Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

השוואת הכליה גרורות תא כליות קרצינומה של תא מודל הוקמה בתוך כליה העכבר על עוף כוראולאלי ממברנה

Published: February 8, 2020 doi: 10.3791/60314
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 1, 1,8
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Bioengineering, Hanyang University, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6School of Life Sciences, Beijing Normal University, 7Department of Urology, West China Hospital, Sichuan University, 8Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles
* These authors contributed equally

Summary

ברור גרורות תא כליות קרצינומה של תאים היא מחלה ללא מודל בעל חיים כולל לחקירה יסודית מראש. פרוטוקול זה ממחיש שני מודלים של בעלי חיים חדשניים עבור המחלה: מודל העכבר המושתל אורתולמריחה ומודל ממברנה של עוף כוראלואלי, שניהם הפגינו גרורות בריאות הדומה למקרים קליניים.

Abstract

ברור גרורות תא הכליה קרצינומה של תאים (ccRCC) הוא סוג המשנה הנפוץ ביותר של סרטן הכליה. CcRCC מקומי יש תוצאה כירורגית חיובית. עם זאת, שליש מהחולים ccRCC יפתחו גרורות לריאות, אשר קשורה לתוצאה גרועה מאוד עבור חולים. למרבה הצער, אין טיפול זמין בשלב זה קטלני, כי המנגנון המולקולרי של גרורות נשאר ידוע. זה ידוע במשך 25 שנים כי אובדן הפונקציה של פון היפפל-ינדאו (VHL) גן מדכא הגידול הוא pathognomonic של ccRCC. עם זאת, לא נוצר מודל העכבר הטרנסגניים רלוונטי קלינית של ccRCC. המטרה של פרוטוקול זה היא להציג ולהשוות שתי מודלים בעלי חיים שהוקמו לאחרונה עבור ccRCC גרורתי. הראשון הוא השתלת כליות במודל העכבר. במעבדה שלנו, המערכת לעריכת גנים CRISPR היה מנוצל כדי להפיל את הגן VHL בכמה קווי תא RCC. אורתוקרט השרשה של אוכלוסיות ccRCC הטרוגנית לקפסולה כליות יצרה מודלים ccRCC הרומן לפתח גרורות ריאות חזקה בעכברים המוסמכת. המודל השני הוא מערכת קרום כוראלואלי של עוף (CAM). בהשוואה למודל העכבר, מודל זה הוא יותר זמן, עבודה, וחסכוני. מודל זה תמך גם היווצרות הגידול חזק ומלא. בשל הקצר 10 תקופה של גידול הגידול ב CAM, לא גרורות גלוי נצפתה על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC) ברקמות העובר שנאספו. עם זאת, כאשר גידול הגידול הוארך על ידי שבועיים בעוף מקווקו, מיקרומטר נגעים ccRCC נצפו על ידי IHC בריאות. אלה שני דגמים מראש רומן קליני יהיה שימושי כדי ללמוד עוד מנגנון מולקולרי מאחורי גרורות, כמו גם להקים חדש, החולה נגזר xenografts (PDXs) לקראת פיתוח של טיפולים חדשניים עבור ccRCC גרורתי.

Introduction

קרצינומה של תאי הכליה (RCC) הואהסרטן הנפוץ ביותר 7 בארצות הברית. מדי שנה, 74,000 אמריקאים מוערך להיות שאובחנו לאחרונה, חשבונאות עבור יותר מ 14,000 מקרי מוות (ברור תא משנה היסטולוגית, או ccRCC, הוא סוג המשנה הנפוץ ביותר, חשבונאות עבור כ 80% של מקרים RCC. חולים עם ממאירות מותאמים לשפות אחרות מטופלים עם כריתת הנפרוטומיה ויש להם שיעור חיובי הישרדות 5 שנים של 73%1. עם זאת, 25%-30% מהחולים לפתח גרורות רחוקות איברים חיוניים כגון הריאות, וכתוצאה מכך הישרדות עני מרושע של 13 חודשים ושיעור ההישרדות של 5 שנים של רק 11%1,2,3. הבנה נוספת של מנגנון גרורתי נדרש כדי לשפר את התוצאה הקטלנית של ccRCC גרורתי.

