Summary
Hier beschreven is een protocol voor het karakteriseren van modules van biologisch synergetische miRNAs en hun assemblage in korte transgenen, waardoor gelijktijdige overexpressie voor gentherapie toepassingen mogelijk is.
Abstract
De biologische relevantie van microRNAs (miRNAs) in gezondheid en ziekte is sterk afhankelijk van specifieke combinaties van veel gelijktijdig gedereguleerde miRNAs in plaats van de werking van een enkele miRNA. De karakterisering van deze specifieke miRNAs-modules is een fundamentele stap om het gebruik ervan in de therapie te maximaliseren. Dit is uitermate relevant omdat hun combinatorische attributen praktisch uitgebuit kunnen worden. Hier beschreven is een methode om een specifieke Mirna-handtekening te definiëren die relevant is voor de controle van oncogene chromatine-van in glioblastoma. De aanpak definieert eerst een algemene groep van miRNAs die zijn gedereguleerd in tumoren in vergelijking met normaal weefsel. De analyse wordt verder verfijnd door differentiële cultuuromstandigheden, waarbij een subgroep van Mirna's wordt onderstreept die gelijktijdig worden uitgedrukt tijdens specifieke cellulaire toestanden. Ten slotte worden de miRNAs die aan deze filters voldoet, gecombineerd tot een kunstmatige polycistronic transgenes, die is gebaseerd op een steiger van natuurlijk bestaande miRNA clusters genen, vervolgens gebruikt voor overexpressie van deze miRNA modules in ontvangende cellen.
Introduction
miRNAs biedt een ongeëvenaarde kans voor de ontwikkeling van een brede gentherapie benadering van vele ziekten1,2,3, waaronder kanker4,5. Dit is gebaseerd op een aantal unieke kenmerken van deze biologische moleculen, met inbegrip van hun kleine maat6, eenvoudige biogenese7, en natuurlijke neiging om te functioneren in vereniging8. Veel ziekten worden gekenmerkt door specifieke miRNA-expressie patronen, die vaak convergeren over de regulering van complexe biologische functies9. Het doel van deze methode is om eerst een strategie te definiëren om groepen van miRNAs te identificeren die synergetisch relevant zijn voor specifieke cellulaire functies. Bijgevolg biedt het een strategie voor het opnieuw opzetten van dergelijke miRNA-combinaties in downstreamstudies en toepassingen.
Deze methode maakt functionele analyse van meerdere Mirna's tegelijk mogelijk, gebruikmakend van hun gelijktijdige targeting van een groot aantal Mrna's, waardoor de complexe landschappen van ziekten worden samengevat. Deze aanpak is onlangs gebruikt om een groep van drie Mirna's te definiëren die 1) gelijktijdig worden gedowngereguleerd in hersenkanker en 2) vertonen een sterk co-expressie patroon tijdens Neurale differentiatie, evenals in reactie op genotoxische stress door straling of een DNA alkylerende agent. De combinatorische re-expressie van deze module van drie miRNAs door de hieronder beschreven clustering methode resulteert in diepgaande interferentie met de biologie van kankercellen en kan gemakkelijk worden gebruikt als een gentherapie strategie voor preklinische studies10. Dit protocol kan van bijzonder belang zijn voor degenen die betrokken zijn bij het onderzoek van miRNA en de translationele toepassingen ervan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. karakterisering van functioneel geassocieerde miRNAs in glioblastoma
- Analyse van de brede differentiële Mirna expressie in multiform glioblastoom vs. hersenen
- Bepaal eerst de meest sterk gedereguleerde miRNAs in de tumor. Dit kan worden bereikt met behulp van ten minste drie verschillende methoden:
- Mine de kanker genoom Atlas, gevonden op https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, voor sequencing data11.
- Voer microarray analyse uit van een vers operatief specimen12.
- Gebruik eerder gepubliceerde gegevenssets13.
Opmerking: Welke methode er ook wordt gekozen, de output biedt een bulk verzameling miRNAs waarvan de uitdrukking statistisch gecorreleerd is (direct of omgekeerd) met tumor biologie. Deze eerste groep vormt de pool van miRNAs die verder worden geanalyseerd voor de identificatie van een subset van miRNAs die de strengste functionele associatie weergeeft door een meer dynamische analyse van uitdrukkings wijzigingen uit te voeren, zoals hieronder wordt besproken.
