Summary
Dit protocol biedt een methode om het genereren van gedefinieerde heterozygoot of homozygoot nucleotide veranderingen te vergemakkelijken met behulp van CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen.
Abstract
Menselijke pluripotente stamcellen bieden een krachtig systeem om de genfunctie te bestuderen en specifieke mutaties te modelleren die relevant zijn voor de ziekte. Het genereren van precieze heterozygoot genetische modificaties is uitdagend als gevolg van CRISPR CAS9 gemedieerde Indel vorming in het tweede allel. Hier demonstreren we een protocol om deze moeilijkheid te helpen overwinnen door twee reparatie sjablonen te gebruiken waarin slechts één de gewenste sequentie wijziging tot uitdrukking brengt, terwijl beide templates stille mutaties bevatten om hersnijden en Indel vorming te voorkomen. Deze methodologie is het meest voordelig voor genbewerkings coderings gebieden van DNA om isogene controle en Mutant menselijke stamcellijnen te genereren voor het bestuderen van menselijke ziekten en biologie. Daarnaast is optimalisatie van transfectie-en screenings methodieken uitgevoerd om de arbeid en de kosten van een genbewerkingsexperiment te verminderen. Over het algemeen is dit protocol algemeen toepasbaar op vele genoom bewerkings projecten met gebruikmaking van het menselijke pluripotente stamcel model.
Introduction
Menselijke embryonale stamcellen (hescs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (ipscs) zijn waardevolle hulpmiddelen voor het modelleren van menselijke ziekten als gevolg van hun vernieuwings capaciteit, met behoud van de mogelijkheid om celtypen van verschillende lijn afstanden te genereren1,2 ,3,4. Deze modellen openen de mogelijkheid om de genfunctie te interromen en te begrijpen hoe specifieke mutaties en fenotypes gerelateerd zijn aan verschillende ziekten5,6. Echter, om te begrijpen hoe een specifieke wijziging is gekoppeld aan een bepaald fenotype, is het gebruik van een gepaarde isogene controle en Mutante cellijnen belangrijk om te controleren op lijn tot lijn variabiliteit7,8. Transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen (TALENs) en zink vinger nucleasen zijn gebruikt voor het genereren van inbrengen of verwijderen (indels) mutaties in diverse genetische modellen, met inbegrip van primaire cellen; maar deze nucleasen kunnen omslachtig te gebruiken en duur9,10,11,12,13,14. De ontdekking van de geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalings (CRISPR)-CAS9 Nuclease heeft het veld veranderd als gevolg van efficiëntie in Indel-vorming in vrijwel elke regio van het genoom, eenvoud van gebruik en reductie in kosten15 , 16 , 17 , 18 , 19.
Een uitdaging bij het gebruik van de op crispr CAS9 gebaseerde genoom Editing-technologie is het genereren of corrigeren van specifieke mutaties in één allel zonder een Indel-mutatie te creëren in het tweede allel20. Het belangrijkste doel van dit protocol is om deze uitdaging te overwinnen door gebruik te maken van twee enkel-streng oligonucleotide (ssODN) reparatie templates om Indel vorming in het tweede allel te verminderen. Beide ssODNs zijn ontworpen om stille mutaties te bevatten om hersnijden door de CAS9 Nuclease te voorkomen, maar slechts één bevat de verandering van belang. Deze methode verhoogt de efficiëntie van het genereren van een specifieke heterozygoot genetische modificatie zonder het induceren van Indel vorming in het tweede allel. Met behulp van dit protocol tonen genbewerkingsexperimenten in zes onafhankelijke genomische locaties de precieze introductie van de gewenste genomische verandering in één allel zonder Indel-vorming in het tweede allel en treedt op met een totale efficiëntie van ~ 10%. Het beschreven protocol is aangepast van Maguire et al.21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ontwerp en constructie van gids RNA (gRNA)
Opmerking: elke gRNA bestaat uit 2 60 base pair (BP) oligonucleotiden die zijn gegloeid om een 100 BP dubbel strandde (DS) oligonucleotide (Figuur 1a-C) te genereren. De tijdlijn voor gRNA ontwerp, generatie en testen snijefficiëntie is ongeveer 2 weken (Figuur 2).
- Selecteer het DNA-gebied van belang om genoom te worden bewerkt en Identificeer 3-4 23 BP-sequenties die passen bij het formaat, 5 '-G (N19) NGG-3 '. Deze sequenties moeten binnen 20 BP van het interessegebied liggen.
