Summary
Этот протокол предоставляет метод для облегчения генерации определенных гетерозиготных или гомозиготных изменений ядра с использованием CRISPR-CAS9 в стволовых клетках человека.
Abstract
Человеческие плюрипотентные стволовые клетки предлагают мощную систему для изучения функции генов и моделирования конкретных мутаций, имеющих отношение к болезни. Генерация точных гетерозиготных генетических модификаций является сложной задачей из-за CRISPR-CAS9 опосредованного индель образования во втором аллеле. Здесь мы демонстрируем протокол, помогающий преодолеть эту трудность, используя два шаблона ремонта, в которых только один выражает желаемое изменение последовательности, в то время как оба шаблона содержат молчаливые мутации, чтобы предотвратить повторное вырезание и образование indel. Эта методология является наиболее выгодным для редактирования генов кодирования регионов ДНК для создания изогенного контроля и мутантных линий стволовых клеток человека для изучения болезней человека и биологии. Кроме того, была проведена оптимизация методологий трансфекции и скрининга для снижения рабочей силы и затрат на эксперимент по редактированию генов. В целом, этот протокол широко применим ко многим проектам редактирования генома, используя модель стволовых клеток человека.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки человека (HESCs) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) являются ценными инструментами для моделирования болезни человека из-за их способности к обновлению, сохраняя при этом способность генерировать типы клеток различных линий1,2 ,3,4. Эти модели открывают возможность изыскнуть функцию генов и понять, как специфические мутации и фенотипы связаны с различными заболеваниями5,6. Однако, чтобы понять, как конкретное изменение связано с определенным фенотипом, использование парного изогенного контроля и мутантных клеточных линий важно контролировать для линии к линии изменчивости7,8. Транскрипционный активатор- как эффектиор нуклеазы (TALENs) и цинк палец нуклеазы были использованы для создания вставки или удаления (indels) мутации в различных генетических моделей, в том числе первичных клеток; но эти нуклеазы могут быть громоздкими в использовании и дорогими9,10,11,12,13,14. Открытие кластерных регулярно межпространственный короткий палиндромический повтор (CRISPR)-CAS9 нуклеаза произвела революцию в этой области из-за эффективности в формировании indel практически в любой области генома, простота использования, и снижение стоимости15 , 16 Год , 17 Лет , 18 лет , 19.
Проблема в использовании технологии редактирования генома на основе CRISPR-CAS9 заключается в генерации или коррекции конкретных мутаций в одном аллеле без создания indel мутации во втором аллеле20. Основная цель этого протокола заключается в преодолении этой проблемы с помощью двух одноцепочечных шаблонов ремонта олигонуклеотида (ssODN) для уменьшения образования indel во втором аллеле. Оба ssODNs предназначены для сдерживания молчаливых мутаций, чтобы предотвратить повторное сокращение нуклеазой CAS9, но только один содержит изменение интереса. Этот метод повышает эффективность генерации специфической гетерозиготной генетической модификации без индуцирования во втором аллеле. Используя этот протокол, эксперименты по редактированию генов в шести независимых геномных местах демонстрируют точное введение желаемого геномного изменения в одном аллеле без образования indel во втором аллеле и происходит с общей эффективностью в 10%. Описанный протокол был адаптирован из Магуайр и др.21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Проектирование и строительство направляющей РНК (gRNA)
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая gRNA состоит из двух 60 базовых пар (bp) олигонуклеотидов, которые annealed для создания 100 bp двойной мель (ds) олигонуклеотид (Рисунок 1A-C). Сроки разработки, генерации и тестирования эффективности работы gRNA составляют примерно 2 недели(рисунок 2).
- Выберите область ДНК, представляющий интерес, чтобы быть отредактированным геномом и определите 3-4 23 bp последовательности, которые соответствуют формату, 5'-G (N19)NGG-3'. Эти последовательности должны быть расположены в пределах 20 bp от региона интереса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентация может быть выполнена на смысле или анти-чувство прядь. - Оцените последовательности gRNA для геномной избыточности и вероятности вне цели с помощью такого ресурса, как CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
- Включите 20 BP целевой последовательности (за исключением протосказер смежных мотив или PAM) в два 60-мер олигонуклеотидов, как показано (последовательности 5 'до 3' и красный и зеленый являются обратными дополнениями, как показано на рисунке 1C).