- Bepaal eerst de meest sterk gedereguleerde miRNAs in de tumor. Dit kan worden bereikt met behulp van ten minste drie verschillende methoden:
- Voorwaarde-specifieke miRNA-expressie analyse
- Inductie van celdifferentiatie:
- Gebruik pre-Coated poly-D-Lysine (PDL) plastic gerechten om de vorming van een monolaag cultuur te gunst. Voor de afdeklaag, los PDL in water op met een concentratie van 100 μg/mL. Gebruik 1 mL oplossing per 25 cm2 oppervlak. Spoel 2x met PBS 6 h na toepassing van de PDL-oplossing.
- Plaat menselijke neurale stamcellen in gelijke hoeveelheden (100.000 cellen/5 mL) hetzij in stamcel medium (neurobasal medium + B27 supplement + 20 ng/mL EGF/FGF), astrocytische differentiatie medium (DMEM + 10% FBS), of neuronale differentiatie medium (neurobasal medium + B27 supplement, + 2 μM retinoïnezuur)14. Het protocol voor oligodendrocyten differentiatie vereist toevoeging van IGF-1 (200 ng/ml) na EGF/FGF Removal14,15.
- Na celplating, plaats in incubator voor 1 week bij 37 °C, 5% CO2.
- RNA-extractie:
- Verwijder na 7 dagen de cellen uit de incubator en verwijder het medium.
- Was de cellen met PBS (5 mL). Voeg vervolgens 1 mL lysisreagens (zie tabel met materialen) toe om de cellen te lyseren en de cellen in 1,5 ml microfugebuis Tube te schrapen met behulp van een celscraper. Houd de buisjes met de gelyseerd-cellen gedurende 5 min bij kamertemperatuur (RT).
- Ga naar totale RNA-isolatie volgens de instructies van de fabrikant.
- miRNA expressie analyse:
- Kwantificeer de differentiële uitdrukking van specifieke miRNAs die in stap 1,1 is geïdentificeerd onder de drie differentiatie patronen door real-time PCR, met behulp van TaqMan probes en volgens de protocollen van de fabrikant voor omgekeerde transcriptie en PCR-versterking ( Figuur 1).
- Inductie van celdifferentiatie:
- Validatie van miRNA-clusters door stress-specifieke uitdagingen
- Cultuur G34 multiform glioblastoom stam-achtige cellen in neurobasal medium + B27 supplement + 20 ng/ml EGF/FGF. Begin met 1 x 106 cellen in 5 ml in een 25 cm2 laag gehechtheid kolf.
- Vanaf 48 h na het beplating, Voeg elke 5 dagen verdubbelde concentraties van DNA alkylerende agent temozolomide (TMZ) toe, als volgt:
- Begin met 5 μM gedurende 5 dagen. Verwijder na 5 dagen het medium en vervang het met vers medium zonder temozolomide, zodat de overgebleven cellen kunnen worden hersteld. Na 48 h, voeg 10 μM TMZ toe en inincuberen voor nog eens 5 dagen.
- Herhaal stap 1.3.2.1, verdubbelde TMZ-concentratie elke keer, totdat een concentratie van ten minste 100 μM is bereikt en cellen resistent worden tegen het medicijn10.
- In een parallel experiment, bestraleren G34 cellen als volgt:
- Vanaf 48 h na het bekleden van 1 x 106 cellen in 5 ml in een 25 cm2 laag bevestigingkolf, bestraleren cellen met 2 gie energie (elke irradiator die foonemissie levert, is aanvaardbaar). Retourneer de cellen naar de incubator en niet storen. Na 48 h, bestraleren de cellen opnieuw met extra 2 gie van energie.
- Herhaal stap 1.3.3.1 4x totdat in totaal 10 GY energie wordt toegediend.
- Keer de cellen terug naar de incubator en laat ze gedurende ten minste 5 dagen vóór de downstream-analyse in vers medium herstellen.
- Na de inductie van resistentie, lyse cellen met lysisreagens en extract totaal RNA volgens het Protocol van de fabrikant.
- Analyseer de expressie van de specifieke miRNAs die is geïdentificeerd in de paragrafen 1.1-1.2, zoals beschreven in stap 1.2.1 (Figuur 2).