Opmerking: targeting kan worden uitgevoerd op de Sense-of anti-Sense-streng. - Evalueer de gRNA-sequenties voor genomische redundantie en niet-doel waarschijnlijkheid met behulp van een resource zoals CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
- Neem de 20 BP doel sequentie (met uitzondering van het protospacer aangrenzend motief of PAM) op in 2 60-Mer oligonucleotiden zoals afgebeeld (sequenties zijn 5 ' tot 3 ' en rood en groen zijn omgekeerde aanvullingen zoals weergegeven in Figuur 1C).
- Bestel de 2 60 BP oligonucleotiden van de leverancier naar keuze. Als de oligonucleotiden eenmaal zijn ontvangen, hervat u elk tot een eindconcentratie van 100 μM in ddH2O. Maak een werkende voorraad van 10 μM.
- Anneal de twee oligonucleotiden en het genereren van een 100 BP dsDNA fragment met behulp van DNA-polymerase (tabel van materialen). Combineer 5 μL van 10 μM voorwaarts oligonucleotide en 5 μL 10 μM reverse oligonucleotide in een polymerase kettingreactie (PCR) strip buis en inincuberen bij 95 °C gedurende 5 min. laat de reactie gedurende 10 minuten afkoelen bij kamertemperatuur (RT).
- Stel de PCR in zoals beschreven in tabel 1. Voer PCR-versterking uit in een thermische cycler met behulp van de parameters die worden beschreven in tabel 2.
- Visualiseer de PCR-producten op een 1,5% (w/v) ethidiumbromide bromide (etbr) agarose gel elektroforesed bij 80-100 V voor 40 min. accijnzen de 100 BP band (Figuur 3a), GEVISUALISEERD op een LED lichtbak, van de gel met een scheermesje en zuivert met een gel extractie Kit (tabel van materialen).
2. ontwerp van PCR-primers voor screening
- Voer screening van het bewerkte DNA uit met behulp van voorwaartse en omgekeerde PCR-primers die specifiek zijn ontworpen om een 400-500 BP-regio van het gen van belang te versterken (tabel 2). Gebruik DNA geïsoleerd van elke controle-iPSC-lijn om een schone ampliconlengte voor Temp te bevestigen bij het uitvoeren van de screening-PCR.
- Visualiseer PCR-producten op een 1,5% (w/v) gel na Elektroforese bij 80-100 V gedurende 1 uur.
Opmerking: Sequentiëren van bewerkte klonen wordt uitgevoerd met behulp van een geneste primer die is ontworpen na bevestiging van de screening primer set. Monsters worden verzonden naar een commerciële bron voor sequentiëren.
3. bereiding van gRNA_cloning vector plasmide
- Om de kloon vector te linealiseren, neemt u een centrifugebuis van 1,5 mL en voegt u 1-5 μg DNA van de gRNA_cloning vector toe, samen met 4 μL van de AFLII-beperkings enzym buffer en 1,5 μl AFLII-restrictie-enzym. Breng de reactie op 24 μL ddH2O. Meng de reactie door Pipetteer op en neer. Incuberen bij 37 °C 's nachts (O/N).
- Electrophorese op een 1% agarose gel bij 80-100 V voor 1 h en accijnzen banden (verwachte band grootte is ~ 3519 BP).
- Extract en zuiveren zoals in stap 1,6.
4. assemblage van gRNA vector
- Reacties instellen en DNA-fragmenten samenstellen met behulp van de montagekit (tabel met materialen) bij 1:5 ratio's van AFLII verteerd grna klonen vector naar 100 BP gel gezuiverde wisselplaat, zoals beschreven in tabel 3.
- Incuberen de reactie bij 50 °C gedurende 15 min. Verdun de reactie 1:3 in ddH2O en gebruik 3 μL voor bacteriële transformatie volgens de instructies van de fabrikant (tabel met materialen). Plaat cellen op kanamycine LB/agar platen.
- Kies 3-5 kolonies per gRNA. Inoculeren elke kolonie in 4 mL LB en groeien O/N bij 37 ° c in een orbitaal schudden incubator.
- Reinig plasmide DNA met behulp van een miniprep plasmide isolatiekit en volg elke gRNA met behulp van de volgende primers om een succesvol klonen te garanderen: doorsturen: GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG; Omgekeerde: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.
5. test de snijefficiëntie van gRNA
- Plaat hESCs op bestraalde muriene embryonale fibroblasten (Mef's) in een 6-put plaat, zoals eerder beschreven21. Wanneer de cellen 70-80% confluency bereiken, bereidt u de transfectie Master mix voor in tabel 4.