- Закажите два 60 bp олигонуклеотидов от поставщика выбора. После получения олигонуклеотидов, повторной каждой до конечной концентрации 100 мкм в ddH2O. Сделать рабочий запас 10 мкм.
- Аннал два олигонуклеотидов и генерировать 100 bp dsDNA фрагмент с помощью ПОЛимеразы ДНК (Таблица материалов). Смешайте 5 qL из 10 мкм вперед олигонуклеотида и 5 qL из 10 ММ обратного олигонуклеотида в полимеразовой цепной реакции (ПЦР) полоски трубки и инкубировать при 95 кв КС в течение 5 мин. Охладите реакцию в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
- Настройка ПЦР, как описано в таблице 1. Выполните усиливание ПЦР в тепловом циклическом цикле, используя параметры, изложенные в таблице 2.
- Визуализируйте продукты ПЦР на 1,5% (w/v) бромистого этидия (EtBr) агарозии гель электрофорезируется при 80-100 V в течение 40 мин. Акциз 100 bp band (Рисунок 3A), визуализированный на светодиодной световой коробке, от геля с помощью бритвы лезвие и очистить с помощью геля комплект извлечения(Таблица материалов).
2. Дизайн праймеров ПЦР для скрининга
- Выполните скрининг отредактированной ДНК с помощью передних и обратных праймеров ПЦР, которые специально разработаны для усиления области 400-500 bp гена интереса (Таблица 2). Используйте ДНК, изолированную от любой контрольной линии iPSC, чтобы подтвердить чистую ампликон при выполнении скрининга ПЦР.
- Визуализируйте пЦР-продукты на 1,5% (w/v) геле после электрофореза при 80-100 В на 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование отредактированных клонов выполняется с помощью вложенного грунтовки, которая разработана после подтверждения набора грунтовки скрининга. Образцы отправляются в коммерческий источник для секвенирования.
3. Приготовление гРНЗА-клонирования векторной плазмиды
- Для линейной девициционирования вектора, возьмите 1,5 мл центрифуги трубки и добавить 1-5 мкг ДНК вектора gRNA'cloning вместе с 4 Зл из буфера ограничения AflII и 1,5 л фермента ограничения AflII. Подведите реакцию на 24 л ddH2O. Смешайте реакцию, подав трубку вверх и вниз. Инкубировать при 37 градусах Цельсия на ночь (O/N).
- Электрофорес на 1% агарозный гель на 80-100 В на 1 ч и акцизных полос (ожидаемый размер полосы составляет 3519 евро).
- Извлекайте и очищайте как в шаге 1.6.
4. Сборка вектора gRNA
- Настройка реакций и собрать фрагменты ДНК с помощью комплекта сборки (Таблица материалов) в 1:5 соотношения AflII переваренный вектор клонирования gRNA к 100 bp гель очищенной вставки, как описано в таблице 3.
- Инкубировать реакцию при 50 градусах по Цельсию в течение 15 мин. Разбавьте реакцию 1:3 в ddH2O и используйте 3 ЗЛ для бактериальной трансформации, в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов). Плиты на канамицинл LB / агар пластин.
- Выберите 3-5 колоний на гРНК. Прививать каждую колонию в 4 мл Lb и расти O / N на 37 градусов по Цельсию в орбитальном встряхивания инкубатора.
- Очистка плазмидной ДНК с помощью комплекта изоляции минопов и последовательности каждого gRNA с использованием следующих грунтовок для обеспечения успешного клонирования: Forward: GTACAAAAAGCAGGCTTAAAGG; Обратный: TGCCAACTTGTACAAAAGCT.
5. Эффективность резки гРНК
- Плита hESCs на облученных морин эмбриональных фибробластов (MEFs) в 6-хорошо пластины, как ранее описано21. Когда клетки достигают 70-80% всблонения, подготовить трансфекции мастер смесь, изложенные в таблице 4.