ההפסד של הגן מדכא סרטן vhl הוא נגע גנטי החותם נצפתה ברוב של מקרים האדם ccrcc4,5,6,7. עם זאת, המנגנון האונגניים המדויק של אובדן VHL ב-ccRCC אינו ידוע. כמו כן, מצב ביטוי VHL אינו ניבוי של תוצאה ב-ccRCC8. בעיקר, למרות ניסיונות רבים על הכליה-אפיתל-המיקוד VHL ממוקד, מדענים לא הצליחו ליצור חריגות כליות מעבר לנגעים פיברוזיס preneoplastic נצפתה בעכברים9, גם כאשר בשילוב עם מחיקה של דכאי גידול אחרים כגון pten ו p5310. ממצאים אלה תומכים ברעיון כי הפסד VHL לבד אינו מספיק עבור tumorigenesis או גרורות ספונטנית הבאים.

לאחרונה, המעבדה שלנו יצרה הסתרה vhl חדש (vhl-KO) קו התא באמצעות מחיקת crispr/Cas9 בתיווך של הגן vhl ב-murine vhl ושקו התא (renca, או vhl-WT)11,12. הראנו כי VHL-KO היא לא רק mesenchymal, אלא גם מקדם את האפיתל למעבר mesenchymal (פרמדיק) של VHL-WT תאים12. חובש ידוע לשחק תפקיד חשוב בתהליך גרורתי13. העבודה שלנו עוד הראה כי גרורות ריאה מרחוק מתרחשת רק עם השרשה של VHL-KO ו VHL-WT תאים בכליה, תמיכה מנגנון שיתופי של גרורות. חשוב לעשות זאת, הדגם VHL-KO המושתל שלנו, והמודל VHL-WT שלנו, מוביל לגרורות ריאות חזקות, ובכך מופקת את התיקים הקליניים של ccRCC. המודל הספונטני הזה של ccRCC מפצה על חוסר מודל העכבר הגרוגני הטרנסגניים, במיוחד בפיתוח של תרופות נגד גרורות הרומן. פרוטוקול זה מדגים את ההשתלה קפסולת הכליות של אוכלוסיות תאים הטרוגנית של תאי RENCA הנדסה גנטית.

עוף פקה מודלים יש היסטוריה ארוכה במחקר על אנגיוגנזה וביולוגיה של הגידול בשל היתרונות הרבים שלהם, כפי שמסוכם בטבלה 114,15,16,17,18. בקצרה, חלון הזמן עבור צמיחה הגידול פקה קצר, המאפשר מקסימום של 11 ימים עד מצלמת הושמדה על ידי בקיעה של עוף16. למרות זמן הצמיחה הקצר, אספקת התזונה העשירה והמצב החיסוני של העובר העופות מאפשרים הגידול היעיל מאוד בתאום16,19,20,21. לבסוף, העלות של כל ביצה מופרית היא ~ $1, לעומת מעל $100 עבור העכבר SCID. יחד, מודל מצלמת יכול לשמש כמודל בעלי ערך חלופי בעלי חיים בהקמת PDXs חדש בחיסכון גדול בזמן ועלות בהשוואה לעכבר. בפרוטוקול זה, אנו העריכו אם המודל היה מסוגל ללכוד את הביולוגיה של ccRCC גרורתי שנצפו במודל העכבר הנושא אורתוקרט.

(SCID) עכבר צלמת הערה
עלות > 100 דולר לכל ~ $1 כל הכדאיות החל מ 50-75%
הצורך בדיור מחסום כן לא עוד מפחית עלות & מפשט ניטור סדרתי של גידולים
הגידול נראה ישירות לא כן איור 3A
הזמן לחרט הראשון (RENCA) 2 שבועות 2-4 ימים שופט 14, 15
נקודת השיא של הצמיחה (RENCA) 3-6 שבועות 10 ימים שופט 14, 15
גרורה (RENCA) נצפתה כן כן אצל אפרוחים איור 3D
מעברים סידוריים כן כן 16-18 שופט
מעבר לעכברים (RENCA) כן כן הו, ג'יי, ואח ' ביקורת (2019)
לשמור על טרוגניות הגידול כן כן הו, ג'יי, ואח ' ביקורת (2019)

טבלה 1: יתרונות ומגבלות של העכבר ומודלים קאם. הטבלה הזאת משווה בין שני המודלים ליתרונות ולמגבלות שלהם במונחים של זמן, עלות, עבודה וביולוגיה. מודל CAM יש יתרונות ביעילות, אבל יש לו גם מגבלות ייחודיות משלה בשל המבנה השונים בין ציפורים ויונקים. לכן, חשוב לאשר כי המודל יכול לשמור על ביולוגיה של שתלי xenografts