- Meng door pipetteren en inbroed bij RT gedurende 15 min. Voeg druppelsgewijs toe aan de cellen en inincuberen bij 37 °c gedurende 48 uur (met een media verandering na 24 uur).
- Oogst cellen voor sortering na 48 h.
- Verwijder MEFs enzymatisch (tabel met materialen) met een incubatie van 3 min RT.
- Spoel cellen 1x met hesc medium (tabel 5) en schraap in hesc medium + 10 μM Y-27632 dihydrochloride (tabel van materialen).
- Pellet cellen bij 300 x g gedurende 3 minuten en respenderen in 0,5 ml hesc medium + 10 μM Y-27632 dihydrochloride.
- Filtreer in een 5 mL buis door een 35 μm celstrainer dop.
- Met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), poort op levende cellen en sorteer de groene fluorescerende proteïne (GFP) positieve cellen.
- Breng maximaal 1,5 x 104 gesorteerde cellen rechtstreeks over in een schotel van 10 cm2 met 1:3 Basement membraan matrix (tabel met materialen) en bestraalde mef's in hesc-medium (tabel 5) met Y-27632 dihydrochloride.
- Verander medium dagelijks met behulp van de hESC medium (tabel 5) zonder Y-27632 dihydrochloride en handmatig te plukken klonen na 10-15 dagen, wanneer kolonies zijn ~ 1 mm in diameter.
- Met behulp van een P200 pipet en Microscoop, zorgvuldig schrait een enkele kloon en trek cellen in de pipet.
- Dispergeren de cellen door zachtjes pipetteren 3-4x in een 96 goed bord in het medium opgesteld met de kolonie.
- Afdoseren van PCR-strip buizen voor screening en pellet de cellen door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 5 min. Kies 20 kolonies per grna.
6. kloon screening
- Isoleer DNA door celpellets te inbrokkelen in 20 μL proteïnase K-buffer (tabel 5) (1 uur bij 55 °c en 10 min bij 95 °c) en Vortex krachtig. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 5 minuten en vang het supernatant op.
- Voer screening-PCR (sectie 2) uit in een totaal volume van 20 μL met behulp van een Master-Mix, inclusief primers die zijn ontworpen om het gebied van belang te versterken en 5 μL van de proteïnase K Digest. Gebruik genomisch DNA geïsoleerd van de cellijn die genbewerkt was als een controle.
- Evalueer grootte wijzigingen van PCR-producten na 1 uur Elektroforese bij 70-90 V op een 2,5% (w/V) agarose-gel (Figuur 3B, C). Elke grootte verschil is indicatief voor decolleté.
7. precieze genoom bewerking in pluripotente stamcellen met behulp van enkele streng oligo DNA (ssODNs)
- Ontwerp 100 BP ssODNs gecentreerd rond de meest efficiënte gRNA-sequentie, vastbesloten om de beste snijefficiëntie te hebben.
- Voorkom opnieuw splijting van de hercombineerde ODN door het introduceren van stille mutaties in de gRNA-sequentie. Een enkele stille mutatie in de PAM-reeks volstaat, maar als dit niet mogelijk is, zullen 3-4 stille mutaties werken.
Opmerking: om de screening van gerichte klonen te vergemakkelijken, is de introductie van een beperkings site binnen ~ 20 BP van de gRNA-reeks ideaal. - Ontwerp een ODN met de gewenste basis wijziging (en) om de mutatie van belangstelling te creëren en een ODN zonder de basis wijziging (en).
Opmerking: deze wijzigingen mogen niet meer dan ~ 20 BP van de voorspelde CRISPR/CAS9 cut site, als recombinatie daalt aanzienlijk op grotere afstanden. - Bestel de twee ssODNs van de leverancier van keuze en respendeer in water om 1 μg/μL voorraden te maken. Winkelvoorraden bij-20 °C.
8. transfection Setup
- Voor het transfect van de ssodn en de crispr CAS9 plasmiden, plaat de doelcel lijn in een 6-well gerecht op bestraalde mefs om 70-80% confluentie te bereiken na een incubatie van O/N.
- De transfectie reactie instellen zoals beschreven in tabel 6. Meng de reactie door pipetteren en incuberen gedurende 15 minuten bij RT. Voeg het transfectie-reactiemengsel druppelsgewijs toe aan de cellen.
- Na 48 h, bereidt u de cellen voor op celsortering zoals beschreven in paragraaf 5,3.
