート]タブをクリックして、m/zおよびイオン強度を含むテキスト ファイルを生成します。このテキスト ファイルは、任意のフォルダーに格納できます。
注: RNA 防腐剤は、サンプルのネイティブスペクトルパターンに影響を与えます。さらに、液体(リン酸緩衝生理食塩)を使用せずに組織を取り扱い、保存することで、貯蔵中に組織から液体に分子成分が溶出するのを防ぐことをお勧めします。理想的には、何の処置もせずに新鮮または新鮮な凍結したサンプルが使用される。
2. 体液(血清)製剤
注:この手順全体は、固形組織に使用される手順とほぼ同じです。流体サンプル用のカートリッジは、製造元から入手できます。赤血球(RBC)による汚染は、目的成分(血漿または血清)のスペクトル取得の効率を大幅に低下させることができるので、測定前に遠心分離してすべてのRBCを除去してください。
- 血清サンプルを10μLとし、1.5mLマイクロチューブに入れます。
注:新鮮な血清および貯蔵された血清の両方が使用することができる。 - 1.5 mLのチューブに190μLの50%エタノールを加え、室温で2分間ボルテックスを加えます。
- 4 °Cで1~5分間、15,000 x gで液体を遠心分離します。
- 10 μLの上清をカートリッジのウェルに移します。
- カートリッジを機械のイオン化チャンバに入れ、サンプルイオン化に使用するステンレス製の針プローブを取り付けます(図2)。
- チャンバーのふたをしっかりと閉じて、安全装置を自動的にアクティブにします。
- [開始]アイコンをクリックしてオンボードコンピュータを起動し、イオン化します。
- 測定が完了したら、1.10に記載されているサンプルカートリッジと針を捨てます。
- 下記に示すように、得られたEICのセットを分析します(図3)。
- データブラウザでLCDファイルを開きます。
- 単一のピークをクリックして TIC と EIC を表示します。
- 平均スペクトルアイコンを使用して、質量スペクトルを生成するための時間範囲を選択します。
- モニタのエクスポートタブをクリックして、対応するピークのm/zとイオンの強度の両方を含む生成されたファイルをエクスポートします。
注:この手順は、唾液、尿、および他の体液にも適用することができます。
3. 生体内におけるペシ-MSの準備
注:このセクションでは、生きているマウスモデルで5-Fluoro-2'-デオキシウリジン(5-FdU)の代謝プロファイルを監視するアプリケーションが導入されています。全体を通して無菌状態を使用してください。
- 100 mM 5-FdU溶液の100 μLを2ヶ月齢マウスの尾静脈(約20g重量)に注入します。
注:性別、年齢、マウスの歪みのための好みはありません。このプロトコルは実験5を実施した時点で承認されましたが、この実験の実現可能性は、それが行われる国の倫理的制限に依存します。 - 承認された動物ケアプロトコルに従ってマウスを麻酔します。尾のピンチに対する応答の欠如によって麻酔の深さを評価する。
注:ペントバルビタールナトリウムの使用が動物実験のための倫理委員会によって許可されていない場合、ケタミン塩酸塩などの代替方法を使用することができます。 - 電気カミソリを使用して腹腔を剃り、目に獣医軟膏を適用します。
- 麻酔マウスを上向きの位置に置き、修理テープを使用して足をプラスチックプレートに固定します。70%アルコールのスクラブで手術部位を3回スクラブします。
- はさみを使って腹腔を切り開きます。まず、横隔膜の上から横(10mm)の皮膚を切ります。腹膜と腹膜(ca. 7 mm)の筋肉を横に切断し、肝臓表面を露出させるためにステンレス線を使用して創傷を開いたままにします。
注:肝臓の表面を浸透する必要はありません。 - プローブ針の先端を肝臓の表面に塗布します。針の深さを約0.5mmに調整してイオン化効率を最適化し、TICとスペクトルパターンを同時にチェックします。コントロールパネルの画面で高電圧を2.3kV、周波数を3Hzに設定します。
- プラスチック製のプレートから動物を取り出します。
- 外科的な腸の縫合糸を使用して創傷を縫合し、マウスをケージに戻す。それは胸骨の回復を維持するために意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。マウスが完全に回復するまで、他の動物の会社にマウスを返さない。
- EIC におけるイオン強度の時間経過と、EIC 描写の手順を1.11.1~1.11.4のように実行します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図3に示すように、PESI-MS法で得られるデータは質量スペクトルであり、このシステムではm/zの範囲は10から1,200です。m/z 2,000までの分子を検出できますが、m/z 1,200の質量範囲にわたってこの技術を使用して得られるピークはほとんどありませんでした。そこで、m/z 10~1,200のピークを分析しました。m/z 800 と 900 の周りにピークの目立つグループがありました。前者は、ホスファチジルコリン(PC)種のような細胞膜成分を表し、後者はトリアシルグリセロール(TAG)を表す。図4は、正常ヒト腎臓および腎細胞癌(RCC)からの質量スペクトルを示す。質量スペクトルは、プロトコル1で説明した直接組織法を用いて得られた。透明セル型RCCは細胞質にTAGを蓄積するため、m/z 900の周りのスペクトルのグループは非常に顕著です。図4の結果は、固体試料に対して図1に導入した抽出法により得られた。