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ולהשתמש הוועדה (IACUC), המיועדים הוועדה לחקר בעלי חיים של הקנצלר UCLA (ARC) (ARC 2002-049-53 ו ARC 2017-102-01A). פרוטוקול 2002-049-53 הוא אופטימיזציה עבור ההשתלה של התאים הסרטניים ccRCC לתוך קפסולת הכליה של עירום או BALB/c עכברים. ניסויים בהשתלת הגידול בביצים עוף מופרות לפני הבקיעה אינו דורש אישור IACUC. כדי להאריך את הזמן להקמת גרורות ריאות, העוברים עם גידול CAM מותר לבקוע ולצמוח לתוך תרנגולות. פרוטוקול 2017-102-01A מכסה ניסויים אלה בעלי חיים.

1. אורתוטופית לימודי הגידול בעכברים

הערה:ציר הזמןלניסוי זה מוצג באיור 1. הליכים אלה הותאמו מפרסומים קודמים11,12.

  1. הכנת השעיית תא בודד להשתלת השתלה
    1. לנתק את התאים RENCA VHL-WT ואת VHL-KO מתוך מנות התרבות באמצעות טריפסין/EDTA.
    2. לספור את התאים עם הומוציטוטומטר ולהשעות מחדש בתערובת מראש 1:1 של PBS ופתרון מטריצה מסחטות בריכוז של 1 x 105 תאים/μl.
      הערה: השתמש ביחס 1:4 של VHL-WT: תאים VHL-KO עבור שתלים הטרוגנית ו-VHL-WT ללבד עבור שתלים אחידים.
    3. העבר את התאים מחדש לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ולשמור על קרח עד השרשה.
  2. השרשה לקפסולת הכליות
    1. הרדמה: מחממים משטח חם עד 37 ° c ומכסים אותו בפיסת כיסוי עבה וסטרילי. הזרקת את העכבר על ידי אינהלציה של שאיפה באמצעות חדר אינדוקציה או הזרקה בתוך הצפק (IP) של 1% פנטוברביטל נתרן במינון של 10 מ"ל/ק"ג.
    2. . תגלח את השיער מהאתר הכירורגי ניתן לדלג על שלב זה עבור עכברים ערומים.
    3. חיטוי וכירורגי draping: לחטא את החלק האחורי של העכבר לגמרי עם povidone-יוד 3x ואחריו 70% אתנול 1x ולנגב אותו יבש עם מטליות כותנה סטרילית. לאחר מכן להחיל שלושה תחבושות רפואיות סטרילי ברציפות, המכסה את כל הגב כדי ליצור שדה כירורגי, כמו גם כדי לשתק את העכבר.
    4. החתך והכליות: לפני הניתוח, לחטא את האצבעות של המפעיל עם povidone-יוד או להשתמש בזוג כפפות סטרילי. הניחו את העכבר בתנוחה הנוטה והשתמשו באצבעות כדי לאתר את הכליה השמאלית בדיוק מתחת לאגף השמאלי. השתמש בזוג מלקחיים ומספריים בוטים כדי לחתוך את העור פתוח ואת שכבת השריר תחת המיקום שצוין. השתמש מטליות כותנה סטרילי מלקחיים כדי לחלק את הכליה השמאלית מחוץ לבטן.
    5. השתלת תא הגידול: לטעון את ההשעיה התא מוכן בשלב 1.1 בתוך מזרקים או אינסולין או אישית מזרקים המילטון (ראה טבלת חומרים עבור מפרטים). הכנס 20 μL של תאים שהושעו מחדש תחת קפסולת הכליות.
      הערה: הזרקה מוצלחת נקבעת על ידי היווצרות של בליטה שקופה על פני השטח של הכליה. הזרקה בשוגג לתוך כליות מערכת התוצאות דימום ושיעור התמותה שלאחר הניתוח גבוה כמו 90% בשל דימום קטלני באתר ההזרקה.
    6. לאט למשוך את המחט על מנת לאפשר את פתרון מטריקס החילוץ כדי לחזק ולמנוע דימום או דליפת תא הגידול. ואז, באמצעות מנקי כותנה סטרילית, לדחוף את הכליה בחזרה לתוך הבטן.
    7. תפרים הפצע: להשתמש בתפר 5-0 VICTRYL מצופה לתפור את שכבת השריר. לחטא את העור עם povidone-יוד פעם אחת ולסגור את העור עם הפצע אוטוקליפים.
    8. התאוששות: למקם את העכבר על משטח חם עד שהוא מתעורר. אם העכבר היה מורדם על ידי שאיפת, לסגת את isof, ולשמור את העכבר על המשטח החם עד שהוא ער.
  3. ביולומינסנציה הדמיה (בלי) ואוסף רקמות
    1. שישה שבועות לאחר השתלת הגידול, לקחת גחלילית-לוציפראז מבוסס בלי תמונות. ואז המתת החסד עם השאיפה. לאחר פריקה צוואר הרחם
    2. לאסוף דם עבור במחזור תא הגידול (CTC) זיהוי ידי cy try זרימה.
    3. הגידול ואברי העניין (הכליות, הריאות, הכבד, המעיים והטחול) באמצעות טכניקה סטרילית לקצירת רקמות22. לתקן אותם ב 4% פאראפורמלדהיד לילה עבור פרפין-שעווה הטבעה.

