Summary
В этой статье представлены методы подготовки образцов для уникального аналитического метода в реальном времени, основанного на спектрометрии окружающей среды. Этот метод позволяет нам выполнять в режиме реального времени анализ биологических молекул in vivo без каких-либо специальных предварительных процедур.
Abstract
Масс-спектрометрия (МС) является мощным инструментом в аналитической химии, поскольку она предоставляет очень точную информацию о молекулах, таких как соотношение массы к заряду(м/з),которые полезны для вывода молекулярных весов и структур. Хотя это по существу разрушительный аналитический метод, последние достижения в технологии ионизации окружающей среды позволили нам получить данные, оставляя ткани в относительно нетронутом состоянии с точки зрения целостности. Ионизация электроспрея зонда (PESI) является так называемым прямым методом, поскольку он не требует сложной и трудоемкой предварительной обработки образцов. Тонкая игла служит сборщиком образцов, а также ионизующим излучателем. Основываясь на очень резком и тонком свойстве наконечника зонда, уничтожение образцов является минимальным, что позволяет нам приобретать молекулярную информацию в реальном времени из живых существ на месте. В этом виде мы представляем три применения метода PESI-MS, которые будут полезны для биомедицинских исследований и разработок. Один включает в себя применение к твердой ткани, которая является основным применением этой техники для медицинской диагностики. Поскольку этот метод требует только 10 мг образца, он может быть очень полезным в обычных клинических условиях. Второе применение для медицинской диагностики in vitro, где измеряется сыворотка крови человека. Способность измерять образцы жидкости также имеет значение в различных биологических экспериментах, где не может быть обеспечендостаточный объем выборки для обычных аналитических методов. Третье применение склоняется к прямому применению зондовых игл у живых животных, где мы можем получить динамику метаболитов или наркотиков в конкретных органах в режиме реального времени. В каждом приложении, мы можем сделать вывод молекул, которые были обнаружены MS или использовать искусственный интеллект для получения медицинского диагноза.
Introduction
Масс-спектрометрия (МС) - это технологическая реализация редукционизма; он сводит объект анализа к единице, которая может быть интерпретирована на основе молекулярных видов или каскадов. Поэтому это представительный метод аналитической химии. Он состоит из четырех процессов: ионизация, анализ, обнаружение и спектральное приобретение. Поскольку ионизация молекулы является первым процессом в масс-спектрометрии, она обычно ограничивает форму анализа, которые должны быть обработаны. Большинство процедур ионизации требуют разрушения структуры, морфологии и биологических процессов органических образцов в режиме реального времени. Например, ионизация электроспрея (ESI) MS требует, чтобы образцы были в жидком состоянии для эффективной ионизации1. Образцы, следовательно, должны пройти через сложный биохимический препарат, который изменяет состав молекул. Кроме того, в то время как матричная лазерная ионизация лазера (MALDI) MS может реконструировать молекулярные карты тонкой секционной ткани2,3,ее эффективность ионизации слишком низка, чтобы обнаружить все молекулы в образцах, и это особенно плохо при анализе жирных кислот. Учитывая эти ограничения, зонд электроспреп ионизации (PESI)4 может быть использован для наблюдения в режиме реального времени изменения в биологических системах на месте, не разрушая структурную целостность5, в то время как биологический организм наблюдается технически в живом состоянии. В этом случае используется очень тонкая игла, которая одновременно служит сборщиком образцов и ионного излучателя. Это означает, что сложные последовательности предварительной обработки образцов могут быть обойдёны для получения масс-спектров, отражающих молекулярные компоненты живой системы на месте.
