Summary
यह लेख परिवेश जन स्पेक्ट्रोमेट्री के आधार पर एक अद्वितीय वास्तविक समय विश्लेषणात्मक विधि के लिए नमूना तैयारी विधियों का परिचय देता है। यह विधि हमें बिना किसी विशेष पूर्वउपचार के वीवो में जैविक अणुओं का वास्तविक समय विश्लेषण करने देती है।
Abstract
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान में एक शक्तिशाली उपकरण है क्योंकि यह अणुओं के बारे में बहुत सटीक जानकारी प्रदान करता है, जैसे बड़े पैमाने पर चार्ज अनुपात(एम/जेड),जो आणविक वजन और संरचनाओं को कम करने के लिए उपयोगी हैं । हालांकि यह अनिवार्य रूप से एक विनाशकारी विश्लेषणात्मक विधि है, परिवेश आयनीकरण तकनीक में हाल ही में प्रगति ने हमें अखंडता के मामले में अपेक्षाकृत बरकरार राज्य में ऊतक छोड़ते हुए डेटा प्राप्त करने में सक्षम बनाया है। प्रोब इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (पेसी) एक तथाकथित प्रत्यक्ष विधि है क्योंकि इसके लिए नमूनों के जटिल और समय लेने वाले पूर्वउपचार की आवश्यकता नहीं होती है। एक ठीक सुई एक नमूना बीनने के रूप में कार्य करता है, साथ ही एक आयनीकरण उत्सर्जक। जांच टिप के बहुत तेज और ठीक संपत्ति के आधार पर, नमूनों का विनाश कम है, जिससे हमें सीटू में जीवित चीजों से वास्तविक समय की आणविक जानकारी प्राप्त करने की अनुमति मिलती है। इसके साथ, हम पेसी-एमएस तकनीक के तीन अनुप्रयोगों को पेश करते हैं जो जैव चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए उपयोगी होंगे। एक ठोस ऊतक है, जो चिकित्सा निदान के लिए इस तकनीक का बुनियादी आवेदन है करने के लिए आवेदन शामिल है । चूंकि इस तकनीक के लिए केवल 10 मिलीग्राम नमूने की आवश्यकता होती है, इसलिए यह नियमित नैदानिक सेटिंग्स में बहुत उपयोगी हो सकता है। दूसरा आवेदन इन विट्रो मेडिकल डायग्नोस्टिक्स के लिए है जहां मानव रक्त सीरम मापा जाता है। तरल पदार्थ के नमूनों को मापने की क्षमता विभिन्न जैविक प्रयोगों में भी मूल्यवान है जहां पारंपरिक विश्लेषणात्मक तकनीकों के लिए पर्याप्त मात्रा में नमूने प्रदान नहीं किए जा सकते हैं। तीसरा आवेदन जीवित जानवरों में जांच सुइयों के प्रत्यक्ष आवेदन की ओर झुक जाता है, जहां हम विशिष्ट अंगों में मेटाबोलिट्स या दवाओं की वास्तविक समय की गतिशीलता प्राप्त कर सकते हैं। प्रत्येक आवेदन में, हम उन अणुओं का अनुमान लगा सकते हैं जिन्हें एमएस द्वारा पाया गया है या चिकित्सा निदान प्राप्त करने के लिए कृत्रिम बुद्धिमत्ता का उपयोग करसकते हैं।
Introduction
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) कटौती वाद की एक तकनीकी प्राप्ति है; यह विश्लेषण की वस्तु को एक इकाई में कम कर देता है जिसे आणविक प्रजातियों या झरने के आधार पर व्याख्या की जा सकती है। इसलिए, यह विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान का एक प्रतिनिधि विधि है। यह चार प्रक्रियाओं से बना है: आयनीकरण, विश्लेषण, पता लगाने, और स्पेक्ट्रल अधिग्रहण। क्योंकि अणु का आयनीकरण द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री में पहली प्रक्रिया है, यह आम तौर पर एनालाइट्स के रूप को संसाधित करने के लिए प्रतिबंधित करता है। अधिकांश आयनीकरण प्रक्रियाओं के लिए कार्बनिक नमूनों की संरचना, आकृति विज्ञान और वास्तविक समय की जैविक प्रक्रियाओं के विनाश की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) एमएस के लिए आवश्यक है कि नमूने कुशल आयनीकरण1के लिए तरल स्थिति में हों। इसलिए, नमूनों को एक जटिल जैव रासायनिक तैयारी से गुजरना चाहिए, जो अणुओं की संरचना को बदल देता है। वैकल्पिक रूप से, जबकि मैट्रिक्स की सहायता से लेजर अवशोषण आयनीकरण (MALDI) एमएस पतली खंडित ऊतक2,3केआणविक नक्शे का पुनर्निर्माण कर सकते हैं, इसकी आयनीकरण दक्षता नमूनों में सभी अणुओं का पता लगाने के लिए बहुत कम है, और यह फैटी एसिड का विश्लेषण करने में विशेष रूप से गरीब है । इन सीमाओं को ध्यान में रखते हुए, प्रोप इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (पेसी)4 का उपयोग संरचनात्मक अखंडता5को नष्ट किए बिना सीटू में जैविक प्रणालियों में वास्तविक समय परिवर्तन ों का पालन करने के लिए किया जा सकता है, जबकि जैविक जीव को देखा जा रहा है तकनीकी रूप से एक जीवित स्थिति में है। इस मामले में एक बहुत अच्छी सुई का उपयोग किया जाता है जो एक नमूना बीनने वाले और आयन उत्सर्जक के रूप में एक साथ कार्य करता है। इसका मतलब यह है कि जटिल नमूना पूर्वउपचार दृश्यों को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए नजरअंदाज किया जा सकता है जो सीटू में रहने वाली प्रणाली के आणविक घटकों को प्रतिबिंबित करता है।