- Kies kolonies ~ 10 dagen na het bekleden van enkele cellen met een pipet van 200 μL. Breng 100 μL cellen over naar een put van een 24-of 48-goed plaat die eerder is bekleed met gelatine en bestraalde Mef's in hESC-medium met Y-27632 dihydrochloride. Gebruik de resterende 100 μL voor DNA-isolatie zoals beschreven in rubriek 6.
9. controle op mutaties in enkele kolonies
- Om te controleren op een geslaagde integratie van de ssODN, neemt u 5 μL DNA geïsoleerd van elke kolonie om PCR uit te voeren met behulp van de screenings primers die zijn ontworpen in sectie 2. Reinig de PCR-producten (tabel met materialen) en bereid de vergisting van het restrictie enzym voor met behulp van de unieke enzym site die in de ssodn is gemaakt.
Opmerking: deze spijsvertering omvat ook de restrictie-enzym buffer en de aanbevolen concentratie van het beperkings enzym van de fabrikant in een volume van 40 μL. - Meng de reactie door pipetteren en inbroed op de aanbevolen temperatuur van de fabrikant voor 1-3 h.
- Visualiseer de verteerde PCR-producten op een 1,5% (w/v) EtBr agarose gel elektroforesed bij 80-100 V voor 40 min. Als er een succesvolle integratie van de ssODN heeft plaatsgevonden, volg dan specifieke mutaties met behulp van een geneste primer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generatie gRNAs en screening voor indels
Elke gRNA wordt gekloond in een plasmide vector en uitgedrukt met de promotor U6. Het AFLII restrictie-enzym wordt gebruikt voor het linealiseren van het plasmide (addgene #41824) en bevindt zich na de promotor U6. De 100 BP-band gegenereerd na het gloeien van de 2 60 BP oligos wordt gekloond in de gRNA expressie vector met behulp van de DNA-verzameling. Zodra de gRNA plasmiden worden gegenereerd, worden ze omgezet in hESCs of iPSCs samen met een CRISPS CAS9 GFP plasmide (addgene #44719). De GFP +-cellen worden na 2 dagen gesorteerd om te verrijken voor getransfunde cellen en verguld (zie rubriek 5). Na 10-14 dagen worden eencellige kolonies geplukt en gebruikt om DNA te isoleren op het scherm voor Indel-vorming die voor elke gRNA wordt gegenereerd. Een PCR-versterking met primers die de gRNA-site beslaan, wordt gebruikt om Indel-vorming te visualiseren met behulp van een 2,5% (w/v) agarose-gel met EtBr, elektroforesed bij 70-90 V voor 1 uur.
Generatie van 100 BP ssODN om specifieke mutaties in te voeren
Twee ssODN oligos zijn ontworpen rond de gRNA met de meest efficiënte snijden. Elke gRNA is 100 BP en bevat stille mutaties, bij voorkeur bij de PAM-reeks, om hersnijden te voorkomen (figuur 4a). Een stille mutatie in de PAM-reeks kan een unieke beperkings site genereren, die helpt bij het scherm voor een geslaagde integratie in één of twee allelen (figuur 4b).
resultaten van de ssODN-recombinatie
Met dit protocol wordt de frequentie van targetinggebeurtenissen voor zes verschillende genen die de twee ssODN-benadering gebruiken, weergegeven in afbeelding 5. Door de genomische modificatie op de gRNA-site in beide allelen te onderzoeken, werden verschillende uitkomsten verwacht, waaronder recombinatie van de wild type (WT) ssODN, de Mutante ssODN en Indel-formatie. De klonen waarin slechts één allel recombinatie had ondergaan, de meest voorkomende uitkomst was Indel vorming in het tweede allel (10-42%). De klonen die de integratie van de ssODNs in beide allelen had geleid tot drie verschillende uitkomsten: 1) integratie van de WT ssODN in beide allelen (0-8%), 2) integratie van de Mutante ssODN in beide allelen (0-25%), en 3) integratie van zowel de WT en Mutant ssODN WT (8-21%).