2. מודל הגידול של מצלמת הגידולים

הערה: הליכים אלה הותאמו והשתנו מפרוטוקוליםשפורסמו בעבר 23,24. ציר הזמן עבור הליך זה מוצג באיור 1B. מאמר זה מציג רק את הפרוטוקול היעיל. עבור פרוטוקולים מפורטים, עיין במאמר יופיטר אחר שפורסם על ידי הקבוצה שלנו25.

  1. טרום דגירה: המריטה טרי, ביצי עוף מופרית בחממה מסתובבת ביצה ב 37 ° c ו 55-65% לחות במשך 7 ימים.
  2. שחרר את מצלמת הפתיחה והחלון הפתוח (יום התפתחותי 7):
    1. אתר וסמן את. שק האוויר והורידים
      הערה: בדרך כלל 10-15% מהביצים מוסרות משום שהן אינן מופרות או מתות בתוך 7 ימים של הפריה.
    2. צור שק אוויר חדש על גבי וריד מסומן.
    3. להתוות את שק האוויר החדש, להחיל קלטת אריזה, ולשים את הביצים בחזרה לחממה.
      הערה: ניתן להשהות את ההליך כאן. מומלץ לחדש את ההליכים בתוך אותו היום משום שהאוויר עשוי לנוע.
    4. לפתוח חלון: באמצעות זוג מספריים מעוקל המספריים וזוג של מלקחיים האף מחט, חותכים 1.5 x 1.5 ס מ החלון העגול במעטפת.
      הערה: השיבוש של מצלמת מצוין על ידי הדם פיסת CAM להציג על פיסת פגז לחתוך.
    5. חותם את החור ברוטב רפואי שקוף ומניחים את הביצים בחממה נייחת ב-37 ° c ו-55%-65% לחות.
      הערה: השתמש בחממה באותו הביצה כמו בשלב 2.1. כבה את הסובבי. כדי להפוך אותו לנייח
  3. בדיקת בריאות (יום התפתחותי 9): להסיר ביצים מתות ולאחר מכן באקראי לקבץ את שאר הביצים עבור השתלת תאים סרטניים.
    הערה: באופן אידיאלי, שיעור ההישרדות בשלב זה הוא כ 80% מיום ההתפתחות 0.
  4. השתלת התאים הסרטניים על מצלמת חדש נחשף (יום התפתחותי 10)
    1. לדלל את פתרון מטריקס מטריתאי בכמות כפולה של RPMI 1640 מקורר (עם L-גלוטמין). ניתוק התאים RENCA ולהשעות מחדש את הפתרון הנ ל כדי להגיע לריכוז של 2 x 104 תאים/μl.
      הערה: השתמש ביחס 1:1 של VHL-WT: תאים VHL-KO עבור שתלים הטרוגנית ו-VHL-WT בלבד עבור השרשה הומוגנית.
    2. כדי לגבש את ההשעיה התא, למלא 100 μL של כל מיקס תא ב 200 μL הפיפטה טיפים ולמקם אותם בחממה תא עבור 15 דקות.
    3. שתל 100 μL של השעיית התא עבור כל ביצה על פני השטח של CAM דרך החלון.
      הערה: פרוטוקולים מסוימים דורשים גירוד מצלמת לפני השרשה23. זה לא הכרחי עבור תאים RENCA, כי הם גדלים מהר מאוד.
  5. לגדול תאים על מצלמת עבור 10 ימים וצילום כל יומיים.
  6. המתת חסד וקציר הגידול, הדם והאיברים.
    1. ביום התפתחותי 20 (יום הגידול 10), לאסוף דם דרך הווריד כוראלאלי עם מזרק 10 מ"ל heparinized.
    2. המתת חסד לעוברים על ידי השמת אותם על קרח במשך 15 דקות.
    3. . לקצור ולשקול גידולים לנתח את הריאות ואת הכבדים באמצעות טכניקה סטרילית לאסוף רקמה דומה לזה המשמש עכברים22.
      הערה: לתרנגולות כבדים יש שתי אונות, שהן האיברים הראשונים הנראים בחלל הבטן. . אל תבלבל בין אלה לריאות הריאות העוף ממוקמות תחת הלב ומחיצת26. האוסף המוצלח של הריאות יכול להיות מאושר על ידי צלעות חשופות.
    4. תקן את הגידולים ואת האיברים לגזור ב 4% פאראפורמלדהיד לילה עבור פרפין-שעווה הטבעה.
  7. . לבקוע את התרנגולות
    1. כדי לאפשר תקופה ממושכת של גידול הגידול, להמשיך את הדגירה ביום 21 ולתת התרנגולות לבקוע ב 37 ° c ו לפחות 60% לחות.
      הערה: תרנגולות באופן טבעי לבקוע אחרי יום 21 במשך 24 שעות, אבל מדי פעם יש בעיות הבקיעה בעצמם. במקרה הזה, לפצח את קליפות הביצה כמה עוזר. חשוב לתרנגולות להשלים את תהליך הבקיעה בתוך 24 שעות, כי הם ימותו מהעדר חומרים מזינים לאחר מכן.
    2. הגדל את התרנגולות במתקן לבעלי חיים (2017-102-01A) במשך שבועיים.
    3. ביום ההתפתחותי 34 (יום הגידול 24), המתת החסד את האפרוחים עם אינהלציה של שאיפת הרחם ואחריו פריקה צווארי.
    4. לנתח את הריאות באמצעות טכניקה סטרילית לקצירת רקמות דומה לאלה המשמשים עכברים22. ואז, לתקן אותם ב 4% פאראפורמלדהיד לילה עבור פרפין-שעווה הטבעה.