Есть несколько других методов ионизации, которые соперничают PESI-MS. Одним из них является быстрая испаряемый ионизации масс-спектрометрии (REIMS)6. Этот метод хорошо работает во время операции, потому что он собран с электрическим ножом и собирает ионный шлейф, генерируемый во время разреза. Хотя REIMS очень полезен для операции, это по существу разрушительный метод, который требует электрической абляции тканей. Поэтому он не полезен для детального анализа клеток и тканей в подготовительном образце или в лабораторных анализах. Кроме того, поскольку он собирает большое количество шлейфа, содержащего тканевый мусор, он требует длительного обслуживания устройств после каждого использования, тем самым ограничивая использование этой машины специальными хирургическими процедурами. Аналогичный метод, называемый лазерной ионизации ионизации масс-спектрометрии (LDI-MS)7, является еще одним методом, который является неинвазивным и полезным для анализа поверхности. Поскольку этот метод хорош в сканировании поверхности образца, он достигает всеобъемлющего двумерного анализа, как MALDI изображений масс-спектрометрии8,9. Однако, поскольку LDI-MS применим только к анализу поверхности, PESI-MS является выгодным для анализа образцов, например, в ткани. Другой метод, MasSpec Pen10, было сообщено для достижения высокой специфичности и чувствительности в диагностике рака щитовидной железы, но диаметр зонда находится в порядке мм и он специфичен для анализа поверхности, а это означает, что он не может обнаружить небольшие узелки рака или глубоко локализованных поражений. Кроме того, поскольку этот метод использует микрокапиллярный канал потока, встроенный в перо зонда, необходимо принимать во внимание перекрестное загрязнение, аналогичное LDI-MS. Существуют и другие методы, которые были применены в клинических условиях, таких как поток зонда и ионизации форме тампон11, но они не являются широко распространенными.
PESI является крайней миниатюризации ESI, в котором капилляр нано-электроспреп сходится на твердой игле с наконечником кривизны радиусом в несколько сотен нм. Ионизация происходит в крайне ограниченной области кончика иглы путем формирования конуса Тейлор, на котором образцы остаются до ионизации всей жидкости на кончикезавершена 12. Если аналитик остается на кончике металлической иглы, избыточный заряд непрерывно генерируется на интерфейсе между металлической иглой и аналитиками. Поэтому последовательная ионизация молекул происходит в зависимости от их поверхностной активности. Это свойство делает кончик иглы своего рода хроматограммой, разделяющей аналиты в зависимости от их поверхностной активности. Более технически, молекулы с более сильной поверхностной активностью приходят к поверхности конуса Taylor и ионизируется более раньше чем те с более слабой деятельностью поверхности, которые придерживаются к поверхности иглы до конца процесса ионизации. Таким образом, полная ионизация всех молекул, подобранных иглой, достигается13. Более того, поскольку эта методика не предполагает добавления в образец лишнего растворителя, нескольких сотен фемтолитров достаточно, чтобы получить массу спектра достаточно прочной для дальнейшего анализа14. Эти свойства выгодны для анализа нетронутых биологических образцов. Однако основным недостатком PESI-MS является разрыв в ионизации из-за взаимного движения иглы по вертикальной оси, похожей на распиловочная машина. Ионизация происходит только тогда, когда кончик зонда достигает высшей точки, когда высота ионного илиа выравнивается по горизонтальной оси. Ионизация прекращается, в то время как игла берет образцы, и поэтому стабильность ионизации не равна той, что в обычных ESI. Таким образом, PESI-MS не является идеальным методом для протеомики.
На сегодняшний день PESI-MS применяется главным образом к анализу биологических систем, охватывающих широкий спектр областей от фундаментальных исследований до клинических условий. Например, прямой анализ тканей человека, подготовленный во время операции, смог выявить накопление триацилглицерола как в почечно-клеточной карциномы15, так и в фарингеальной плоской карциномы16. Этот метод может также измерить жидкие образцы, такие как кровь, чтобы сосредоточиться на липидном профиле. Например, некоторые молекулы были очертаны во время диетических изменений у кроликов; было сообщено, что некоторые из этих молекул уменьшилась на очень ранних стадиях экспериментов, что свидетельствует о высокой чувствительности и полезности этой системы для клинической диагностики17. Кроме того, прямое применение к живому животному позволило обнаружить биохимические изменения печени после всего лишь одной ночи поста5. Зайцу и др.18 вновь этот эксперимент5 и проанализировали метаболические профили печени почти таким же образом, с результатами, которые укрепили стабильность и воспроизводимость нашего первоначального метода. Кроме того, мы смогли различать ткани рака от окружающих нераковых печени у мышей с помощью этойтехники 19. Таким образом, это универсальный метод масс-спектрометрии, который полезен в различных условиях, как in vivo, так и in vitro. С другой стороны, модуль PESI может быть выполнен в соответствии с различными масс-спектрометрами, регулируя крепление. В этой короткой статье мы представляем основы и примеры приложений(рисунок 1), включая приложения с живыми животными5.