- Karakterisatie van de functionele convergentie van geclusterd miRNAs
- Verkrijg de voorspelde targetome van elke miRNAs gedefinieerd in de paragrafen 1.2-1.3 verkregen met behulp van miRNA targeting Voorspellings hulpmiddelen.
Opmerking: We in het algemeen toevlucht tot TARGET scan, als het algoritme wordt periodiek bijgewerkt16. Extra Voorspellings hulpmiddelen zijn miRanda17, mirdb18en Diana-mirpath19. Al deze Programma's zijn gratis, web-based applicaties.- Selecteer op de voor pagina van target scan de miRNA van belang uit het vooraf ingevulde vervolgkeuzemenu. Klik op de knop verzenden .
- Download de resulterende lijst met doelen als een spreadsheet met behulp van de link Download Table (aanvullend figuur 1).
- Als u de kans op vals-positieve voorspellingen wilt verkleinen, neemt u in downstream-analyses alleen doelen op in de kolom geconmageerde sites. Bovendien kan verdere striktheid worden verkregen door het gebruik van extra miRNA Voorspellings programma's (zie hierboven) en alleen met inbegrip van doelen die gemeenschappelijk zijn voor alle algoritmen.
- Classificeer de resulterende targetomes volgens Genontologie categorieën met behulp van ToppGene Suite20 om te evalueren voor de verrijking van trajecten die gemeenschappelijk zijn voor elke Mirna.
- Plak de lijst met doelen die zijn verkregen uit stap 1.4.1 in het venster "training Gene set", met behulp van HGNC-symbool als het boekingstype. Klik op verzenden > starten. Het programma geeft een uitvoertabel weer met de meest significante "Go"-categorieën voor de ingevoerde lijst met genen (aanvullend figuur 2).
- Om eindelijk de bijdrage van elke miRNA aan de regulering van een gemeenschappelijk traject of cellulair proces vast te stellen (in dit geval chromatide regulatie), controleert u elk in stap 1.4.1 verkregen targetome tegen de volledige lijst van genen die betrokken zijn bij het specifieke cellulaire proces ( dat wil zeggen, chromatine-regeling), met behulp van de Venn-diagramfunctie van de website bioinformatica en evolutionaire Genomics http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
Opmerking: Dit programma maakt het mogelijk om meerdere groepen tegelijk te doorsnede (Figuur 3). De specifieke unieke doelen die door elke miRNA worden verstrekt, worden vervolgens geannoteerde en geselecteerd voor downstream functionele experimenten.- Op de voor pagina van het programma, uploaden of kopiëren/plakken van de lijst als doel Mrna's voor elke miRNA of belang in de respectieve vensters. Noem elke lijst een unieke id.
- Klik op verzenden. Het programma zorgt voor een visuele output van een Venn-diagram met aantallen genen in elke sector, evenals een volledige lijst van Mrna's voor elke subset en snij combinaties.
- Verkrijg de voorspelde targetome van elke miRNAs gedefinieerd in de paragrafen 1.2-1.3 verkregen met behulp van miRNA targeting Voorspellings hulpmiddelen.
2. assemblage van miRNA-modules in een Polycistronic transgene cluster
-
Voorbereiding van transgene steiger op basis van miR-17-92 cluster Locus
- Verkrijg de nucleotide-sequentie van de miR-17-92-cluster uit de ENSEMBL genoome browser21. Selecteer de ~ 800 basis paar "core" sequentie die alle zes gecodeerde miRNA haarspelden van de Locus en ten minste 200-nucleotide flankerende sequenties zowel upstream (5 ') en downstream (3 ') van de kern sequentie omvat.
- Plak de bovenstaande reeks in een Word-bewerkingsprogramma.
- Definieer de volgorde van elk van de zes native haarspelden door ze op te halen in mirbase22. Markeer elk van deze sequenties binnen de reeks van de eerder geïdentificeerde "core" sequentie. Alle sequenties tussen elke haarspeld vertegenwoordigen spacer sequenties, die belangrijk zijn voor de juiste verwerking van het transgene.
- Verwijder de inheemse haarspeld sequenties uit de "kern" sequentie, met uitzondering van 3-5 nucleotiden op zowel de 5 ' als 3 ' uiteinden van elke haarspeld, die als acceptor voor de nieuwe haarspelden zal dienen.