कई अन्य आयनीकरण विधियां हैं जो पेसी-एमएस को प्रतिद्वंद्वी करते हैं। एक तेजी से वाष्पीकरण आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (रिम्स)6है । यह तकनीक सर्जरी के दौरान अच्छी तरह से काम करती है क्योंकि यह एक विद्युत चाकू के साथ इकट्ठा होती है और चीरा के दौरान उत्पन्न आयन पंख एकत्र करती है। जबकि रिम्स सर्जरी के लिए बहुत उपयोगी है, यह अनिवार्य रूप से एक विनाशकारी तरीका है कि ऊतक के विद्युत एब्लेशन की आवश्यकता है । इसलिए, यह एक तैयारी के नमूने में या प्रयोगशाला विश्लेषण में कोशिकाओं और ऊतकों के विस्तृत विश्लेषण के लिए उपयोगी नहीं है। इसके अलावा, क्योंकि यह ऊतक मलबे युक्त पंख की एक बड़ी राशि एकत्र करता है, यह प्रत्येक उपयोग के बाद उपकरणों के लंबे रखरखाव की आवश्यकता है, इस प्रकार विशेष शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए इस मशीन के उपयोग को सीमित । एक ऐसी ही विधि, जिसे लेजर डिजनराइजेशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलडीआई-एमएस)7कहा जाता है, एक और तकनीक है जो सतह विश्लेषण के लिए गैर-आक्रामक और उपयोगी है। क्योंकि यह तकनीक एक नमूने की सतह को स्कैन करने में अच्छी है, यह माल्डी इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री8,9जैसे व्यापक द्वि-आयामी विश्लेषण प्राप्त करती है। हालांकि, क्योंकि एलडीआई-एमएस केवल सतह विश्लेषण पर लागू होता है, इसलिए ऊतक के भीतर नमूनों का विश्लेषण करने के लिए पेसी-एमएस लाभप्रद है। एक और तकनीक, MasSpec कलम10,थायराइड कैंसर के निदान में उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता को प्राप्त करने के लिए सूचित किया गया था, लेकिन जांच का व्यास मिमी के क्रम में है और यह सतह विश्लेषण के लिए विशिष्ट है, जिसका अर्थ है कि यह कैंसर या गहराई से स्थानीय घावों के छोटे पिंड का पता नहीं लगा सकता है । इसके अलावा, चूंकि यह विधि जांच पेन में एम्बेडेड माइक्रोकेपिलरी प्रवाह नहर का उपयोग करती है, इसलिए एलडीआई-एमएस के समान क्रॉस-संदूषण को ध्यान में रखा जाना चाहिए। अन्य तकनीकें मौजूद हैं जिन्हें नैदानिक सेटिंग्स पर लागू किया गया है, जैसे प्रवाह जांच और आयनीकरण फॉर्म झाड़ू11,लेकिन वे व्यापक नहीं हैं।
पेसी ईएसआई का चरम लघुकरण है, जिसमें नैनो-इलेक्ट्रोस्प्रे का केशिका कई सौ एनएम के टिप वक्रता त्रिज्या के साथ एक ठोस सुई पर एकाग्र होता है। आयनीकरण सुई टिप के अत्यंत प्रतिबंधित क्षेत्र में टेलर शंकु बनाकर होता है, जिस पर नमूने तब तक रहते हैं जब तक कि टिप पर सभी तरल पदार्थ का आयनीकरण12पूरा नहीं हो जाता है। यदि एनालाइट धातु की सुई की नोक पर रहता है, तो धातु की सुई और एनालाइट्स के बीच इंटरफेस पर अतिरिक्त चार्ज लगातार उत्पन्न होता है। इसलिए, अणुओं का अनुक्रमिक आयनीकरण उनकी सतह गतिविधि के आधार पर होता है। यह गुण सुई टिप को एक प्रकार का क्रोमेटोग्राम बनाता है, जो उनकी सतह गतिविधि के आधार पर एनालाइट्स को अलग करता है। अधिक तकनीकी रूप से, मजबूत सतह गतिविधि वाले अणु टेलर शंकु की सतह पर आते हैं और कमजोर सतह गतिविधि वाले लोगों की तुलना में पहले आयनीकृत होते हैं, जो आयनीकरण प्रक्रिया के अंत तक सुई की सतह का पालन करते हैं। इस प्रकार, सुई द्वारा उठाए गए सभी अणुओं का पूर्ण आयनीकरण13प्राप्त किया जाता है। इसके अलावा, क्योंकि इस तकनीक में नमूने के लिए अनावश्यक विलायक के अलावा शामिल नहीं है, कई सैकड़ों फेम्टोलीटर आगे विश्लेषण14के लिए पर्याप्त मजबूत करने के लिए पर्याप्त हैं। ये गुण अक्षुण्ण जैविक नमूनों के विश्लेषण के लिए लाभप्रद हैं। हालांकि, पेसी-एमएस का एक बड़ा नुकसान आयनीकरण में विच्छेदन में निहित है क्योंकि ऊर्ध्वाधर धुरी के साथ सुई के विनिमय आंदोलन, एक चीरा मशीन के समान है। आयनीकरण केवल तब होता है जब जांच की नोक उच्चतम बिंदु तक पहुंचती है जब आयन छिद्र की ऊंचाई क्षैतिज धुरी पर गठबंधन होती है। आयनीकरण बंद हो जाता है, जबकि सुई नमूने उठाता है, और इसलिए आयनीकरण की स्थिरता पारंपरिक ईएसआई में उसके बराबर नहीं है। इसलिए, पेसी-एमएस प्रोटेओमिक्स के लिए एक आदर्श विधि नहीं है।
आज तक, पेसी-एमएस को मुख्यतजैविक प्रणालियों के विश्लेषण के लिए लागू किया गया है, जिसमें बुनियादी अनुसंधान से लेकर नैदानिक सेटिंग्स तक क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल है। उदाहरण के लिए, सर्जरी के दौरान तैयार मानव ऊतक का प्रत्यक्ष विश्लेषण गुर्दे की कोशिका कार्सिनोमा15 और फैरिंगियल स्क्वैमस कार्सिनोमा16दोनों में ट्राइसिल्ग्लिसरोल के संचय को प्रकट करने में सक्षम था। लिपिड प्रोफाइल पर ध्यान केंद्रित करने के लिए यह विधि रक्त जैसे तरल नमूनों को भी माप सकती है। उदाहरण के लिए, खरगोशों में आहार परिवर्तन के दौरान कुछ अणुओं को रेखांकित किया गया है; यह बताया गया था कि इन अणुओं में से कुछ प्रयोगों के बहुत प्रारंभिक दौर में कमी आई, उच्च संवेदनशीलता और नैदानिक निदान17के लिए इस प्रणाली की उपयोगिता का संकेत . इसके अलावा, एक जीवित जानवर के लिए सीधे आवेदन उपवास5की सिर्फ एक रात के बाद जिगर के जैव रासायनिक परिवर्तन का पता लगाने की अनुमति दी । Zaitsu एट अल18 ने इस प्रयोग5 पर फिर से गौर किया और