疾患進行中に肝細胞癌の脂質代謝が変化するため20は、PESI-MSと組み合わせたルーチン生検により疾患の病期をモニタリングすることができる。図5の結果は、正常肝組織とHCCとのスペクトルパターンの違いを示す。特に、Tagの顕著なスペクトルがHCCにいくつかある。質量分析計の分解能が優れている場合、各スペクトルの分子アノテーションが、正常な細胞生理学と同様に、癌の分子機構の解明を可能にする可能性がある。
薬物代謝のリアルタイムモニタリングは、PESIを用いて行うことができる。我々の実験では、抗発生剤5-FdUの薬力学をマウスの尾静脈を通して注入された後、10s以上を監視した。非常に迅速なスペクトル検出は、薬物を注射したわずか数秒後に観察された(図6)、肝臓への血流を介した薬物の迅速な輸送を暗示する。5-FdUのナトリウム付加物の強度は、測定を開始した後6〜7sの周りに記録中のイオン信号の短い欠陥とともに衰退した。これは、麻酔マウスの身体運動の結果である肝臓のパレンチマにおけるPESI針の深さが変化したためである。従って、生きている動物のリアルタイム測定のためにPESI針の深さを調節する注意が必要である。針の最適な深さを見つける推奨方法はありませんが、練習で明らかになります。
3個体由来の血液サンプルをPESI-MSで分析した。この場合、10 μLの血清を50%エタノールの190μLと混合し、次いでPESI-MS分析に使用した。全体のスペクトル パターンは、いくつかの共通のピークを共有しているように見えますが (図 7)、この 3 人のスペクトルには多くの微小な違いがあります。彼らは代謝活動の面で一人一人の指紋です。分子アイデンティティの詳細については、ハイエンドマシンを使用する必要があります。実験で使用された質量分析計は、分子を同定するのに十分な高い分解能を提供しなかった。
高分子化合物による汚染がある場合、図4の元のスペクトルは、元のサンプルからスペクトルをぼかす周期的で目立つピークを重ね合せて生じる(図8)。これを実験的に実証するために、ポリプロピレングリセロール(PPGT)を2.5%に添加し、汚染の事例を再現しました。図8に見られるほぼすべての特定のスペクトルは、PPGTの添加によってマスクされた。
図1:サンプル準備フローの概略図サンプルの場合、専用のサンプルカートリッジは、安定したデータ収集に最適です。液体サンプル分析は、溶液をカートリッジに入れるだけで、PESI-MSを実行する最も簡単な方法です。この方法を固形組織に適用する方法は2つある。組織へのPESIの直接適用は非常に簡単で高速であり、抽出方法はサンプル種に応じてスペクトルのはるかに安定した取得を達成することを可能にする。この手順では、小片の組織サンプルを50%エタノールの100μLのマイクロチューブに入れ、マイクロペストルで均質化します。その後、得られたホモジネートの10μLを質量分析に使用する。生きている動物を分析する場合、30 μLのエタノールを標的臓器の漿膜表面に置き、その後測定を行う。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PESI-MSの概要と基本コンポーネントPESIモジュールを搭載した質量分析計。イオン化部は、イオン入口、針ホルダー、サンプルホルダーが設置された閉じたチャンバーに設置されています。針は既製であり、使い捨て可能なステンレス鋼の針は針のホールダーに固定される。試料カートリッジをチャンバーに入れた直後に質量分析計にセットされます。針の平均曲率角度は400nmである。サンプルを置くためのカートリッジは使い捨て可能であり、プラスチックポリマーから成っている。それは液体サンプル(赤い矢印)を置く小さな井戸を有する。固体試料をウェルに入れた後、カセットを折りたたんでサンプルをつまみ、ウェルを密封する。液体サンプルカートリッジの場合、折りたたみを必要としない別のサンプルを使用し、これは固体サンプルよりも優れた推奨バージョンです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: PESI-MS のグラフィック ユーザー インターフェイス (GUI)全イオンクロマトグラム(TIC)から質量スペクトルを生成するためのすべての手順は、関連するソフトウェアで行うことができます。データブラウザでLCDファイルを開いた後、TICを表示し、質量スペクトルを生成するための時間範囲を選択することができます。生成された質量スペクトルは、質量と電荷の比率(m/z)とイオン強度の両方を含むテキスト データとして書き出すことができます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ヒト腎細胞癌は、中性脂質の特徴的なピークを示す。ヒト腎細胞癌組織(RCC)からのスペクトルには、周囲の非癌組織では同定されなかった比較的強いピークがあった。これらのピークは主にトリアシルグリセロール(TAG)を質量対電荷比(m/z)900程度で表しています。スペクトル取得は、直接分析により正イオンモードを用いて行った。高電圧は2.3kVに設定した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:正常肝組織及びヒト肝細胞癌(HCC)で取得したデータの例。上のパネルは、新生病変が存在しなかったヒトの肝臓組織からのスペクトルを示していますが、慢性肝炎および肝硬変の患者からもスペクトルを示しています。下パネルは、同じ患者からのHCCの平均スペクトルを示す。一見すると、これら2つは非常に類似したスペクトルパターンを持っていますが、スペクトルパターンには多くの小さな違いがあります。横軸は質量対電荷比(m/z)を示し、縦座標は各スペクトルの相対的な強度を示します。スペクトルの取得は、図2Cに示すように、組織を抽出した後の正イオンモードを用いて行った。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:薬物代謝のリアルタイム測定5-FdUの代謝変化は、マウスの尾血管に静脈内注射した。ナトリウム付加物を用いた5-FdUの非常に迅速かつ敏感な検出は、その中の肝臓で達成された。測定中のイオン化が不安定なため、信号の停止は6-7s程度で確認できます。