-
Het bouwen van een nieuwe transgen encoding meerdere miRNAs naar keuze
- Verkrijg haarspeld sequenties van miRNAs die bedoeld zijn om te worden overgedruct in het transgen van mirbase. Let goed op de specifieke nucleotiden die de sites van microprocessor decolleté.
- Vervang de verwijderde haarspelden (stap 2.1.4) door de haarspeld sequenties van de gewenste miRNAs, verkregen in stap 2.2.1.
- Voeg de gewenste beperkings sequenties toe aan beide flankerende gebieden van het transgen om het subklonen te faciliteren in de keuze vectoren. Controleer of de gekozen beperkings reeksen niet aanwezig zijn in de volgorde zelf.
- Gebruik voor negatieve controles 20-nucleotide-gecodeerde sequenties om de natuurlijke 20-nucleotide-sequentie van elke volwassen miRNA te vervangen. Genereer deze versleutelde sequenties met een online tool zoals https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
-
Controle van de tweedimensionale structuur van het transgen
- Kopieer de volledige transgene sequentie naar het RNA structuur Voorspellings softwareprogramma RNAweb fold23.
- Klik op Doorgaanmet de standaardprogramma-instellingen.
- Analyseer de grafische uitvoer, met name voor de aanwezigheid van goed gedefinieerde haarspelden en de aanwezigheid van dubbel-gestrande stam structuren ten minste 11 nucleotiden proximale naar de microprocessor decolleté site. Kijk ook naar de afwezigheid van vertakkingspunten binnen de haarspeld sequenties (Figuur 4).
3. verkrijgen van transgenen door DNA-synthese
- Na het ontwerp en in silico validatie van de chimeer Mirna cluster, verkrijgen van de werkvolgorde met behulp van DNA-synthese van commerciële leveranciers24 en verder met downstream klonen in vectoren en transgen levering. We hebben lentivirale vectoren gebruikt voor in vitro levering10 en adeno-geassocieerde virussen (aavs) voor in vivo intracraniële levering25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methode toegestaan karakterisatie van een module van drie miRNAs die consequent worden gedowngereguleerd in hersentumoren, die zijn mede-uitgedrukt specifiek tijdens neuronale differentiatie (Figuur 1) en betrokken bij de tumor Survival reactie na therapie (Figuur 2). Dit wordt bereikt door het reguleren van een complexe oncogene chromatine repressieve traject. Dit co-expressie patroon suggereerde een sterke synergetische activiteit onder deze drie miRNAs (Figuur 3). Als gevolg van de geringe omvang en eenvoudige biogenese van miRNAs, werd het tweede deel van dit protocol gebruikt om een transgen (Figuur 4) te ontwerpen dat gelijktijdig de uitdrukking van de drie mirna's in multiform glioblastoom cellen kon recapituleren, zowel in vitro als in vivo, met significante interferentie in tumor biologie en veelbelovende translationele toepasbaarheid (Figuur 5A, B, C)10. Bovendien werd aangetoond dat de transgene cluster ook functioneel is in een borstkanker model (Figuur 5D, E).