लगभग उसी तरह जिगर के मेटाबोलिक प्रोफाइल का विश्लेषण किया, परिणामों के साथ जो हमारी मूल विधि की स्थिरता और प्रजनन क्षमता को मजबूत करते हैं। इसके अलावा, हम इस तकनीक19का उपयोग कर चूहों में गैर कैंसर जिगर आसपास से कैंसर के ऊतकों भेदभाव करने में सक्षम थे । इसलिए, यह एक बहुमुखी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक है जो वीवो और इन विट्रो दोनों में विभिन्न सेटिंग्स में उपयोगी है। एक और दृष्टिकोण से, पेसी मॉड्यूल बढ़ते लगाव को समायोजित करके विभिन्न द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर फिट करने के लिए बनाया जा सकता है। इस छोटे से लेख में, हम जीवितजानवरोंके साथ अनुप्रयोगों सहित अनुप्रयोगों(चित्रा 1)की मूल बातें और उदाहरण पेश करते हैं ।
प्रत्येक देश में विनियमों और कानूनों के अनुसार, प्रत्येक संस्थान के मानदंडों को पूरा करने के लिए इस प्रोटोकॉल के कुछ हिस्सों को संशोधित करने की आवश्यकता होगी । जीवित जीव के लिए आवेदन सबसे दिलचस्प और चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह सीटू में जीवित जानवरों में ऊतकों या अंगों में जैव रासायनिक या मेटाबोलिक परिवर्तन प्रदान कर सकता है। हालांकि इस आवेदन को यामांशी विश्वविद्यालय में पशु देखभाल के लिए संस्थागत समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, २०१३५में, पशु प्रयोगों के लिए विनियमों में हाल ही में परिवर्तन के कारण अनुमोदन का एक और दौर अब आवश्यक होगा । इसलिए प्रायोगिक योजना में कई संशोधन ों की सलाह दी जाती है। प्रयोगों में प्राप्त द्रव्यमान स्पेक्ट्रा के बारे में, प्रत्येक माप के बीच बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा के उतार-चढ़ाव को ध्यान में रखते हुए, कोई स्पेक्ट्रल सूचना साझा करने की प्रणाली नहीं है जो न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमण समुदाय के लिए आम है। ध्यान रखना चाहिए जब ऑपरेटर सुई-स्टिक दुर्घटनाओं से बचने के लिए सुई संभालता है, खासकर जब सुई धारक से सुई को हटा। सुई को अलग करने के लिए एक विशेष उपकरण इस उद्देश्य के लिए बहुत उपयोगी है। चूंकि पेसी मॉड्यूल का डिब्बा एक एयरटाइट, बंद कक्ष है, इसलिए निर्देशों के अनुसार द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर संचालित होने पर आयन पंख का रिसाव नहीं होता है।
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Protocol
यजमाशी विश्वविद्यालय में पशु देखभाल के लिए संस्थागत समिति ने सभी प्रोटोकॉल और यहां बताए गए प्रायोगिक पशुओं के उपयोग को मंजूरी दी । मानव नमूना उपयोग को यमानशी विश्वविद्यालय में संस्थागत नैतिकता बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. ठोस ऊतक तैयारी
नोट: ऊतक ताजगी को संरक्षित करने के लिए पशु या मानव शरीर से उन्हें हटाने के बाद नमूनों को बर्फ पर रखा जाना चाहिए। यदि माप तुरंत विच्छेदन का पालन नहीं करते हैं, तो ऊतक को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने की सिफारिश की जाती है। ऊतक को किसी भी प्रकार के बफर या खारा में रखना उचित नहीं है, क्योंकि वे ऊतक से कुछ सामग्री निकाल सकते हैं। एल्डिहाइड के साथ तय किए गए ऊतक या पैराफिन/मोम या क्रायोगेल में एम्बेडेड एमएस मापन के लिए उपयुक्त नहीं है ।
- स्केलपेल या चाकू का उपयोग करके ऊतक के नमूने को लगभग 2 x 2 x 2 मिमी तक काट लें। वैकल्पिक रूप से, त्वचा की जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले ट्रेपन (एक डिस्पोजेबल बायोप्सी पंच, बोर आकार 3 मिमी) के साथ नमूने को पंच करें। इस मामले में, कॉलम की लंबाई को 2 मिमी तक ट्रिम करें।
नोट: इस विधि का उपयोग करके किसी भी ऊतक का विश्लेषण किया जा सकता है। इस प्रयोग में, जिगर15 और गुर्दे19,सफलतापूर्वक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए विश्लेषण किया गया है । आम तौर पर, पैरान्चिमल अंग अच्छे द्रव्यमान स्पेक्ट्रा देते हैं, जबकि जिन में रेशेदार घटक होते हैं, वे नहीं होते हैं। - यदि ऊतक रक्त से दूषित है, तो बर्फ-ठंडे फॉस्फेट-बफर नमकीन के साथ संक्षेप में धोएं।
नोट: पोस्टमॉर्टम ऊतक क्षति को कम करने के लिए, कमरे के तापमान पर जितनी जल्दी हो सके, इस कदम को पूरा करें। यदि माप तुरंत नहीं किए जाते हैं, तो स्नैप ऊतक को तरल नाइट्रोजन में फ्रीज कर देता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। - कट या बाहर मुक्का मारा नमूना (लगभग 10 मिलीग्राम) एक प्लास्टिक माइक्रोट्यूब में रखें और 50% इथेनॉल के 100 μL जोड़ें।
नोट: नमूनों का सही वजन निर्धारित नहीं किया जाता है क्योंकि इस प्रणाली में उपयोग किया जाने वाला द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री मात्रात्मक डेटा प्रदान नहीं करता है। लगभग 10 मिलीग्राम पैरेंचिमल ऊतक के लिए इष्टतम है। - माइक्रोपेस्टल का उपयोग करके नमूने को समरूप करें।
- कारतूस के कुएं में होमोजेनेट के 10 माइक्रोन रखें(चित्रा 2)।
- बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के आयनीकरण कक्ष में कारतूस रखें और स्टेनलेस-स्टील सुई जांच स्थापित करें जिसका उपयोग नमूना आयनीकरण(चित्रा 2)के लिए किया जाएगा।
नोट: निर्माता द्वारा जांच सुइयों की आपूर्ति की जाती है। वे स्टेनलेस स्टील से बने होते हैं और लगभग 400 एनएम का वक्रता त्रिज्या होता है। - सुरक्षा उपकरण को स्वचालित रूप से सक्रिय करने के लिए चैंबर ढक्कन को मजबूती से बंद करें।
- विश्लेषण करने के लिए स्टार्ट आइकन पर क्लिक करके ऑन-बोर्ड कंप्यूटर शुरू करें। ऑनस्क्रीन पैनलों का उपयोग करके, इलेक्ट्रोस्प्रे उत्पन्न करने के लिए सुई पर 2.3 केवी का वोल्टेज लागू करें और यह सुनिश्चित करें कि सुई की आवृत्ति 3 हर्ट्ज है।
- माप पूरा करने के लिए 30 एस के लिए प्रतीक्षा करें।
नोट: डेटा अधिग्रहण पूरा होने पर सत्र स्वचालित रूप से बंद हो जाता है। विश्लेषण की गुणवत्ता की निगरानी कुल आयन क्रोमेटोग्राम (टीके) द्वारा की जाती है। माप समय प्रतिनिधि जन स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए परिभाषित किया गया है और छोटा या बढ़ाया जा सकता है। - प्रत्येक नमूने को मापने के बाद एक बायोहैजार्ड डिस्पोजर में कारतूस और सुई का निपटान करें।
नोट: एक समय में केवल एक नमूना मापा जा सकता है। हर माप से पहले मशीन को कैलिब्रेट करना आवश्यक नहीं है; अंशांकन हर छह महीने में एक बार आपूर्तिकर्ता द्वारा नियमित जांच पर निर्भर करता है। - द्रव्यमान स्पेक्ट्रा का विश्लेषण करें और द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर (सामग्री की तालिकादेखें) से जुड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रल टेक्स्ट डेटा का निर्यात करें जैसा कि नीचे दिए गए चरणों में कहा गया है(चित्रा 3)।
- सॉफ्टवेयर की डाटा फाइल ब्राउजर विंडो में एलसीडी फाइल पर क्लिक करें।
- बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम विंडो पर एक ही चोटी पर चुनें और क्लिक करें और स्वचालित रूप से निकाले गए आयन क्रोमेटोग्राम (ईआईसी) को चित्रित करें।
- बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम पैदा करने के लिए रेंज-ऑफ-टाइम विंडो का चयन करने के लिए TIC और EIC की जांच करें और औसत स्पेक्ट्रम आइकन पर क्लिक करें।
नोट: इस विश्लेषण में, लक्ष्य अणु बड़े पैमाने पर चार्ज अनुपात(मे/जेड)खिड़की(चित्रा 3)में दिखाई देते हैं । इसके अलावा, क्योंकि सुई आंदोलन के प्रति एकल स्ट्रोक आयनीकरण की अवधि बहुत कम है, प्राप्त सभी द्रव्यमान स्पेक्ट्रा अनिवार्य रूप से 10 एस (300 स्कैन) से अधिक औसत स्पेक्ट्रा हैं। - आगे के विश्लेषण के लिए एक्सपोर्ट टैब पर क्लिक करके एम/जेड और आयन तीव्रता वाली टेक्स्ट फाइल जनरेट करें। इस टेक्स्ट फाइल को किसी भी फ़ोल्डर में स्टोर किया जा सकता है।
नोट: किसी भी आरएनए संरक्षक नमूनों के देशी स्पेक्ट्रल पैटर्न को प्रभावित करेगा। इसके अलावा, भंडारण के दौरान ऊतक से आणविक घटकों के एल्यूशन को रोकने के लिए किसी भी तरल (जैसे फॉस्फेट-बफरलव) के बिना ऊतकको संभालने और स्टोर करने की सलाह दी जाती है। आदर्श रूप से, बिना किसी उपचार के ताजा या ताजा जमे हुए नमूनों का उपयोग किया जाता है।
2. शरीर के तरल पदार्थ (सीरम) तैयारी
नोट: यह पूरी प्रक्रिया लगभग ठोस ऊतक के लिए उपयोग की जाने वाली समान है। तरल पदार्थ के नमूने के लिए कारतूस निर्माता से उपलब्ध है। क्योंकि लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) द्वारा संदूषण इच्छित घटक (प्लाज्मा या सीरम) के स्पेक्ट्रल अधिग्रहण की दक्षता को बहुत कम कर सकता है, माप से पहले सभी आरबीसी को केंद्रित करके समाप्त करना सुनिश्चित करें।
- सीरम सैंपल के 10 माइक्रोन लें और इसे 1.5 mL माइक्रोट्यूब में डाल दें।
नोट: ताजा और संग्रहीत सीरम दोनों का उपयोग किया जा सकता है। - 1.5 mL ट्यूब में 50% इथेनॉल के 190 μL जोड़ें, तो कमरे के तापमान पर 2 न्यूनतम के लिए भंवर।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-5 मिन के लिए 15,000 x ग्राम पर तरल को सेंट्रलाइज किया।
- कारतूस के कुएं में सुपरनेटेंट के 10 μL स्थानांतरित करें।
- मशीन के आयनीकरण कक्ष में कारतूस रखें और स्टेनलेस स्टील सुई जांच स्थापित करें जिसका उपयोग नमूना आयनीकरण(चित्रा 2)के लिए किया जाएगा।
- सुरक्षा उपकरण को स्वचालित रूप से सक्रिय करने के लिए चैंबर ढक्कन को मजबूती से बंद करें।
- आयनाइज करने के लिए स्टार्ट आइकन पर क्लिक करके ऑन-बोर्ड कंप्यूटर शुरू करें।
- एक बार माप लिया गया है 1.10 में वर्णित नमूना कारतूस और सुई त्यागें।
- नीचे बताए गए ईआईसी के प्राप्त सेटों का विश्लेषण करें(चित्रा 3)।
- डाटा ब्राउजर पर एलसीडी फाइल खोलें।
- TIC और EIC प्रदर्शित करने के लिए एक ही चोटी पर क्लिक करें।
- औसत स्पेक्ट्रम आइकन का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा पैदा करने के लिए रेंज-ऑफ-टाइम विंडो का चयन करें।