3. אימונוהיסטוכימיה

הערה: מעבדות הליבה וכתמים H & E נעשה על ידי המעבדה לליבת מחלות טרנסלtional (TPCL) באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס.

  1. לאפות שקופיות ב 65 ° c עבור 20 דקות והחוצה 3x באמצעות קסילן ו מחדש באופן סדרתי מ 100% אתנול למים.
  2. אחזר את האנטיגנים במאגר ציטראט שבושל במשך 25 דקות.
  3. החל 1% שיוך אבטחה עבור חסימה. לאחר מכן להחיל את הנוגדנים העיקריים (אנטי VHL, anti-HA, נגד דגל) הכין ביחס דילול 1:200 ב-PBS. המלון משלב בין לילה ב -4 ° c.
  4. לאחר כביסה 3x עם TBST (7 דקות כל אחד), דגירה שקופיות עם הנוגדן המשני ב 1:200 דילול. לרחוץ את 3x עם TBST (7 דקות כל אחד) ולהחיל ריאגנטים לאחר מכן על ידי המטאוקסילין כתמים.

4. הזרמה של הציטומה

  1. לעבד את העכבר או דם התרנגולות עם מאגר הליזה של תא דם אדום (RBC) בהתאם לפרוטוקול של היצרן.
    הערה: הליזה RBC מספקת חשוב במיוחד כאשר ניתוח דם CAM כי העוף RBCs הם נוקלאווניים ולא ניתן להבחין בקלות בזרימה cy, לנסות באמצעות פיזור הקדמי בצד.
  2. הפעל cy, להפעיל את הזרימה על דם ולנתח את הנתונים עבור הביטוי mStrawberry ו-EGFP.
  3. הגדר את השערים הראשיים על בסיס פיזור החלק הקדמי והצד, ללא הריסות, תאים מתים ומערכת RBCs.
  4. הגדר את שערי הזריחה בהתבסס על הדגימות הבלתי מוכתמות והפקדים המוכתמים בודדים. השתמש בדם מוכן עם VHL-WT, VHL-KO, או בתאי RENCA בלתי מתויג כמו בקרות מוכתם יחיד ופקדים ללא מוכתם, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כל ניסוי בוצע לפחות 3 x, אלא אם נכתב אחרת. נתונים מוצגים כמשמעות של ± סטיית תקן (SD). המשמעות נקבעה על ידי מבחן T של סטודנט משויך, כאשר היו שתי קבוצות או על-ידי ANOVA בכיוון אחד כאשר היו שלוש קבוצות או יותר. הפסקת ערך p של 0.05 שימש לקביעת משמעות.