Figuur 1: overzicht van de gRNA-generatie. (A) in het gebied van belang, ontwerp vier grnas eindigend in GG die niet meer dan 20 BP uit elkaar. B) elke grna van 23 BP heeft een pam-sequentie van NGG aan het einde van de 3. C) de 60 BP-primers bestaan uit een 40 BP-sequentie die complementair is aan de grna-backbone plasmide en de 20 BP grna-sequentie zonder de pam-reeks. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: protocol tijdlijn voor gRNA generatie en kloon screening. De tijdlijn voor het genereren van gRNA en het screenen van klonen wordt weergegeven. Het ontwerpen en klonen van grna Expression plasmiden duurt ongeveer een week. Ongeveer 48 uur na transfectie in menselijke PSCs, GFP + cellen worden gesorteerd en verguld bij het beperken van verdunning. Kolonies moeten zichtbaar zijn tussen 7-10 dagen en ongeveer dag 20, klonen kunnen worden geplukt voor screening, uitbreiding en sequentie bevestiging. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: gRNA-test voor snijefficiëntie. A) voorde grna-constructie wordt een 100 BP-band uit een 1,5% agarose-gel uitgesneden. B) na celtransfectie wordt de validering van grna-snijden gevisualiseerd met behulp van een 2,5% agarose-gel. Een 180 BP PCR-product wordt gebruikt om te controleren op Indel-vorming waarbij een ongesneden controle en verschillende klonen worden geanalyseerd voor band verschuivingen indicatief voor Indel-vorming. C) verschillende grna's kunnen verschillende snijefficiëntie hebben. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: het genereren en screenen van mutaties met behulp van twee ssODNs. A) om CRISPR CAS9 opnieuw snijden van de bewerkte allelen te voorkomen, kan de pam-sequentie worden gewijzigd met behulp van een G naar een stille mutatie. Deze wijziging voegt een unieke EcoRI-beperkings site toe die kan worden gebruikt voor screening. Naast deze stille mutatie bevat de Mutante ssODN de gewenste basis verandering. B) screening op oligonucleotide recombinatie met behulp van EcoRI restrictie enzym spijsvertering kan resulteren in drie mogelijke uitkomsten: geen snijden vertegenwoordigd door een WT band op ~ 650 BP, recombinatie in één allel vertegenwoordigd door een Onbesneden band van 650 BP en twee kleinere banden of invoeging in beide allelen vertegenwoordigd door alleen kleinere bands. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 5: ssODN-integratie-efficiëntie en resultaten. De integratie-efficiëntie en uitkomsten van de twee ssODN-aanpak werden bepaald door het analyseren van zes verschillende genen. Als slechts één ssODN geïntegreerd, Indel vorming werd meestal gedetecteerd in de andere allel. Als twee ssODNs geïntegreerd, drie mogelijke uitkomsten zijn gedetecteerd, zoals wordt weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Reagens | Volume (μL) |
| dNTPs (10 mM) | 0,4 |
| Taq polymerase | 0,2 |
| PCR-buffer | 4,0 |
| Gloeide oligos (10 μM) | 10,0 |
| ddH2O | 5,4 |
Tabel 1: gRNA klonen van PCR-voorwaarden.
| PCR-programma | |
| Stap 1 | 98 °C gedurende 30 s |
| Stap 2 | 98 °C gedurende 10 s |
| Stap 3 | 55 °C gedurende 20 s |
| Stap 4 | 72 °C gedurende 30 s |
| Stap 5 | Herhaal stap 2 − 4 gedurende 30 cycli |
| Stap 6 | 72 °C gedurende 5 min |
| Stap 7 | Vasthouden bij 4 °C |
Tabel 2: PCR-fiets parameters.
| Reagens | Volume (μL) |
| gelineariseerde grna vector met aflii (d.w.z. 50 ng/μL) | 1,0 |
| 100 BP-DNA (d.w.z. 250 ng/μL) | 1,0 |
| Master Mix 2x | 10,0 |
| ddH2O | q.s. tot 20 |
Tabel 3: gRNA assemblage reactie condities.
| Reagens | Bedrag |
| DMEM/F12 | 50,0 μL |
| pCas9_GFP vector (addgene plasmide 44719) | 0,5 μg |
| gRNA plasmide | 0,5 μg |
| lipide transfectie reagens | 3,0 μL |
Tabel 4: celtransfectie Master mengsel.
| hESC medium | |
| Reagens | Eindconcentratie |
| DMEM/F12 | |
| Vervanging van het serum (KDR) | 15% (v/v) |
| Niet-essentiële aminozuren | 100 μM |
| Natrium pyruvaat | 1 mM |
| Glutamine | 2 mM |
| β-mercaptoethanol | 0,1 mM |
| bFGF Human (basis fibroblast-groeifactor) | 10 ng/mL |
| 10x proteinase K buffer | |
| Tris. HCl pH: 7.4 | 50 mM |
| Ammonium sulfaat pH: 9,3 | 15 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| Tween 20 | 0,1% (v/v) |
| Proteinase K | 100 μg/mL |
Tabel 5: celkweekmedium en proteïnase K digestie buffer.