- मॉनिटर पर निर्यात टैब पर क्लिक करके एक संबंधित चोटी की एम/जेड और आयन तीव्रता दोनों वाली उत्पन्न फ़ाइल का निर्यात करें।
नोट: इस प्रक्रिया को लार, मूत्र, और अन्य शरीर के तरल पदार्थ ों पर भी लागू किया जा सकता है।
3. जीवित जीव में वीवो पेसी-एमएस में तैयारी
नोट: इस खंड में, एक जीवित माउस मॉडल में 5-फ्लोरो-2'-deoxyuridine (5-FdU) के मेटाबोलिक प्रोफाइल की निगरानी के लिए एक आवेदन पेश किया गया है। भर में असेप्टिक स्थितियों का उपयोग करें।
- 2 महीने पुराने माउस (लगभग 20 ग्राम वजन) की पूंछ नस में 100 मीटर 5-एफडीयू समाधान के 100 माइक्रोन का संचार करें।
नोट: सेक्स, उम्र या माउस तनाव के लिए कोई प्राथमिकता नहीं है। हालांकि इस प्रोटोकॉल को उस समय मंजूरी दी गई थी जब हमने प्रयोग5को अंजाम दिया था, लेकिन इस प्रयोग की व्यवहार्यता उस देश के नैतिक प्रतिबंधों पर निर्भर करती है, जिसमें इसे अंजाम दिया जाएगा । - अपने अनुमोदित पशु देखभाल प्रोटोकॉल का पालन माउस को एनेस्थेटिज़ करें। पूंछ चुटकी के जवाब की कमी से संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करें।
नोट: यदि पशु प्रयोगों के लिए नैतिक समिति द्वारा सोडियम पेंटोबार्बिटल के उपयोग की अनुमति नहीं है, तो वैकल्पिक तरीकों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड। - एक बिजली के उस्तरा का उपयोग कर पेट गुहा दाढ़ी और आंखों के लिए पशु चिकित्सक मरहम लागू होते हैं ।
- एनेस्थेटाइज्ड माउस को एक सुपाण्य स्थिति में रखें और मेवरिंग टेप का उपयोग करके प्लास्टिक प्लेट पर पंजे को ठीक करें। सर्जिकल साइट को तीन बार 70% अल्कोहल की स्क्रब से स्क्रब करें।
- कैंची का उपयोग कर पेट गुहा को खोलें। सबसे पहले, त्वचा को डायाफ्राम के ठीक ऊपर से पार्श्व (10 मिमी) काट ें। बाद में पेट के शरीर की दीवार और पेरिटोनम (सीए 7 मिमी) की मांसपेशी को काट लें और जिगर की सतह को बेनकाब करने के लिए स्टेनलेस तार का उपयोग करके घाव को खुला रखें।
नोट: जिगर की सतह को पर्फ्यूज करने की कोई आवश्यकता नहीं है। - जांच सुई की नोक को जिगर की सतह पर लगाएं। आयनीकरण दक्षता को अनुकूलित करने के लिए सुई की गहराई को लगभग 0.5 मिमी गहरी में समायोजित करें, एक साथ टिक और स्पेक्ट्रल पैटर्न की जांच करें। कंट्रोल पैनल की स्क्रीन पर हाई वोल्टेज को 2.3 केवी और फ्रीक्वेंसी को 3 हर्ट्ज तक सेट करें।
- प्लास्टिक की प्लेट से जानवर को हटा दें।
- घाव को सर्जिकल आंत सीवन का उपयोग करके टांका करें और माउस को पिंजरे में वापस करें। जब तक यह स्टर्नल रेकूबेंसी बनाए रखने के लिए चेतना वापस आ गया है माउस उपेक्षित मत छोड़ो। माउस को अन्य जानवरों की कंपनी को तब तक वापस न करें जब तक कि वह पूरी तरह से ठीक न हो जाए।
- ईआईसी में आयन तीव्रता का समय पाठ्यक्रम और 1.11.1 से 1.11.4 तक ईआईसी चित्रण की प्रक्रिया करें।
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Representative Results
जैसा कि चित्रा 3में दर्शाया गया है, पेसी-एमएस तकनीक द्वारा प्राप्त आंकड़े द्रव्यमान स्पेक्ट्रा हैं, जिनकी एम/जेड इस प्रणाली में 10 से 1,200 तक है। जबकि कोई भी एम/जेड 2,000 तक अणुओं का पता लगा सकता है, मे/जेड 1,200 की द्रव्यमान सीमा पर इस तकनीक का उपयोग करके कुछ चोटियों को प्राप्त किया गया था। इसलिए, हमने एम/जेड 10 से 1,200 तक चोटियों का विश्लेषण किया। मे/जेड 800 और 900 के आसपास चोटियों के विशिष्ट समूह थे; पूर्व सेल झिल्ली घटकों का प्रतिनिधित्व करता है, जैसे फॉस्फेटिइल कोलिन (पीसी) प्रजातियां, और उत्तरार्द्ध ट्राइसिल ग्लाइसेरोल (टैग) का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 4 एक सामान्य मानव गुर्दे और एक गुर्दे की कोशिका कार्सिनोमा (आरसीसी) से द्रव्यमान स्पेक्ट्रा दिखाता है। प्रोटोकॉल 1 में समझाई गई प्रत्यक्ष ऊतक विधि का उपयोग करके द्रव्यमान स्पेक्ट्रा प्राप्त किया गया था। क्योंकि स्पष्ट सेल प्रकार आरसीसी साइटोप्लाज्म में टैग जमा करता है, एम/जेड 900 के आसपास स्पेक्ट्रा का एक समूह बहुत स्पष्ट है। चित्रा 4 में परिणाम ठोस नमूनों के लिए चित्रा 1 में पेश निष्कर्षण विधि द्वारा प्राप्त किया गया था।
क्योंकि रोग प्रगति20के दौरान हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा का लिपिड मेटाबोलिज्म बदलता है, इसलिए पेसी-एमएस के साथ संयुक्त नियमित बायोप्सी द्वारा रोग के चरणों की निगरानी करना संभव है। चित्रा 5 में परिणाम सामान्य जिगर के ऊतकों और एचसीसी के बीच स्पेक्ट्रल पैटर्न में अंतर को दर्शाया गया है। विशेष रूप से, एचसीसी में टैग के कई उल्लेखनीय स्पेक्ट्रा हैं। यदि द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर का संकल्प बेहतर है, तो यह संभव है कि प्रत्येक स्पेक्ट्रम का आणविक एनोटेशन कैंसर के आणविक तंत्र के साथ-साथ सामान्य सेलुलर फिजियोलॉजी के व्याख्या की अनुमति देगा।