図7:3人の個人からのデータの例。3個体由来のヒト血清をPESI-MSを用いて分析した。個人間のスペクトルパターンには明らかな違いがあった。データは正イオンモードを用いて取得した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:ポリマー化合物は、正確なデータ収集を妨げる。元の標本に重なったスペクトルピークの周期的な出現のために、データを正確に解釈することは困難になる。この場合、ポリプロピレントリオールグリセロール(PPGT)に由来するスペクトルは、騒がしいオーバーレイとして現れる。これらの化合物は、通常、キャリブレーションに使用され、肝臓からの元のスペクトルをマスクする。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PESIは質量分析4のESIの誘導体であるが、リアルタイムメタボロミクスをモニタリングする場合、ならびに複雑または時間のかかる前処理を行わずに生化学的反応を分析する場合に最も有利である5、14、15、17。生物の統合状態に適用できる、簡単で瞬時の質量分析技術です。サンプル前処理の複雑なカスケードを必要としないため、大量の有機溶媒を使用してサンプル前処理の複雑なステップを必要とする従来のESIで発生する可能性のある標本の損失を避けるため、標本全体の分子組成を評価する可能性がはるかに高くなります。したがって、PESIは、すべての条件が適切に制御されている場合、標本からはるかに多くの情報を得ることができます。
まず、PESI-MS分析を考える際に、良い結果を得るために必要な技術的側面について言及する必要があります。PESIの最も重要な要因は、分析中のイオン化効率の維持です。これを達成するためには、針の先端と試料表面との間の距離を調整し、最適化し、解析中にコンピュータモニタを参照して安定したTICを生成することが推奨される。これを行うには、最大TICを達成するために段階的に針の深さを変更する必要があります。イオン化の持続時間はESIに比べて比較的短いため、PESIは再現性や定量には適していません。第2に、針先の形状がイオン源となる理想的なテイラーコーンを形成することによりイオン化に非常に重要な役割を果たすため、針先を変形しないように注意しなければならない。先端の変形は、より低いイオン化効率につながる可能性がある。
PESIは、新鮮なサンプル(例えば肝臓、腎臓、脳)および特別な治療を受けずに生体に直接適用できるため有利であるが、流体21、22、23に含まれるほぼすべての成分をイオン化することができるため、他の外因性汚染物質に対して比較的敏感である。すなわち、サンプル前処理をスキップすることの利点の欠点は、生物学的実験でしばしば遭遇するいくつかの状況においてPESI−MSが不利であることを意味する。プロトコルセクションで説明したように、PESIは、RNA防腐剤、アルデヒド、および組織学的調製にしばしば使用されるクリオゲルなどの高分子化合物による汚染に敏感である。血栓は、PESI針に付着し、多くの場合、意図したスペクトルをマスクすることができます。また、RBCsのヘモリシスはヘモグロビンを遊離し、解離したフェリックイオンは、意図した分析物に由来するスペクトルよりもはるかに強いスペクトルを生じる。また、ポリマー化合物は、意図した検体から導出されるスペクトルをオーバーレイする周期的なスペクトルピークを与え、ノイズのために実際のデータを解釈することがはるかに困難になる(図8)。質量スペクトルの取得における問題を避けるために、汚染への言及の特別なメモを取って、私たちのプロトコルに従うことをお勧めします。この点で、PESIの適用が制限される場合もある。
PESIのもう一つの欠点は、比較的不安定なイオン化プロセスにあり、プローブ針の深さを検体に合わせる必要があります。さらに、この手法は、単一の分析で非常に制限された領域をカバーすることができます。組織に直接適用される針先のサイズが非常に小さいため、PESI-MS解析はMALDI-TOF MSベースのイメージング質量分析またはDESIベースのイメージング7、8で達成できる2D分析ほど包括的ではありません。しかし、PESIは、サンプルの2Dスキャンに時間がかかるため、海馬形成の画像を再構築することができますが、主にこの技術のイオン化効率が不安定であるために時間がかかります。これを考慮すると、PESI-MSによるマススペクトルイメージングは貴重なアプリケーションではありません。
PESIの電気化学的特性に関しては、針先に付着する試料の体積および濃度は18に重要であり、エレクトロスプレーサイズを小型化することによって抑制効果が幾分減衰する。PESIがESIの小型化であることを考慮すると、サンプルは理想的には先端にスラリーを形成しないように希釈する必要があります。したがって、直接組織法を採用した場合に効率的なイオン化を達成するには、約30μLのエタノールを添加する必要がある(図2B)。これはイオン化効率を最大にし、針の先端に付着した分子のほぼ完全なイオン化を達成する。