В соответствии с положениями и законами каждой страны некоторые части этого протокола должны быть пересмотрены в соответствии с критериями каждого учреждения. Применение к живому организму является наиболее интересным и сложным, поскольку оно может обеспечить биохимические или метаболические изменения в тканях или органах у живых животных на месте. Хотя эта заявка была одобрена институциональным комитетом по уходу за животными в Университете Яманаси, в 2013 году5, еще один раунд утверждения теперь будет необходимо из-за недавних изменений в правилах для экспериментов на животных. Поэтому целесообразно внести несколько изменений в экспериментальную схему. Что касается масс-спектров, полученных в ходе экспериментов, учитывая колебания масс-спектров между каждым измерением, то не существует системы спектрального обмена информацией, которая характерна для сообщества секвенирования нуклеотидов. Необходимо проявлять осторожность, когда оператор обрабатывает иглу, чтобы избежать несчастных случаев иглы, особенно при удалении иглы из держателя иглы. Специальное устройство для отсоединения иглы очень полезно для этой цели. Поскольку отсек модуля PESI представляет собой герметичную, закрытую камеру, утечка ионного шлейфа не происходит, если масс-спектрометр работает в соответствии с инструкциями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Институциональный комитет по уходу за животными при Университете Яманаси утвердил все протоколы и использование экспериментальных животных, изложенных в настоящем. Использование образцов человека было одобрено институциональным советом по этике при Университете Яманаси.
1. Подготовка твердой ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны храниться на льду после их удаления из животного или человеческого тела, чтобы сохранить свежесть тканей. Если измерения не сразу следуют за вскрытием, рекомендуется хранить ткани при -80 градусов по Цельсию. Не рекомендуется размещать ткани в какой-либо буфер или солин, потому что они могут извлечь определенное содержимое из ткани. Ткань, которая была исправлена с альдегидами или встроенных в парафина / воска или криогеля не подходит для измерений MS.
- Вырежьте образец ткани примерно до 2 х 2 х 2 мм с помощью скальпеля или ножа. Кроме того, выбить образец с трепан (одноразовый удар биопсии, отверстие размер 3 мм), используемых для исследования кожи. В этом случае уравновесите длину колонны до 2 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любая ткань может быть проанализирована с помощью этого метода. В этом эксперименте, печень15 и почки19, были успешно проанализированы для получения масс-спектров. Как правило, паренхимальные органы дают хорошие масс-спектры, в то время как те, которые имеют волокнистые компоненты нет. - Если ткань загрязнена кровью, кратко промойте ледяной фосфат-буферный солевой раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму посмертное повреждение тканей, завершить этот шаг, как можно скорее, при комнатной температуре. Если измерения проводятся не сразу, заморозьте ткань в жидком азоте и храните при температуре -80 градусов по Цельсию. - Поместите вырезанный или выбитый образец (примерно 10 мг) в пластиковую микротрубку и добавьте 100 кл. 50% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точный вес образцов не определяется, поскольку масс-спектрометрия, используемая в этой системе, не дает количественных данных. Приблизительно 10 мг оптимально для паренхимальной ткани. - Гомогенизировать образец с помощью микропести.
- Поместите 10 злител к скважине картриджа(рисунок 2).
- Поместите картридж в ионизацию камеры масс-спектрометра и установите зонд из нержавеющей стали, который будет использоваться для ионизации образца(рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Иглы зонда поставляются производителем. Они изготовлены из нержавеющей стали и имеют радиус кривизны около 400 нм. - Закройте крышку камеры твердо, чтобы автоматически активировать устройство безопасности.