पेसी का उपयोग करके दवा चयापचय की वास्तविक समय निगरानी की जा सकती है। हमारे प्रयोगों में, एंटी-ऑन्कोटिक एजेंट 5-एफडीयू के फार्माकोडायनामिक्स को माउस की पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्ट किए जाने के बाद 10 एस से अधिक निगरानी की गई थी। स्पेक्ट्रा का बहुत तेजी से पता लगाने दवा इंजेक्शन के बाद केवल कुछ सेकंड देखा गया था(चित्रा 6),जिगर के लिए खून के माध्यम से दवा के तेजी से परिवहन का अर्थ है । माप शुरू करने के बाद लगभग 6-7 एस में रिकॉर्डिंग में आयन संकेत के एक संक्षिप्त दोष के साथ 5-FdU के सोडियम एडडक्टकी तीव्रता कम हो गई। यह जिगर परेंचिमा में पेसी सुई की अलग-अलग गहराई के कारण था, जो एनेस्थेटाइज्ड माउस के शरीर की गतिविधियों का परिणाम था। इसलिए, जीवित जानवरों के वास्तविक समय माप के लिए पेसी सुई की गहराई को समायोजित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। सुई की इष्टतम गहराई खोजने का कोई अनुशंसित तरीका नहीं है, लेकिन यह अभ्यास के साथ स्पष्ट हो जाता है।
पेसी-एमएस द्वारा तीन व्यक्तियों से रक्त के नमूनों का विश्लेषण किया गया । इस मामले में, सीरम के 10 माइक्रोन को 50% इथेनॉल के 190 माइक्रोन के साथ मिलाया गया था और फिर पेसी-एमएस विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता था। जबकि समग्र स्पेक्ट्रल पैटर्न कई आम चोटियों(चित्रा 7)साझा करने के लिए दिखाई देते हैं, इन तीन लोगों से स्पेक्ट्रा में कई मिनट के अंतर हैं। वे मेटाबॉलिक गतिविधियों के मामले में प्रत्येक व्यक्ति के फिंगरप्रिंट हैं। आणविक पहचान के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए, उच्च अंत मशीन का उपयोग करना आवश्यक है। प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर ने अणुओं की पहचान करने के लिए एक उच्च पर्याप्त संकल्प प्रदान नहीं किया।
यदि बहुलक यौगिकों द्वारा संदूषण होता है, तो चित्रा 4 में मूल स्पेक्ट्रा मढ़ा आवधिक और विशिष्ट चोटियों को जन्म देता है जो मूल नमूने(चित्र8)से स्पेक्ट्रा को धुंधला करते हैं। इसे प्रायोगिक रूप से प्रदर्शित करने के लिए, हमने संदूषण के मामले को पुन: पेश करने के लिए पॉलीप्रोपाइलीन ग्लाइरोल ट्रिओल (पीपीजीटी) को 2.5% तक जोड़ा। लगभग सभी विशिष्ट चित्र चित्रा 8 में देखा PPGT के अलावा द्वारा नकाबपोश थे ।
चित्रा 1: नमूना तैयारी प्रवाह का योजनाबद्ध सिंहावलोकन। नमूनों के लिए, एक विशेष नमूना कारतूस स्थिर डेटा अधिग्रहण के लिए आदर्श है। तरल नमूना विश्लेषण बस कारतूस में समाधान रखकर, पेसी-एमएस करने का सबसे आसान तरीका है। ठोस ऊतक के लिए इस विधि को लागू करने के लिए दो तरीके हैं। ऊतक के लिए पेसी का सीधा आवेदन बहुत आसान और तेज है, जबकि निष्कर्षण विधि नमूना प्रजातियों के आधार पर स्पेक्ट्रा के बहुत अधिक स्थिर अधिग्रहण को प्राप्त करने में सक्षम बनाती है। इस प्रक्रिया में, ऊतक नमूने का एक छोटा सा टुकड़ा माइक्रोट्यूब में रखा जाता है जिसमें 100 माइक्रोन का 50% इथेनॉल होता है और माइक्रोपेस्टल के साथ समरूप होता है। परिणामस्वरूप होमोजेनेट के 10 μL तो बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए प्रयोग किया जाता है । जीवित जानवर का विश्लेषण करने के मामले में, 50% इथेनॉल के 30 माइक्रोन को लक्ष्य अंग की सीरोसाल सतह पर रखा जाता है, जिसके बाद माप होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: पेसी-एमएस के अवलोकन और बुनियादी घटक। पेसी मॉड्यूल से लैस एक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर। आयनीकरण हिस्सा एक बंद कक्ष में स्थापित किया गया है जहां आयन इनलेट, सुई धारक और नमूना धारक रखा जाता है। सुई तैयार है, और डिस्पोजेबल स्टेनलेस स्टील की सुई सुई धारक को तय की जाती है। यह कक्ष में नमूना कारतूस रखने के ठीक बाद बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर में सेट किया जाता है। सुई का औसत वक्रता कोण 400 एनएम है। नमूना रखने के लिए कारतूस डिस्पोजेबल और प्लास्टिक बहुलक से बना है। इसमें तरल नमूना (लाल तीर) रखने के लिए एक छोटा सा कुआं है। ठोस नमूना कुएं में डालने के बाद, कैसेट को नमूने को चुटकी लेने और कुएं को सील करने के लिए जोड़ दिया जाता है। एक तरल नमूना कारतूस के लिए, एक अलग का उपयोग किया जाता है जिसका उपयोग तह करने की आवश्यकता नहीं होती है, और यह एक अनुशंसित संस्करण है जो ठोस नमूनों से बेहतर है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: पेसी-एमएस के लिए ग्राफिक यूजर इंटरफेस (जीयूआई) । कुल आयन क्रोमेटोग्राम (TIC) से बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा पैदा करने के लिए सभी प्रक्रियाओं को संबद्ध सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है। डेटा ब्राउजर में एलसीडी फाइल खोलने के बाद, TIC प्रदर्शित किया जा सकता है, और मास स्पेक्ट्रा उत्पन्न करने के लिए समय सीमा का चयन किया जा सकता है। उत्पन्न द्रव्यमान स्पेक्ट्रा को टेक्स्ट डेटा के रूप में निर्यात किया जा