このシステム24を使用する場合、データ処理の最も適切な方法を選択することは非常に重要です。あらゆる疾患診断のための機械学習の実施に関しては、疾患の分類または分類のための参照を確立するためにデータベースの構築が必要である7.例えば、我々は、一次肝悪性腫瘍25の診断を行うために、サポートベクターマシンまたはロジスティック回帰を使用しています。
PESI-MSは、薬物スクリーニング、ドーピング検査、農産物26の食品安全試験、およびいくつかの環境試験のための大きな可能性を有する汎用性と簡単な技術です。このイオン化ユニットは、各特定の機器のアタッチメントを準備することで他の分光器と互換性があるため、PESIは様々な用途に適用できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
対応する著者は、PESI-MS機器のメーカーおよびサプライヤーである島津が資金を提供しました。
Acknowledgments
PESI-MSと澤の堀和子の秘書の援助を運営してくれた飯塚あゆみさんに感謝します。この原稿の草稿を編集してくれたエダンツ・グループ(www.edanzediting.com/ac)のブロンウェン・ガードナー博士に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
References
- Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
- Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).
- Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).
- Balog, J., et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).
- Boughton, B. A., Hamilton, B. Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).
- Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).
- Sugiyama, E., Setou, M. Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).
- Zhang, J., et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system. Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).
- Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry. Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).
- Chen, L. C., et al. Characterization of probe electrospray generated from a solid needle. Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Yoshimura, K., et al. Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).
- Ashizawa, K., et al. Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).
- Johno, H., et al. Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 14, 38 (2018).
- Zaitsu, K., et al. Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis. Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).
- Yoshimura, K., et al. Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique. Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).
- Nakagawa, H., et al. Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma. Cancers. 10, 447-461 (2018).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal. Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).
- Chen, L. C., et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe. Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor. Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).
- Hiraoka, K., et al. Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).