- Запустите бортовой компьютер, нажав значок Start для анализа. Используя экранные панели, нанесите напряжение 2,3 кВ на иглу для генерации электроспрея и убедитесь, что частота иглы составляет 3 Гц.
- Подождите 30 с для измерения будет завершена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сеанс автоматически прекращается после завершения сбора данных. Качество анализа контролируется общей ионной хроматограммой (ТИК). Время измерения определяется для получения репрезентативной масс-спектра и может быть сокращено или продлено. - Утилизировать картридж и иглу в биоопасных утилизатор после измерения каждого образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только один образец может быть измерен одновременно. Нет необходимости калибровки машины перед каждым измерением; калибровка зависит от регулярного осмотра поставщиком один раз в шесть месяцев. - Проанализируйте масс-спектры и экспортируйте данные масс-спектрального текста с помощью программного обеспечения, связанного с масс-спектрометром (см. Таблица Материалов), как указано в шагах ниже(рисунок 3).
- Нажмите на файл lcd в окне файла данных программного обеспечения.
- Выберите и нажмите на один пик на окне массового спектра и автоматически изобразить извлеченную ионную хроматограмму (EIC).
- Проверьте TIC и EIC и нажмите на значок среднего спектра, чтобы выбрать окно диапазона времени для генерации массового спектра.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе молекулы-мишени появляются в соотношении массы к заряду(м/з)окна(рисунок 3). Кроме того, поскольку продолжительность ионизации на один ход движения иглы очень коротка, все полученные масс-спектры по существу усредненные спектры свыше 10 с (300 сканирований). - Создайте текстовый файл, содержащий интенсивность м/з и ион, нажав на вкладку Экспорт для дальнейшего анализа. Этот текстовый файл может храниться в любой папке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любые РНК консерванты будут влиять на родной спектральной модели образцов. Кроме того, рекомендуется обрабатывать и хранить ткани без какой-либо жидкости (например, фосфат-буферный солен), чтобы предотвратить выщелачивание молекулярных компонентов из ткани в жидкость во время хранения. В идеале используются свежие или свежие замороженные образцы без какой-либо обработки.
2. Препарат жидкости для тела (сыворотка)
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся эта процедура почти идентична той, которая используется для твердой ткани. Картридж для образца жидкости доступен у производителя. Поскольку загрязнение красными кровяными тельцами (РБК) может значительно снизить эффективность спектрального приобретения предполагаемого компонента (плазмы или сыворотки), не забудьте устранить все РБК путем центрифугинга перед измерениями.
- Возьмите 10 л образца сыворотки и положите его в микротрубку объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать как свежую, так и хранимсую сыворотку. - Добавьте 190 л 50% этанола в трубку 1,5 мл, затем вихрь в течение 2 минут при комнатной температуре.
- Центрифуги жидкости при 15000 х г в течение 1-5 мин при 4 градусах Цельсия.
- Передача 10 зликат супернатанта в колодец картриджа.
- Поместите картридж в камеру ионизации машины и установите зонд иглы из нержавеющей стали, который будет использоваться для ионизации образца(рисунок 2).
- Закройте крышку камеры твердо, чтобы автоматически активировать устройство безопасности.
- Запустите бортовой компьютер, нажав значок Start, чтобы ионизировать.
- Откажитесь от картриджа и иглы, как описано в 1.10 после проведения измерений.
- Проанализируйте полученные наборы EIC, как указано ниже(рисунок 3).
- Откройте файл lcd в браузере данных.
- Нажмите на один пик для отображения TIC и EIC.
- Выберите окно диапазона времени для генерации масс-спектров с помощью значка среднего спектра.
- Экспортировать генерируемый файл, содержащий как м/з, так и интенсивность иона соответствующего пика, нажав на вкладку экспорта на мониторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура может быть применена к слюне, моче и другим жидкостям организма, а также.
3. Подготовка к in vivo PESI-MS в живом организме
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе вводится приложение для мониторинга метаболического профиля 5-Флуоро-2'-деоксиюридин (5-FdU) в живой модели мыши. Используйте асептические условия во всем.