מושתל אורתולמריחה תאים RENCA גדל בהצלחה על הכליות עכברים, כפי שאושרו על ידי בלי מ& E הצביעת (איור 2א-ב). למרות שלא היה כל הבדל בצמיחה העיקרית, רק הטרוגנית, הגידול גרורתי היה גרורות חזק לריאות כפי שצוין על ידי האות מאוד חזק בלי המוני וגושים גרורתי בצביעת H & E. מצד שני, גידולים הומוגניות, לא גרורות לא גרורות לאיברים רחוקים. ספירות CTC היו גבוה יותר עכברים בעלי גידולים גרורתי מאשר אלה הנושאים גידולים שאינם גרורות (איור 2C-D).

באמצעות קונקורדנציה עם מודל העכבר, מערכת CAM שמרה בהצלחה את הצמיחה התנהגות גרורתית של גידולים RENCA. אמנם לא היה הבדל הגדילה בין גידולים גרורות ולא גרורתי, ספירות CTC היו גבוהים באופן משמעותי בביצים עם גידולים גרורתי מאשר אלה עם עמיתיהם לא גרורתי (איור 3A-C). בקיעה ביצים עם מצלמת וגידולים ומאפשר לאפרוחים לגדול שבועיים נוספים המורחבת התקופה עבור תאים סרטניים גרורות להקים גרורות היסטולוגית לזיהוי בריאה של אפרוחים, כפי שמוצג ב-H & E ו HA כתם של עוף מקטעים רקמת ריאה (איור 3ד). רוב של גושים גרורתי מורכב HA-tagged VHL-WT תאים, בעוד דגל-מתויג VHL-KO נראו לעתים נדירות, כפי שצפינו בעכברים.