- Смешайте путем pipetting и инкубировать на RT в течение 15 мин. Добавить dropwise к клеткам и инкубировать при 37 кс для 48 ч (с изменением носителя после 24 ч).
- Урожайные ячейки для сортировки после 48 ч.
- Удалите MEFs ферментативно(Таблица материалов) с 3 мин RT инкубации.
- Промыть клетки 1x со средой hESC(Таблица 5) и скоблить в hESC среднего 10 МКм Y-27632 дигидрохлорид(Таблица материалов).
- Пеллетные клетки на 300 х г в течение 3 мин и повторно притяжаются в 0,5 мл среды hESC 10 мкм Y-27632 дигидрохлорида.
- Фильтр в трубку 5 мл через 35 мкм ячейки-ситечко крышка.
- Используя флуоресценцию активированной сортировки клеток (FACS), ворота на живые клетки и сортировать зеленый флуоресцентный белок (GFP) положительные клетки.
- Передача максимум 1,5 х 104 отсортированных клеток непосредственно в 10 см2 блюдо покрытием с 1:3 подвал мембранной матрицы (Таблица материалов) и облученных MEFs в среде hESC (Таблица 5), содержащий Y-27632 дигидрохлорид.
- Изменение среднего ежедневно с помощью среды hESC (Таблица 5) без Y-27632 дигидрохлорид и вручную выбрать клонов после 10-15 дней, когда колонии 1 мм в диаметре.
- Используя пипетку P200 и микроскоп, тщательно соскребите один клон и нарисовать клетки в пипетку.
- Разогнать клетки, аккуратно pipetting 3-4x в 96 хорошо пластины в среде составлен с колонией.
- Распределите в прокладки полоски ПЦР для скрининга и гранулы клетки центрифугирование мецентрирования при 10000 х г в течение 5 мин. Выберите 20 колоний на гРНК.
6. Скрининг клонов
- Изолировать ДНК путем инкубации клеточных гранул в 20 qL буфера протеиназа K(Таблица 5) (1 ч при 55 градусах по Цельсию и 10 мин при 95 градусах Цельсия) и вихревом энергично. Центрифуга при 10 000 х г в течение 5 мин и соберите супернатант.
- Выполните скрининг ПЦР (раздел 2) в общем объеме 20 зл, используя мастер-микс, включав в себя грунтовки, предназначенные для усиления интересуемой области и 5 зле циферей к дайджеста. Используйте геномную ДНК, изолированную от клеточной линии, которая редактировалась геном в качестве контроля.
- Оцените изменения размера продуктов ПЦР после 1 л электрофореза при 70-90 В на 2,5% (w/v) агарозный гель(рисунок 3B, C). Любая разница в размерах свидетельствует о расщеплении.
7. Точное редактирование генома в плюрипотентных стволовых клетках с использованием одной нити олиго ДНК (ssODNs)
- Дизайн 100 bp ssODNs сосредоточены вокруг наиболее эффективной последовательности gRNA определяется иметь лучшую эффективность резки.
- Предотвращение повторного расщепления рекомбинуемого ODN путем введения молчаливых мутаций в последовательность gRNA. Одной молчаливой мутации в последовательности PAM достаточно, но если это невозможно, 3-4 тихих мутации будут работать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения скрининга целевых клонов, введение места ограничения в пределах 20 bp последовательности gRNA является идеальным. - Создайте одно ODN с пожеланным изменением основания (s) для того чтобы создать перегласовку интереса и одно ODN без изменения основания (s).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти изменения должны быть не более чем на 20 евро за баррель от прогнозируемого участка сокращения CRISPR/CAS9, так как рекомбинация значительно падает на больших расстояниях. - Закажите два ssODNs от поставщика выбора и resuspend в воде, чтобы сделать 1 мкг / Л запасов. Храните запасы при -20 градусах по Цельсию.
8. Трансфекция установка
- Чтобы переоборудовать ssODN и плазмиды CRISPR-CAS9, пластины целевой линии клеток в 6-ну хорошо блюдо на облученных MEFs достичь 70-80% выпуклость после Инкубации O / N.