Figuur 1: karakterisering van een functionele miRNA-module in glioblastoma. A) het vulkaan perceel dat de differentiaal uitgedrukt miRNAs vertegenwoordigt in humane multiform glioblastoom monsters (n = 516) versus normaal brein (n = 10) verkregen van tcga. In het groen zijn miRNAs met > 4-voudige verschil. De rode cirkel vertegenwoordigt de 10 meest gedowngereguleerde miRNAs in glioblastoma. B) de relatieve expressie van de 10 miRNAs geselecteerd onder a) tijdens de inductie van verschillende differentiatie trajecten in neurale stamcellen, met duidelijke upregulatie van de modules mir-124, mir-128 en mir-137 tijdens de inductie van neurale differentiatie. Gemiddelde ± SD van drie biologische replicaten (* p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001; Student t-toets, tweezijdige). Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van verwijzing10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: bevestiging van co-expressie patronen van miRNA-modules tijdens genotoxische stress. Relatieve expressie van de drie miRNAs gedefinieerd in Figuur 1 in meerdere multiform glioblastoom cellen en cellijnen (G62-mesenchymale; MGG4-proneural; U251, U87 Pro-neurale-achtige, en T98G mesenchymale-achtige multiform glioblastoom cellijnen) na inductie van resistentie tegen temozolomide (TMZ, roze staven) of ioniserende straling (RT, groene staven). Gerapporteerd zijn middelen met SD van twee onafhankelijke replicaten. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van verwijzing10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: analyse van de functionele convergentie van de targetomes van de co-expressie miRNAs. Venn diagram uitvoer van de bioinformatica en evolutionaire Genomics website, gelijktijdig het overschrijden van de target van gelabelde miRNAs met de Mrna's die een GO categorie van belang zijn (in dit geval chromatine repressors). Mrna's die uniek zijn gericht op één miRNAs werden gekozen voor verdere downstream functionele studies. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4:2D-structuur van een Engineered miRNA-sequentie die de drie miRNAs-cluster codeert. Grafische uitvoer van het RNAweb fold programma. Let op de aanwezigheid van drie goed gedefinieerde stammen-lusstructuren die de haarspelden van elke respectieve miRNA (miR-124, miR-128, miR-137) die zijn gecodeerd door het transgene vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: bewijs van transgen verwerking en het downstream biologisch effect. A) relatieve kwantificering van de Mirna-expressie na lentivirale-gemedieerde transductie van G34 multiform glioblastoom-cellen met het transgene Mirna-cluster (cluster 3) of negatieve controle (CTRL). Gerapporteerd zijn middelen van drie onafhankelijke experimenten ± SD. (B) fluorescentiemicroscoop foto's van G34 multiform glioblastoom-bollen die negatieve controle transgen versus cluster 3-transgen uitdrukken. Schaalbalk = 100 μm.C) in vivo groei van intracraniële humane G34 Cell xenotransplantaten die ofwel controle-of cluster 3-transgenen uitdrukken. Schaal staaf = 1 mm. Dit cijfer is gereproduceerd met toestemming10. D) relatieve kwantificering van de Mirna-expressie na lentivirale-gemedieerde transductie van MDA-MB-231-borstkankercellen met het transgene Mirna-cluster (cluster 3) of negatieve controle (CTRL). (E) fluorescentiemicroscoop beelden van MDA-MB-231 borstkankercellen die negatieve controle transgen versus cluster 3 transgen uitdrukken. Schaalbalk = 100 μm. Alle experimenten werden uitgevoerd in triplicaten (* p < 0,05; * * p < 0,01; Student t-toets, tweezijdige, meervoudige vergelijkingen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 1: werkstroom voor TargetScan. (A) Screenshot van de startpagina, met selectieopties voor Mirna Search. B) representatieve zoekresultaten voor miR-137. De lijst met doel genen bevindt zich in de linkerkolom. Red Box duidt genen aan met geconmaerde targetingsites (wat duidt op een hoger vertrouwen in echte targeting). Klik hier om dit cijfer te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullend figuur 2: ToppGene Suite workflow. (A) Screenshot van de Startpagina waarin het zoekvak wordt weergegeven waarin de lijst met te analyseren genen wordt ingevoegd. (B) representatieve zoekresultaten voor de miR-137 target Ome, met de meest statistisch significante gen Ontology (Go)-categorieën. Klik hier om dit cijfer te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is gebaseerd op het idee dat, in plaats van te functioneren in afzondering, miRNAs biologisch relevant is door in groepen te werken, en deze groepen worden transcriptioneel bepaald door specifieke cellulaire contexten26. Om deze benadering vanuit een translationeel perspectief te rechtvaardigen, wordt een follow-up protocol geïntroduceerd dat het mogelijk maakt dit multi-miRNA-patroon in cellen/weefsels te recreëren. Dit is mogelijk door gebruik te maken van de relatief eenvoudige biogenese van miRNAs, waarbij de herkenning van de kenmerkende miRNA haarspeld door microprocessor noodzakelijk is en voldoende is voor de correcte verwerking van miRNA27. Tegelijkertijd maakt deze minimale eis het gebruik mogelijk van de genetische scaffoud van natuurlijk voorkomende miRNA-clusters als ruggengraat voor de uitdrukking van de gewenste miRNA-modules, die zijn opgenomen in korte DNA-sequenties die kunnen worden gemonteerd in alle leverings vectoren van keuze. De belangrijkste eis van dit protocol is het handhaven van de haarspeld structuur en voldoende lengte van de stuurpen component om een geschikte decolleté mogelijk te maken.