Figure 1
איור 1: סקירה של שתי מודלים של בעלי חיים עבור מודל משני של החיות. (A) ייצוג סכימטי של מודל העכבר האורתוטופית. 3-או 4-שבוע עכברים בני מושתל למריחה עם גידולים שאינם גרורות או גרורתי. שישה שבועות לאחר השרשה, צמיחת הגידול גרורות היו דמיינו עם בלי. ואז, הגידול, הדם והאיברים. נאספו לניתוח במורד הזרם (ב) ייצוג סכמטי של דגם CAM המציג את השלבים הבאים: קדם-דגירה, פתיחת חלון, השתלת תאים והמתת חסד לפני או אחרי הבקיעה. אותם ניתוחים כמו מודל העכבר מתנהלים עבור דגימות שנאספו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צמיחת הגידול גרורות בעכברים המושתל אורתולמריחה. (א) בלי עכברים ואיברים שחולצו (כליה, ריאות, כבד, המעי והטחול) 6 שבועות לאחר השרשה אורתוטופית של תאי renca. שמאל: לא גרורתי (לא מתקיים), מימין: גרורתי. (ב) ברוטו והגדלת ההגדלה של H & E כתמים עבור הכליה והריאה (20x ו 100x). שמאל: לא גרורתי (לא מתקיים), מימין: גרורתי. (ג) ניתוח תזרים מייצג לזיהוי התאים המסטרו + ו-egfp במחזור הדם. (ד) אחוז בגרף האוכלוסייה של מחזורי התאים mstraw + ו-egfp +. לא-מפגש: לא גרורתי. פאנל A הותאם מ הו ואח '27. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: צמיחת הגידול גרורות במודל CAM. (א) הגידוליםrenca גדל ב CAM. . היו 7 חזרות לכל קבוצה לא-מפגש: לא גרורתי. (ב) ניתוח תזרים מייצג לזיהוי התאים המסטרו + ו-egfp במחזור הדם. (ג) אחוז בגרף האוכלוסיה של מחזורי התאים mstraw + ו-egfp +. * * p < 0.01. (ד) ihc כתמים של הריאה מבחורה בת 2 שבועות נושאת גידול גרורתי במהלך השלב העובריים שלה. משמאל, המקטעים מציגים כתמים של H & E, HA, ומכתים דגלים. : עורק הריאתי של העוף; ראש חץ: גושים גרורתי. הדמות הותאמה מ-Hu J ואח '27. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עבור חולים רבים עם ממאירות אפיתל, גרורות לאיברים חיוניים הוא הגורם העיקרי לתמותה. לכן, חיוני למצוא את המנגנון הבסיסי ואת השדרה החדשה של טיפול במחלה גרורתית. למרבה הצער, יש היעדר מודלים של בעלי חיים מגרורתי הרלוונטיים. האתגר בחלק הגדול נובע מחוסר יכולת לשחזר ccrcc בעכברים למרות הדור של כליות הטרנסגניים רבים האפיתל ממוקד vhl מודליםהעכבר 9,10. כאן, אנו להדגים את השיטות כדי ליצור הוהשתלות גרורות ccRCC גידול בשתי מערכות בעלי חיים, העכבר ומצלמת העוף. ממצאים אלה אומתו התנהגות גרורתית של גידולים בשתי סביבות שונים, ובכך לספק הזדמנויות ייחודיות כדי לחקור עוד יותר את המנגנון המולקולרי של גרורות. בדגם הראשון, האוכלוסייה RENCA הטרוגנית הושתל לעכברים המוסמכים אורתוגניים למריחה על הכליה שלהם. לאחר 6 שבועות, עכברים אלה הראו גרורות ריאה משתולל. באמצעות קונקורדנציה עם מודל העכבר, השרשה של תאים RENCA הטרוגנית על מצלמת בהצלחה גדל ומלא לתוך הדם של עוברי האפרוח. על ידי הרחבת תקופת גידול הגידול 2 שבועות לאחר הבקיעה, גרורות ריאות הדומה לאלה שנראו בעכבר נצפו באפרוחים.

עבור שני הדגמים, תשומת לב מדוקדקת לפרטים הטכניים של כל צעד ותרגול כדי לשפר את הכישורים הטכניים הם חיוניים כדי להגדיל את ההישרדות בעלי חיים ואת הגידול מוצלחת בתאום גרורות. עבור מודל העכבר, בחירה זהירה של ציוד הזרקה מדויקת של תאי הגידול לקפסולה כליות למקסם את שיעור ההצלחה על ידי הפחתת התמותה שלאחר הניתוח והגדלת הסיכוי לגידול לקבל אספקת דם נאותה לצמוח ו גרורות. מודל CAM דורש אופטימיזציה יותר ההתקנה ואת הטכניקה. בלימודים שלנו, התפקוד העובר היה מתחת ל -30% בהתחלה. חשוב לשמור הן את הטמפרטורה ואת הלחות לרמה הרצויה בכל עת על ידי בעל ציוד טוב, ניטור תכופים, והשלמה מהירה יותר של ההליכים. גם לאחר אופטימיזציה, ההישרדות נע בין 50-75% בהתאם לניסויים ואת הקבוצה הבודדת של ביצים. מומלץ תמיד להזמין ביצים נוספות לגיבוי. בניסיון שלנו, מאסטרינג טכניקות CAM דורש מעל 1 שנה. שחרור קרום מצלמת ופתיחת החלון הוא צעד קריטי שבו בשוגג, נזק קטלני העובר בדרך כלל מתרחשת. יכולת הכדאיות של העובר הנשי ניתן לשפר על ידי מניעת נזק CAM.