- Влить 100 мМ раствор5-ФЗ в хвостовую вену 2-месячной мыши (примерно 20 г веса).
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует не предпочтение для секса, возраста или мыши штамма. Хотя этот протокол был утвержден в то время, когда мы проводили эксперимент5, осуществимость этого эксперимента зависит от этических ограничений страны, в которой он будет выполняться. - Анестезия мыши после утвержденного протокола по уходу за животными. Оцените глубину анестезии по отсутствию реакции на щипать хвост.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если использование пентобарбитала натрия не допускается комитетом по этике для экспериментов на животных, могут быть использованы альтернативные методы, такие как гидрохлорид кетамина. - Бритье брюшной полости с помощью электрической бритвы и применять ветеринарную мазь к глазам.
- Положите обезопаживающую мышь в положение на спине и закрепите лапы на пластиковую пластину с помощью ленты для починки. Скраб хирургического сайта с скрабы 70% алкоголя в три раза.
- Разрежьте брюшную полость ножницами. Во-первых, вырезать кожу боковой (10 мм) от чуть выше диафрагмы. Боковой разрез мышцы брюшной стенки тела и брюшной полости (около 7 мм) и держать рану открытой с помощью нержавеющей проволоки подвергать поверхности печени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует нет необходимости perfuse поверхности печени. - Нанесите кончик зонда иглы на поверхность печени. Отрегулируйте глубину иглы примерно до 0,5 мм глубиной, чтобы оптимизировать эффективность ионизации, проверяя TIC и спектральный узор одновременно. Установите высокое напряжение до 2,3 кВ и частоту до 3 Гц на экране панели управления.
- Удалите животное из пластиковой пластины.
- Шов раны с помощью хирургического шова кишечника и вернуть мышь в клетку. Не оставляйте мышь без присмотра, пока она не пришла в сознание, чтобы поддерживать суровое recumbency. Не возвращайте мышь в компанию других животных, пока она полностью не восстановится.
- Выполните временной курс интенсивности ионов в EIC и процедуру изображения EIC как в 1.11.1 до 1.11.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как показано на рисунке 3, данные, полученные методом PESI-MS, являются масс-спектрами, м/з которых в этой системе колеблется от 10 до 1200. В то время как можно обнаружить молекулы до м / z 2000, было несколько пиков, полученных с помощью этой техники в диапазоне массы м / z 1200. Поэтому мы проанализировали пики от м/з от 10 до 1200. Были заметные группы пиков вокруг m/z 800 и 900; первый представляет собой компоненты клеточной мембраны, такие как фосфатидил холин (PC) видов, а второй представляет триацил глицерол (TAG). На рисунке 4 показаны масс-спектры из нормальной человеческой почки и карциномы почечных клеток (RCC). Масс-спектры были получены с помощью метода прямой ткани, объясняемого в протоколе 1. Поскольку в цитоплазме аккитоплазма аккумулированного типа ячеек накапливается TAG, группа спектров вокруг м/з 900 очень выражена. Результат на рисунке 4 был получен методом извлечения, введенным на рисунке 1 для твердых образцов.
Поскольку липидный метаболизм гепатоцеллюлярной карциномы изменяется во время прогрессирования заболевания20,можно контролировать стадии заболевания путем рутинной биопсии в сочетании с PESI-MS. В результате на рисунке 5 показаны различия в спектральной картине между нормальной тканью печени и HCC. Особенно, Есть несколько замечательных спектров TAG в HCC. Если разрешение масс-спектрометра превосходит, не исключено, что молекулярная аннотация каждого спектра позволит выяснение молекулярного механизма рака, а также нормальной клеточной физиологии.