- Настройка реакции трансфекции, как описано в таблице 6. Смешайте реакцию путем pipetting и инкубировать в течение 15 минут на RT. Добавить трансфекционной реакции смеси dropwise к клеткам.
- После 48 ч подготовьте клетки для сортировки клеток, как описано в разделе 5.3.
- Выберите колонии 10 дней после покрытия одиночных клеток с помощью 200-й пипетки. Перенесите 100 л клеток в одну скважину из 24 или 48 хорошо пластины, ранее покрытые желатином и облученных МЭФов в среде hESC с дигидрохлоридом Y-27632. Используйте оставшиеся 100 л для изоляции ДНК, как описано в разделе 6.
9. Проверка на наличие мутаций в отдельных колониях
- Чтобы проверить на успешную интеграцию ssODN, возьмите 5 зЛ ДНК, изолированной от каждой колонии, чтобы выполнить ПЦР с помощью скрининговых праймеров, разработанных в разделе 2. Очистите продукты ПЦР(Таблица материалов)и подготовьте переваривание фермента ограничения с помощью уникального фермента, созданного в ssODN.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это пищеварение также включает в себя буфер фермента ограничения и рекомендуемую производителем концентрацию фермента ограничения в объеме 40 зл. - Смешайте реакцию путем пипетки и инкубируйте при рекомендуемой температуре производителя 1-3 ч.
- Визуализируйте переваренные продукты ПЦР на 1,5% (w/v) EtBr агарозный гель электрофоресированный при 80-100 В в течение 40 мин. Если произошла успешная интеграция ssODN, последовательность конкретных мутаций с помощью вложенного грунтовки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Генерация ГРНК и скрининг на инделы
Каждая gRNA будет клонирована в плазмидный вектор и выражена с помощью промоутера U6. Фермент ограничения AflII используется для линейной плазмиды (addgene #41824) и расположен после промоутера U6. Диапазон 100 bp, созданный после аннулирования двух олигосов 60 bp, клонируется в вектор экспрессии gRNA с помощью сборки ДНК. Как только плазмиды gRNA генерируются, они трансфицируются в hESCs или iPSCs вместе с плазмидом CRISPS-CAS9 GFP (добавить #44719). Клетки ГФПЗ сортируются через 2 дня, чтобы обогатить трансинфицированные клетки и покрыть (см. раздел 5). После 10-14 дней, одноклеточные производные колонии выбираются и используются для изоляции ДНК для проверки для образования индель генерируется для каждого gRNA. Усиление ПЦР с грунтовками, охватывающими сайт gRNA, используется для визуализации образования индель с использованием 2,5% (w/v) агарозного геля с EtBr, электрофоресированного при 70-90 В на 1 ч.
Поколение 100 bp ssODN для введения конкретных мутаций
Два олиго ssODN разработаны вокруг gRNA с наиболее эффективной резки. Каждая gRNA составляет 100 bp и содержит молчаливые мутации, предпочтительно в последовательности PAM, чтобы избежать повторной резки(рисунок 4A). Тихая мутация в последовательности PAM может генерировать уникальный сайт ограничения, который помогает экран для успешной интеграции в один или два аллеля(Рисунок 4B).
ssODN результаты рекомбинации
Используя этот протокол, частота таргетинга событий для шести различных генов с использованием двух ssODN подход показан на рисунке 5. Изучая геномную модификацию на участке gRNA в обоих аллелях, ожидались различные исходы, включая рекомбинацию wildtype (WT) ssODN, мутантs ssODN и образование индель. Клоны, в которых только один аллель претерпел рекомбинацию, наиболее распространенным результатом было индельобразование во втором аллеле (10-42%). Клоны, которые имели интеграцию ssODNs в обоих аллелях, привели к трем различным исходам: 1) интеграция WT ssODN в обоих аллелях (0-8%), 2) интеграция мутантов ssODN в обоих аллелях (0-25%), и 3) интеграция как WT, так и мутантов ssODN WT (8-21%).