सकता है जिसमें मास-टू-चार्ज अनुपात(मे/जेड)और आयन तीव्रता दोनों होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: मानव गुर्दे की कोशिका कार्सिनोमा तटस्थ लिपिड की विशेषता चोटियों को दर्शाता है। मानव गुर्दे सेल कार्सिनोमा ऊतक (आरसीसी) से स्पेक्ट्रा में अपेक्षाकृत मजबूत चोटियां थीं जिनकी पहचान आसपास के गैर-कैंसर ऊतकों में नहीं की गई थी। ये चोटियां मुख्यतः लगभग मास-टू-चार्ज अनुपात(एम/जेड)900 पर त्रिसिल्ग्लिसरोल (टैग) का प्रतिनिधित्व करती हैं। स्पेक्ट्रल अधिग्रहण प्रत्यक्ष विश्लेषण द्वारा सकारात्मक आयन मोड का उपयोग करके किया गया था। हाई वोल्टेज 2.3 केवी तक तय किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: सामान्य यकृत ऊतकों और मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) में प्राप्त डेटा का उदाहरण। ऊपरी पैनल एक मानव जिगर के ऊतकों से स्पेक्ट्रा को दर्शाया गया है जहां एक नियोप्लास्टिक घाव मौजूद नहीं था, लेकिन क्रोनिक हेपेटाइटिस और जिगर सिरोसिस के साथ एक मरीज से । निचले पैनल एक ही मरीज से एचसीसी के औसत स्पेक्ट्रा को दिखाता है । एक नजर में जहां इन दोनों में बहुत ही तरह के स्पेक्ट्रल पैटर्न होते हैं, वहीं स्पेक्ट्रल पैटर्न में कई छोटे-छोटे अंतर होते हैं। एब्सिसा द्रव्यमान-से-प्रभारी अनुपात(एम/जेड)को दर्शाता है और संग्राहक प्रत्येक स्पेक्ट्रम की सापेक्ष तीव्रता को दर्शाता है । स्पेक्ट्रा का अधिग्रहण ऊतक निकालने के बाद सकारात्मक आयन मोड का उपयोग करके किया गया था, जैसा कि चित्रा 2सीमें चित्रित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: दवा चयापचय के वास्तविक समय माप। 5-एफडीयू में मेटाबोलिक परिवर्तन एक माउस के पूंछ पोत में नसों के इंजेक्शन। सीटू में लिवर में सोडियम अडक्ट के साथ 5-एफडीयू का बहुत तेजी से और संवेदनशील पता लगाया गया। माप के दौरान अस्थिर आयनीकरण के कारण, सिग्नल की समाप्ति लगभग 6-7 एस पर नोट की जा सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7: तीन व्यक्तियों से डेटा के उदाहरण। तीन व्यक्तियों से मानव सीरम पेसी-एमएस का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । व्यक्तियों के बीच स्पेक्ट्रल पैटर्न में स्पष्ट अंतर थे। सकारात्मक आयन मोड का उपयोग करके डेटा प्राप्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 8: बहुलक यौगिक सटीक डेटा अधिग्रहण में हस्तक्षेप करते हैं। मूल नमूने पर मढ़ा स्पेक्ट्रल चोटियों के आवधिक उद्भव के कारण, डेटा की सटीक व्याख्या करना मुश्किल हो जाता है। इस मामले में, पॉलीप्रोपाइलीन ट्रायल ग्लाइसेरोल (पीपीजीटी) से प्राप्त स्पेक्ट्रा शोर ओवरले के रूप में दिखाई देता है। उन यौगिकों, आमतौर पर अंशांकन के लिए इस्तेमाल किया, जिगर से मूल स्पेक्ट्रा मुखौटा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यद्यपि पेसी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री4के लिए ईएसआई का व्युत्पन्न है, यह वास्तविक समय के मेटापोलोमिक्स की निगरानी के साथ-साथ किसीभी जटिल या समय लेने वाले प्रीट्रीटमेंट्स5,14,15,17को किए बिना जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए सबसे लाभप्रद है। यह एक आसान और तात्कालिक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक है जिसे एकीकृत जीवित जीवों की स्थिति पर लागू किया जा सकता है। चूंकि इसके लिए नमूना पूर्वउपचार के जटिल झरने की आवश्यकता नहीं होती है, पूरे नमूने की आणविक संरचना का आकलन करने की अधिक संभावना है, क्योंकि हम पारंपरिक ईएसआई में होने वाले नमूने के किसी भी संभावित नुकसान से बचते हैं, जिसके लिए बड़ी मात्रा में कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग करके नमूना प्रीट्रीटमेंटके जटिल चरणों की आवश्यकता होती है। इसलिए, पेसी हमें नमूने से बहुत अधिक जानकारी प्राप्त करने की अनुमति देता है यदि सभी स्थितियों को उचित रूप से नियंत्रित किया जाता है।
पेसी-एमएस विश्लेषण पर विचार करते समय हमें पहले अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक कुछ तकनीकी पहलुओं का उल्लेख करने की आवश्यकता है। पेसी में सबसे महत्वपूर्ण कारक विश्लेषण के दौरान आयनीकरण दक्षता का रखरखाव है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, विश्लेषण के दौरान कंप्यूटर मॉनिटर का उल्लेख करके एक स्थिर टिक उत्पन्न करने के लिए सुई की नोक और नमूना सतह के बीच की दूरी को समायोजित और अनुकूलित करने की सलाह दी जाती है। ऐसा करने के लिए, अधिकतम टिक प्राप्त करने के लिए चरणबद्ध तरीके से सुई की गहराई को बदलना आवश्यक है। क्योंकि ईएसआई की तुलना में आयनीकरण की अवधि अपेक्षाकृत कम है, इसलिए पेसी प्रजनन या मात्राकरण के लिए आदर्श नहीं है। दूसरा, क्योंकि सुई टिप का आकार आयनीकरण में एक आदर्श टेलर शंकु बनाकर एक बहुत महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जो आयन स्रोत के रूप में कार्य करता है, सुई टिप को विकृत करने के लिए देखभाल नहीं की जानी चाहिए। टिप के विरूपण से आयनीकरण दक्षता कम हो सकती है।