| Reagens | Bedrag |
| DMEM/F12 | 50,0 μL |
| pCas9_GFP vector (addgene plasmide 44719) | 0,5 μg |
| gRNA plasmide | 0,5 μg |
| ssODN (0,5 μg van elke ssODN) | 1,0 μg |
| lipide transfectie reagens | 3,0 μL |
Tabel 6: ssodn Cell transfectie Master mengsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol wordt het gebruik van CRISPR CAS9 samen met twee ssODN-reparatie sjablonen voor het genereren van specifieke heterozygoot-of homozygoot-genoom veranderingen aangetoond in menselijke pluripotente stamcellen. Deze methode resulteerde in de succesvolle generatie van isogene cellijnen die heterozygoot genomische veranderingen uitdrukken met een efficiëntie dicht bij 10%. Dit protocol is geoptimaliseerd voor zowel menselijke Esc's en iPSCs geteeld op bestraalde Mef's die celgroei en overleving ondersteunen na het kweken van cellen met een lage dichtheid na het sorteren van de cel. Celdood kan worden geminimaliseerd door het handhaven van cellen met 10 ng/mL bFGF en Y-27632 dihydrochloride. Het is mogelijk dat dit protocol kan worden aangepast aan de feeder-vrije kweeksystemen, maar verdere optimalisatie kan nodig zijn.
Transfectie-efficiëntie kan variabel zijn van de cellijn tot de cellijn, maar het gebruik van 3 μg DNA en 3 μL van een lipide transfectie reagens gaf over het algemeen de beste resultaten van tussen 0,5-2% transfectie-efficiëntie. Echter, als de transfectie-efficiëntie lager is, kan optimalisatie van de hoeveelheid DNA en lipide-reagens worden uitgevoerd. Andere transfectie reagentia kunnen ook door de onderzoeker worden getest.
De efficiëntie van de Indel generatie zal variëren met verschillende Grna's en kan worden beïnvloed door genomische locatie. In de overgrote meerderheid van de gevallen, als vier Grna's zijn ontworpen, ten minste één en vele malen 2 tot 3, zal efficiënt werken. Voorafgaand aan het testen van gRNAs is bovendien het belangrijk om de PCR-strategie te optimaliseren om indels met een clean single band DNA-product te visualiseren. Voor het screenen van ssODN op basis van genoom bewerking, is het het beste om een restrictie-enzym site toe te voegen bij de invoering van een stille Mutatie (en), maar als dit niet mogelijk is, kan ook de verwijdering van een restrictie-enzym site worden gebruikt. Bovendien, homologie gerichte reparatie vereist actief fietsen cellen, zodat de celdichtheid van culturen voorafgaand aan transfectie is essentieel om de frequentie van klonen gerepareerd met behulp van de geïntroduceerde ssODN-sjabloon te verbeteren.
Sommige van de beperkingen van dit protocol zijn gerelateerd aan de positie in het genoom dat zal worden bewerkt. Wanneer het coderen van regio's wordt gewijzigd, voorkomt ssODN met stille mutaties dat de Cas9 de bewerkte plaats opnieuw afsnijden en dat de Stille mutaties het eiwit product niet veranderen. Het bewerken in regelgevende of niet-coderings gebieden met behulp van deze methodologie wordt echter moeilijker omdat stille mutaties niet mogelijk zijn. Als de te bewerken basis deel uitmaakt van een PAM-reeks, kan dit met succes worden gedaan, maar alleen homozygoot-wijzigingen kunnen efficiënt worden gegenereerd.
Het hier beschreven protocol is nuttig voor het genereren of corrigeren van heterozygoot coderings mutaties zonder dat de toevoeging van onbedoelde indels in het tweede allel. Dit protocol zal het gebruik van menselijke PSCs vergemakkelijken om een breed scala aan onderwerpen uit de ontwikkelingsbiologie te bestuderen op het modelleren van genetische ziekten. Het gebruik van isogene lijnen is essentieel om functies van een bepaalde Codeer mutatie te definiëren zonder verstorende effecten als gevolg van verschillende genetische achtergronden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de financiering van het nationaal hart, het Long-en het bloed Instituut (NHLBI), de National Institutes of Health via subsidies U01HL099656 (P.G. en D.L.F.) en U01HL134696 (P.G. en D.L.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