Рисунок 1: Обзор поколения gRNA. ()В регионе, представляющих интерес, дизайн четырех gRNAs окончание в GG, которые не более 20 bp друг от друга. (B) Каждый gRNA 23 bp имеет последовательность PAM NGG на 3' конце. (C) 60 bp праймеры состоят из последовательности 40 bp, дополняющих пластид гРНК и 20 bp gRNA последовательности без последовательности PAM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Протокол сроки для генерации gRNA и клонов скрининга. Показана шкала времени для генерации гРНК и скрининговых клонов. Проектирование и клонирование плазмиды выражения gRNA занимает примерно одну неделю. Приблизительно через 48 часов после перешиферки в ЧОПы для человека, клетки GFP' сортируются и покрываются при ограничении разбавления. Колонии должны быть видны между 7-10 дней и примерно в день 20, клоны могут быть выбраны для скрининга, расширения и подтверждения последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: тест на gRNA для эффективности резки. ()Для строительства gRNA, 100 bp полоса вырезана из 1,5% агарозный гель. (B) После трансфекции клеток, проверка резки гРНК визуализирована с помощью 2,5% агарозного геля. 180 bp PCR продукт используется для проверки indel формирования, в котором неподрезанный контроль и различные клоны анализируются для полосы сдвиги, свидетельствуют о indel формирования. (C) Различные gRNAs могут иметь различные эффективности резки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Генерация и скрининг мутаций с использованием двух ssODNs. ( A) Чтобы избежать повторного разрезания отредактированных аллелей CRISPR-CAS9, последовательность PAM может быть изменена с помощью G до молчаливой мутации. Эта модификация добавляет уникальный сайт EcoRI ограничения, которые могут быть использованы для скрининга. В дополнение к этой молчаливой мутации, мутант ssODN содержит желаемое изменение базы. (B) Скрининг на олегонуклеотид рекомбинации с использованием EcoRI ограничения фермента пищеварения может привести к трем возможным исходам: не резки представлены wT группы на 650 bp, рекомбинации в одном аллеле представлены необрезанные полосы 650 bp и два меньшие полосы или вставки в оба аллеля, представленные только более мелкими полосами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: эффективность интеграции ssODN и результаты. Эффективность интеграции и результаты двух ssODN подход были определены путем анализа шести различных генов. Если только один ssODN интегрирован, то образование indel обычно было обнаружено в другом аллеле. Если два ssODNs интегрированы, три возможных исхода были обнаружены, как показано на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Реагента | Объем (КЛ) |
| dNTPs (10 mM) | 0.4 |
| Так полимераза | 0.2 |
| Буфер ПЦР | 4.0 |
| Аннзатные олиго (10 мкм) | 10.0 |
| ddH2O | 5.4 |
Таблица 1: gRNA клонирования ПЦР условиях.
| Программа ПЦР | |
| Шаг 1 | 98 кк с 30 с |
| Шаг 2 | 98 кв. м на 10 с |
| Шаг 3 | 55 кк с 20 с |
| Шаг 4 | 72 кк с 30 с |
| Шаг 5 | Повторите шаги 2 х 4 для 30 циклов |
| Шаг 6 | 72 КК в течение 5 мин |
| Шаг 7 | Удерживайте при 4 градусах По Цельсию |
Таблица 2: Параметры цикла ПЦР.
| Реагента | Объем (КЛ) |
| линейный вектор gRNA с использованием AflII (т.е. 50 нг/Л) | 1.0 |
| 100 б.п. ДНК (т.е. 250 нг/Л) | 1.0 |
| Мастер микс 2x | 10.0 |
| ddH2O | q.s. до 20 |
Таблица 3: условия реакции сборки gRNA.
| Реагента | Сумма |
| DMEM/F12 | 50,0 л |
| вектор pCas9-GFP (addgene plasmid 44719) | 0,5 мкг |
| гРНК плазмид | 0,5 мкг |
| липидный реагент трансфекции | 3,0 л л |
Таблица 4: Клеточный трансфекционный мастер смеси.