Мониторинг метаболизма лекарств в режиме реального времени может проводиться с помощью PESI. В наших экспериментах фармакодинамика антионкотического агента 5-FdU контролировалась более чем на 10 с после введения через хвостовую вену мыши. Очень быстрое обнаружение спектра наблюдалось всего через несколько секунд после введения препарата(рисунок 6),подразумевая быструю транспортировку препарата через кровоток в печень. Интенсивность аддуктов натрия 5-FdU ослабла с кратким дефектом ионного сигнала в записи примерно на 6-7 с после начала измерения. Это было связано с различной глубиной иглы PESI в печеночной паренхиме, которая была результатом движения тела анестезирующей мыши. Поэтому необходимо позаботиться о том, чтобы отрегулировать глубину иглы PESI для измерения в реальном времени живых животных. Существует нет рекомендуемого способа найти оптимальную глубину иглы, но это становится очевидным с практикой.
Образцы крови трех особей были проанализированы PESI-MS. В этом случае 10 л сыворотки были смешаны с 190 зл на 50% этанола, а затем использованы для анализа PESI-MS. В то время как общие спектральные модели, как представляется, разделяют несколько общих пиков(Рисунок 7), Есть много минутных различий в спектрах от этих трех человек. Они являются отпечатком пальца каждого человека с точки зрения метаболической деятельности. Для получения подробной информации о молекулярной идентичности необходимо использовать высококлассную машину. Масс-спектрометр, используемый в экспериментах, не обеспечивал достаточно высокого разрешения для идентификации молекул.
Если есть загрязнение полимерных соединений, оригинальные спектры на рисунке 4 привести к накладных периодических и заметных пиков, которые размывают спектры из первоначального образца (Рисунок 8). Чтобы продемонстрировать это экспериментально, мы добавили полипропилен глицерол триол (PPGT) до 2,5%, чтобы воспроизвести случай загрязнения. Почти все конкретные спектры видели на рисунке 8 были замаскированы добавлением PPGT.
Рисунок 1: Схематический обзор потока подготовки образца. Для образцов специализированный картридж идеально подходит для стабильного сбора данных. Анализ жидкого образца является самым простым способом выполнения PESI-MS, просто поместив раствор в картридж. Есть два метода для применения этого метода к твердой ткани. Прямое применение PESI к ткани очень легко и быстро, в то время как метод экстракции позволяет достичь гораздо более стабильного приобретения спектра в зависимости от образца видов. В этой процедуре небольшой кусочек образца ткани помещается в микротрубку со 100 зл и 50% этанола и гомогенизирован с микропестом. 10 злитрологового гомената затем используется для масс-спектрометрии. В случае анализа живого животного, 30 л 50% этанола помещается на серосальную поверхность органа-мишени с последующим измерением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Обзор и основные компоненты PESI-MS. Масс-спектрометр, оснащенный модулем PESI. Часть ионизации устанавливается в закрытой камере, где размещены ионный впуск, держатель иглы и держатель образца. Игла готова, а одноразовая игла из нержавеющей стали крепится к держателю иглы. Он устанавливается в масс-спектрометре сразу после размещения картриджа образца в камере. Средний угол кривизны иглы 400 нм. Картридж для размещения образца одноразовый и изготовлен из пластиковых полимеров. Он имеет небольшой колодец для размещения жидкого образца (красная стрелка). После ввода твердого образца в колодец, кассета складывается, чтобы ущипнуть образец и запечатать колодец. Для жидкого картриджа образец, другой используется, что не требует складывания, и это рекомендуемая версия, которая превосходит твердых образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Графический пользовательский интерфейс (GUI) для PESI-MS. Все процедуры генерации масс-спектров из общей ионной хроматограммы (ТИК) могут быть выполнены с помощью связанного с ним программного обеспечения. После открытия lcd-файла в браузере данных можно отобразить TIC, а также выбрать временной диапазон для генерации масс-спектров. Сгенерированные масс-спектры могут экспортироваться в виде текстовых данных, содержащих как соотношение массы к заряду(м/з),так и интенсивность иона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Рак