जबकि पेसी लाभप्रद है क्योंकि इसे सीधे ताजा नमूनों (जैसे जिगर, गुर्दे और मस्तिष्क) और विशेष उपचार के बिना जीवित जीव पर लागू किया जा सकता है, यह अन्य बहिर्जात संदूषकों के प्रति अपेक्षाकृत संवेदनशील है क्योंकि यह तरल पदार्थ21,22,23में निहित लगभग सभी घटकों पर आयोजन कर सकता है। यही है, नमूना पूर्वउपचार लंघन के लाभ के नकारात्मक पक्ष का मतलब है कि पेसी-एमएस कई स्थितियों में नुकसान में है जो अक्सर जैविक प्रयोगों में सामना करते हैं। जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में बताया गया है, पेसी आरएनए संरक्षक, एल्डिहाइड और बहुलक यौगिकों जैसे कि अक्सर हिस्टोलॉजिकल तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले क्रायोगल द्वारा संदूषण के प्रति संवेदनशील है। रक्त के थक्के पेसी सुई का पालन कर सकते हैं और अक्सर इच्छित स्पेक्ट्रा को मुखौटा कर ते हैं। इसके अलावा, आरबीसी का हीमोलिसिस हीमोग्लोबिन को मुक्त करता है, और विसोसिएटेड फेरिक आयन इच्छित एनालिट्स से प्राप्त लोगों की तुलना में बहुत मजबूत स्पेक्ट्रा को जन्म देता है। बहुलक यौगिक आवधिक स्पेक्ट्रल चोटियों को भी देते हैं जो इच्छित एनालिट्स से प्राप्त स्पेक्ट्रा को ओवरले करते हैं, जिससे शोर(चित्र 8)के वास्तविक डेटा की व्याख्या करना बहुत कठिन हो जाता है। जन स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण में किसी भी समस्या से बचने के लिए, संदूषण के संदर्भों पर विशेष ध्यान देते हुए, हमारे प्रोटोकॉल का पालन करने की सलाह दी जाती है। इस संबंध में कुछ मामलों में पेसी का आवेदन सीमित है।
पेसी का एक और नुकसान इसकी अपेक्षाकृत अस्थिर आयनीकरण प्रक्रिया में निहित है, जिसके लिए हमें जांच सुई की गहराई को विश्लेषण करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, यह तकनीक एक ही विश्लेषण में एक बहुत ही प्रतिबंधित क्षेत्र को कवर कर सकती है। सुई टिप के बहुत छोटे आकार के कारण जो सीधे ऊतक पर लागू होता है, पेसी-एमएस विश्लेषण 2डी विश्लेषण के रूप में व्यापक नहीं है जिसे मालदी-टीफ एमएस-आधारित इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री या देसी-आधारित इमेजिंग7,8के साथ प्राप्त किया जा सकता है। पेसी, हालांकि, हिप्पोकैम्पल गठन की एक छवि का पुनर्निर्माण कर सकता है, हालांकि इसमें कई घंटेलगते हैं 23 क्योंकि एक नमूने की 2डी स्कैनिंग में लंबा समय लगता है, मुख्यतः इस तकनीक की अस्थिर आयनीकरण दक्षता के कारण। इसे ध्यान में रखते हुए, पेसी-एमएस द्वारा बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रल इमेजिंग एक मूल्यवान आवेदन नहीं है।
पेसी के इलेक्ट्रोकेमिकल गुणों के बारे में, सुई की नोक का पालन करने वाले नमूने की मात्रा और एकाग्रता18महत्वपूर्ण है, क्योंकि दमन प्रभाव इलेक्ट्रोस्प्रे आकार को आकार घटाकर कुछ हद तक क्षीण हो जाता है। यह देखते हुए कि पेसी ईएसआई का लघुकरण है, नमूनों को आदर्श रूप से टिप पर घोल बनाने से बचने के लिए पतला किया जाना चाहिए। इसलिए, प्रत्यक्ष ऊतक विधि कार्यरत होने पर कुशल आयनीकरण प्राप्त करने के लिए 50% इथेनॉल के लगभग 30 माइक्रोन को जोड़ना आवश्यक है(चित्रा 2बी)। यह आयनीकरण दक्षता को अधिकतम करता है और सुई की नोक से जुड़े अणुओं के लगभग पूर्ण आयनीकरण को प्राप्त करता है।
इस प्रणालीकाउपयोग करते समय डेटा प्रसंस्करण की सबसे उपयुक्त विधि का चयन करना बहुत महत्वपूर्ण है । किसी भी रोग निदान के लिए मशीन लर्निंग के कार्यान्वयन के संबंध में, रोगों को वर्गीकृत करने या वर्गीकृत करने के लिए एक संदर्भ स्थापित करने के लिए डेटाबेस का निर्माण आवश्यक है7। उदाहरण के लिए, हमने प्राथमिक यकृत घातक25का निदान करने के लिए समर्थन वेक्टर मशीन या लॉजिस्टिक प्रतिगमन का उपयोग किया है।
पेसी-एमएस एक बहुमुखी और आसान तकनीक है जिसमें दवा स्क्रीनिंग, डोपिंग परीक्षण, कृषि उत्पादों के खाद्य सुरक्षापरीक्षण26और कुछ पर्यावरणीय परीक्षणों की अपार संभावनाएं हैं। क्योंकि यह आयनीकरण इकाई प्रत्येक विशिष्ट साधन के लिए एक लगाव तैयार करके अन्य स्पेक्ट्रोमीटर के साथ संगत है, पेसी को विभिन्न उद्देश्यों पर लागू किया जा सकता है।
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Disclosures
इसी लेखक को पेसी-एमएस इंस्ट्रूमेंट के निर्माता और आपूर्तिकर्ता शिमडज़ू द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Acknowledgments
हम अपनी सचिवाला सहायता के लिए पेसी-एमएस और काज़ुको सावा-नोबोरी के संचालन के लिए अयुमी इजुका को धन्यवाद देते हैं । हम इस पांडुलिपि के मसौदे के संपादन के लिए एडिंज समूह (www.edanzediting.com/ac) से ब्रोनवेन गार्डनर, पीएचडी का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
References
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