| hESC средний | |
| Реагента | Окончательная концентрация |
| DMEM/F12 | |
| Замена нокаутса в сыворотке (KDR) | 15% (v/v) |
| Несущественные аминокислоты | 100 мкм |
| Пируват натрия | 1 мМ |
| Глютамин | 2 мМ |
| -меркаптоэтанол | 0,1 мм |
| bFGF человек (основной фактор роста фибробластов) | 10 нг/мл |
| 10x Буфер Протеиназа K | |
| Tris.HCl рН:7.4 | 50 мМ |
| сульфат аммония рН: 9.3 | 15 мМ |
| MgCl2 | 2,5 мМ |
| Твина 20 | 0,1% (v/v) |
| Протеиназа K | 100 мкг/мл |
Таблица 5: Среда клеточной культуры и буфер пищеварения нитеазы K.
| Реагента | Сумма |
| DMEM/F12 | 50,0 л |
| вектор pCas9-GFP (addgene plasmid 44719) | 0,5 мкг |
| гРНК плазмид | 0,5 мкг |
| ssODN (0,5 мкг каждого ssODN) | 1,0 мкг |
| липидный реагент трансфекции | 3,0 л л |
Таблица 6: ssODN клеточной трансфекционной смеси мастера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе, использование CRISPR-CAS9 вместе с двумя шаблонами ремонта ssODN для создания конкретных гетерозиготных или гомозиготных изменений генома демонстрируется в стволовых клетках человека плюрипотентных. Этот метод привел к успешному генерации изогенных клеточных линий, выражающих гетерозиготные геномные изменения с эффективностью, близкой к 10%. Этот протокол был оптимизирован как для человека ESCs и iPSCs, выращенных на облученных MEFs, которые поддерживают рост клеток и выживание после культивирования клеток при низкой плотности после сортировки клеток. Клеточная смерть может быть сведена к минимуму путем поддержания клеток с 10 нг/мл bFGF и Y-27632 дигидрохлорида. Возможно, что этот протокол может быть адаптирован к системам свободной культуры подачи, но может потребоваться дальнейшая оптимизация.
Эффективность трансфекции может быть переменной от клеточной линии к клеточной линии, но использование 3 мкг ДНК и 3 Зл липидного реагента трансфекции обычно дает наилучшие результаты между 0,5-2% эффективности трансфекции. Однако, если эффективность трансфекции ниже, оптимизация количества ДНК и липидного реагента может быть выполнена. Другие трансфекционные реагенты также могут быть проверены следователем.
Эффективность генерации индел будет варьироваться в зависимости от gRNA и может зависеть от геномного расположения. В подавляющем большинстве случаев, если четыре GRNA предназначены, по крайней мере один и много раз 2 до 3, будет работать эффективно. Кроме того, перед тестированием gRNAs, оптимизация стратегии ПЦР для визуализации indels с чистой одной полосы ДНК продукта имеет важное значение. Для скрининга ssODN на основе редактирования генома, лучше добавить место ограничения фермента при введении молчание мутации (ы), но если это невозможно, удаление места ограничения фермента может быть использован также. Кроме того, гомология направлена ремонт требует активно велосипедных клеток, так что плотность клеток культур до трансфекции имеет решающее значение для повышения частоты клонов отремонтированы с помощью введенного шаблона ssODN.
Некоторые ограничения этого протокола связаны с положением в геноме, которое будет отредактировано. При изменении областей кодирования ssODN, несущих молчаливые мутации, не позволяют Cas9 повторно сократить отредактированный участок, а молчаливые мутации не изменяют белковый продукт. Однако редактирование в регулятивных или некодирующих регионах с использованием этой методологии становится более трудным, поскольку молчаливые мутации невозможны. Если редактируемая база является частью последовательности PAM, это можно сделать успешно, но эффективно можно сгенерировать только гомозиготные изменения.
Описанный здесь протокол полезен для генерации или коррекции гетерозиготных мутаций кодирования без добавления непреднамеренных исдел во втором аллеле. Этот протокол будет способствовать использованию человеческих ЧоС для изучения широкого круга тем, от биологии развития до моделирования генетических заболеваний. Использование изогенных линий имеет решающее значение для определения функций данной мутации кодирования без путаницы эффектов из-за различных генетических фонов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано финансированием из Национального института сердца, легких и крови (NHLBI), Национальных институтов здравоохранения через гранты U01HL099656 (P.G. и D.L.F.) и U01HL134696 (P.G. и D.L.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