почечных клеток человека показывает характерные пики нейтральных липидов. Были относительно сильные пики в спектрах из ткани карциномы почек человека (RCC), которые не были выявлены в окружающих нераковых тканей. Эти пики в основном представляют триацилглицерол (TAG) на уровне около массы к зарядке соотношение(м /z) 900. Спектральное приобретение осуществлялось с помощью положительного ионного режима путем прямого анализа. Высокое напряжение было установлено до 2,3 кВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Пример данных, полученных в нормальных тканях печени и гепатоцеллюлярной карциномы человека (HCC). Верхняя панель изображает спектры из ткани печени человека, где неопластического поражения не присутствовал, но от пациента с хроническим гепатитом и циррозом печени. Нижняя панель показывает усредненные спектры HCC от того же пациента. С первого взгляда, в то время как эти два имеют очень похожие спектральные модели, Есть много небольших различий в спектральной модели. Abscissa показывает соотношение массы к заряду(м/з),а ординатор изображает относительную интенсивность каждого спектра. Приобретение спектра было выполнено с использованием положительного режима иона после извлечения ткани, как показано на рисунке 2C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Измерения метаболизма наркотиков в режиме реального времени. Метаболические изменения в 5-FdU вводят внутривенно в хвостовой сосуд мыши. Очень быстрое и чувствительное обнаружение 5-FdU с аддуктом натрия было достигнуто в печени на месте. Из-за нестабильной ионизации во время измерения, прекращение сигнала может быть отмечено на уровне около 6-7 с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Примеры данных от трех человек. Сыворотка человека из трех человек была проанализирована с помощью PESI-MS. Между индивидуумами существовали явные различия в спектральных моделях. Данные были получены в режиме положительного иона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Полимерные соединения мешают точному сбору данных. Из-за периодического появления спектральных пиков, наложенных на исходный образец, становится трудно точно интерпретировать данные. В этом случае спектры, полученные из полипропилена триоль глицерол (PPGT) появляются как шумные наложения. Эти соединения, обычно используемые для калибровки, маскируют оригинальные спектры из печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя PESI является производным ESI для масс-спектрометрии4,это наиболее выгодно для мониторинга в режиме реального времени метаболомики, а также для анализа биохимических реакций без выполнения каких-либо сложных или трудоемких предварительных процедур5,14,15,17. Это простой и мгновенный метод масс-спектрометрии, который может быть применен к интегрированному состоянию живых организмов. Так как он не требует сложных каскадов образцов предварительной обработки, есть гораздо больше возможностей для оценки молекулярного состава всего образца, потому что мы избегаем любой возможной потери образца, которые могут произойти в обычных ESI, что требует сложных шагов образца предварительной обработки с использованием большого количества органических растворителей. Таким образом, PESI позволяет нам получить гораздо больше информации от образца, если все условия должным образом контролируются.
Сначала нам нужно упомянуть некоторые технические аспекты, необходимые для получения хороших результатов при рассмотрении анализа PESI-MS. Наиболее важным фактором в PESI является поддержание эффективности ионизации во время анализа. Для этого рекомендуется отрегулировать и оптимизировать расстояние между кончиком иглы и поверхностью образца, создать стабильный ТИК, ссылаясь на монитор компьютера во время анализа. Для этого необходимо поэтапно изменить глубину иглы для достижения максимального ТИК. Поскольку продолжительность ионизации относительно коротка по сравнению с ESI, PESI не идеально подходит для воспроизводства или количественной оценки. Во-вторых, поскольку форма наконечника иглы играет очень важную роль в ионизации, образуя идеальный конус Тейлора, который служит источником иона, необходимо позаботиться о том, чтобы не деформировать кончик иглы. Деформация наконечника может привести к снижению эффективности ионизации.