Er zijn twee belangrijke kritische overwegingen met betrekking tot de uitvoering van dit protocol. Het eerste punt is de nauwkeurige bepaling van de optimale miRNA-combinaties. Dit wordt bepaald door een zorgvuldige analyse van niet alleen de handtekening van de miRNA-expressie van cellen of weefsels in vergelijking met besturingselementen, maar ook van eventuele gelijktijdige expressie wijzigingen die worden waargenomen naarmate de cellen experimenteel worden gemanipuleerd. Zodra een verzameling van miRNAs is gedefinieerd, is het ook fundamenteel om vast te stellen dat de kunstmatige modulatie van elke bijzonder de uitdrukking van de andere niet wijzigt.
Het tweede kritieke aspect betreft de constructie van chimerische sequenties om deze functionele miRNA clustering kunstmatig te recapituleren. Het is fundamenteel om zich te houden aan de structurele vereisten van de miRNA-verwerkingsmachines, die de aanwezigheid van een lang genoeg stam sequentie (die ten minste 11 nucleotiden meet) aan de oorsprong van elke miRNA-haarspeld18, evenals het onderhoud van de originele tussenruimte reeksen van de oorspronkelijke miRNA-cluster Scaffold. In onze ervaring heeft het voldoen aan deze twee vereisten consequent het juiste RNA-vouwen opgeleverd (Figuur 4) en geresulteerd in een succesvolle multi-Mirna-uitdrukking.
De belangrijkste beperking van deze techniek is het eindige aantal miRNAs dat kan worden samengevoegd tot een functioneel transgene. We hebben succesvolle sequenties ontwikkeld die tot zes verschillende Mirna's overdrukken, maar we hebben een afname van de verwerkingsefficiëntie waargenomen naarmate het aantal haarspelden toeneemt. Tot nu toe is de genetische structuur van de miR-17-92 cluster gebruikt, omdat het de enige is die het hoogste aantal haarspeld (zes) in de kortste DNA-sequentie codeert (~ 800 baseparen)8. Aangezien er andere natuurlijke miRNA-clusters zijn, wordt verwacht dat ze ook voor dit doel kunnen worden gebruikt28. Ten slotte is geconstateerd dat wijziging van de afstand sequenties tussen de haarspeld vermindert hun verwerking, dus er zijn enkele beperkingen met betrekking tot welke mate de inheemse structuur kan worden gewijzigd.
Het meest significante en voordelige aspect van deze voorgestelde methode is dat het de engineering van transgenen mogelijk maakt die tegelijkertijd meerdere gewenste miRNAs kunnen overdrukken, voornamelijk met behulp van een in silico-benadering, waardoor de behoefte aan vervelend en tijdrovende moleculaire kloon stappen, zoals eerder beschreven29,30,31. Het beschreven protocol is eenvoudig uit te voeren en vereist geen gespecialiseerde apparatuur of vaardigheden.
Met het oog op het erkende belang van miRNAs in de moleculaire biologie en hun potentieel in therapeutische toepassingen, is dit Protocol van belang voor een groot publiek van onderzoekers. Deze aanpak zal naar verwachting toekomstige studies aanmoedigen die zich richten op de combinatorische eigenschappen van miRNAs en zullen dienen als een eenvoudig en robuust hulpmiddel voor de uitvoering ervan. Wat nog belangrijker is, deze geclusterde transgenen vertegenwoordigen ideale cargo's voor gentherapie vectoren. Bewijs van succesvolle in vivo levering van een 3-miRNA-cluster is al verkregen via directe intratumoral intracraniële injectie van AAV-vectoren (niet-gepubliceerde gegevens). Zo wordt verwacht dat deze techniek de translationele aspecten van het onderzoek van miRNA aanzienlijk zal verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs melden geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs willen de leden van het Harvey Cushing Neuro Oncology laboratorium bedanken voor hun steun en constructieve kritiek. Dit werk werd gesteund door NINDS Grants K12NS80223 en K08NS101091 aan P. P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Esteller, M.
- Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
- Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
- Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
- Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
- He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
- Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
- Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
- Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
- Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
- Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
- Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
- Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
- Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
- Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
- Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
- Aken, B. L., et al.
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
- Lorenz, R., et al.
- Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
- Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
- Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
- Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
- Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
- Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
- Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
- Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).