Хотя PESI является выгодным, поскольку он может быть применен непосредственно к свежим образцам (например, печени, почек и мозга) и живого организма без специального лечения, он относительно чувствителен к другим экзогенным загрязнительтам, потому что он может ионизировать почти все компоненты, содержащиеся в жидкости21,22,23. То есть, недостаток преимущества пропуска образца предварительной обработки означает, что PESI-MS находится в невыгодном положении в нескольких ситуациях, которые часто встречаются в биологических экспериментах. Как поясняется в разделе протокола, PESI чувствителен к загрязнению РНК-консервантами, альдегидами и полимерными соединениями, такими как криогели, часто используемые для гистологического приготовления. Сгустки крови могут прилипать к игле PESI и часто маскируют предназначенные спектры. Более того, гемолиз из РБК высвобождает гемоглобин, а разъединенный ион феррика порождает гораздо более сильные спектры, чем те, которые получены из предполагаемых анализов. Полимерные соединения также дают периодические спектральные пики, которые накладывают спектры, полученные из предполагаемых анализов, что делает его гораздо труднее интерпретировать реальные данные из-за шума (Рисунок 8). Чтобы избежать каких-либо проблем при приобретении масс-спектров, желательно следовать нашему протоколу, принимая на себя особое внимание к загрязнению. В этой связи применение PESI в некоторых случаях ограничено.
Еще одним недостатком PESI является относительно нестабильный процесс ионизации, который требует от нас корректировки глубины зонда иглы к анализам. Кроме того, этот метод может охватывать очень ограниченную область в одном анализе. Из-за очень небольшого размера кончика иглы, который непосредственно применяется к ткани, анализ PESI-MS не столь всеобъемлющим, как 2D-анализ, который может быть достигнут с MALDI-TOF MS на основе визуализации масс-спектрометрии или DESI основе изображения7,8. PESI может, однако, реконструировать изображение формирования гиппокампа, хотя это занимает несколько часов23, потому что 2D сканирование образца занимает много времени, главным образом из-за нестабильной эффективности ионизации этого метода. Принимая это во внимание, масс-спектральной визуализации PESI-MS не является ценным приложением.
Что касается электрохимических свойств PESI, объем и концентрация образца, который придерживается кончика иглы имеет решающее значение18, так как эффект подавления несколько ослаблен за счет сокращения размера электроспрея. Учитывая, что PESI является миниатюризацией ESI, образцы в идеале должны быть разбавлены, чтобы избежать формирования шлама на кончике. Таким образом, добавление примерно 30 зЛ 50% этанола необходимо для достижения эффективной ионизации при непосредственной ткани метод используется(рисунок 2B). Это максимизирует эффективность ионизации и обеспечивает почти полную ионизацию молекул, прикрепленных к кончику иглы.
Выбор наиболее подходящего метода обработки данных очень важен при использовании этой системы24. Что касается внедрения машинного обучения для любого диагноза заболевания, то для создания базы данных необходимо установить ссылку на классификацию или классификацию заболеваний7. Например, мы использовали аппарат поддержки переносчика или логистической регрессии, чтобы поставить диагноз первичных злокачественных новообразований печени25.
PESI-MS является универсальным и простым методом, который имеет большой потенциал для скрининга на наркотики, допинг-тесты, тесты на безопасность пищевых продуктов сельскохозяйственной продукции26, и некоторые экологические тесты. Поскольку этот блок ионизации совместим с другими спектрометрами, подготавливая вложение для каждого конкретного инструмента, PESI может быть применен к различным целям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Соответствующий автор был профинансирован Shimadzu, производителем и поставщиком инструмента PESI-MS.
Acknowledgments
Мы благодарим Аюми Иидзуку за работу PESI-MS и Кадзуко Сава-нобори за ее секретарскую помощь. Мы благодарим Бронвена Гарднера, доктора философии, из Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) за редактирование проекта этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
References
- Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
- Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).
- Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).
- Balog, J., et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).
- Boughton, B. A., Hamilton, B. Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).
- Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).
- Sugiyama, E., Setou, M. Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).
- Zhang, J., et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system. Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).
- Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry. Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).
- Chen, L. C., et al. Characterization of probe electrospray generated from a solid needle. Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Yoshimura, K., et al. Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).
- Ashizawa, K., et al. Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).
- Johno, H., et al. Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 14, 38 (2018).
- Zaitsu, K., et al. Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis. Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).
- Yoshimura, K., et al. Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique. Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).
- Nakagawa, H., et al. Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma. Cancers. 10, 447-461 (2018).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal. Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).
- Chen, L. C., et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe. Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor. Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).
- Hiraoka, K., et al. Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).