ישנן מספר מגבלות על המודל הגידול CAM. ראשון הוא תחולתה של המודל לכל סוגי תאי הגידול. יש לנו 100% שיעור הצלחה חרט שונה שונים תאים סרטניים הגידול על קאם, כולל כליות, שלפוחית השתן, ואת הערמונית תאים הגידול קווי (RENCA, ACHN, T24, HT1376, CWR22Rv1, C4-2, Myc-CaP) ו סרטן השחלות קווי התאים (ID8 ו SKOV3). שני מחקרים נוספים מהקבוצה שלנו לספק מידע נוסף על אלה גידולים מצלמת25,27. עם זאת, התפתחותם של כמה תאים סרטניים בשחלות על CAM משופרת על ידי תוספת של גורם הגידול או תאים הקשורים לגידול25. האופטימיזציה של מספר התא או גורמי גידול חיוניים עבור כל קו תא או סוג הוא חשוב. אנו גם לשלב כתב או לסמן גנים, כגון לוציפראז, חלבון תגיות (למשל, הא או דגל), או תגיות פלואורסצנטית (למשל, mstrawberry או egfp), כדי להקל על ניטור הצמיחה גרורות של הגידול בבעלי חיים25,27. בהתבסס על הניסיון שלנו, רוב גדול של שורות תאים מתרבים סרטן ניתן להקים על CAM. מגבלה מפתח לחרט עשוי להיות קצר 10 יום חלון מותר לצמיחה הגידול, אשר יכול להיות מאתגר במיוחד לקו התא איטי הגוברת להקים מסה מספקת במסגרת זמן קצר כזה.

קיצור נוסף של מודל CAM הוא ההבדל בפיזיולוגיה בין העובר העופות והיונקים. גרורות מן הגידול מצלמת לאיברים העיקריים כגון הכבד או הריאות של העובר זוהה בעיקר על ידי רגיש הטכניקות PCR28. תקופת זמן קצר של צמיחה ב-CAM לא יהיה מספיק כדי ליצור נגעים גרורתי גדול שניתן לאמת על ידי ניתוחים היסטולוגית. יתר על כן, הפחתת כלי הדם מופחתת של ריאה העובר מנופח אינו מוצדק להקמת או תמיכה בצמיחה של גרורות בריאות. כדי להתגבר על מגבלות אלה, אישור מתוך הוועדה המוסדית שלנו לשימוש בעלי חיים (IACUC) הושגה תרנגולות מקווקוו מעוברי הגידול של מצלמת פקה והבית אותם עוד 2 שבועות לאחר הבקיעה. הארכת זמן צמיחת הגידול בצורה זו אפשרה לנו לגלות גרורות ריאות רחוקות על ידי IHC. למרות מחקרי עוף מקווקו דורשים אישור IACUC נוספים כי מחקרים הגידול פקה לא, גישה זו מספקת הזדמנות רבת ערך ללמוד את האשד גרורתי תרנגולות כפי שנעשה בעבר בעכברים. המערכת החיסונית של עוף דווחה לפתח החל ביום 12 פוסט הפריה20. בהינתן יעילות גבוהה של עפיל מורנה נגזר גידולים renca דיווחו כאן ורבים אחרים תאים סרטניים האנושי ו pdxs ב מצלמת ביום 10 לאחר הפריה24,25,27, אנחנו יכולים להסיק כי המערכת החיסונית בעובר לא מפותחת בשלב זה. הגומלין של המערכת החיסונית של העוף ואת הגידול CAM בבירור מצדיק חקירה נוספת.

העבודה שלנו מספק ראיות תומכות חזקה כי המודל הגידול CAM יכול להיות הראשונית פשוטה במודל vivo ללמוד סרטן בביולוגיה, כולל גרורות. בשל המגבלות שצוינו לעיל, מודל CAM לא צריך להחליף את מודל העכבר, אבל משלימים אותו. המחקר המתמשך שלנו מרמז כי האות מוצלב בין אוכלוסיות תאים הטרוגנית ב ccrcc הוא אינסטרומנטלי המסדירים התקדמות גרורתית11,12. השימוש הן מודלים מצלמת ועכבר יכול להיות אמצעי יקר לאמת את הוצלב גרורתי במשחק ccRCC. אנו מאמינים יתרונות רבים של מודל CAM הציג כאן יכול להאיץ את קצב הגילוי של מנגנונים גרורתי הרומן טיפולים יעילים כדי לתקן את השלב הקטלני הזה של סרטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

העבודה הזאת ממומנת על ידי מענק הזרע JCCC באוניברסיטת ucla, המענק 3R של ucla, UCLA CTSI, ו-UC TRDRP (LW). אנו מודים למכון לדימות מראש של מכון Crump, TPCL, ו-UCLA של מחלקת רפואת בעלי חיים במעבדה (DLAM) על עזרתם בשיטות נסיוניות. Cy, הזרמת מחלות של מרכז הסרטן של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (JCCC) והמרכז לחקר האיידס של מכון המחקר Cy, הנתמך על ידי מכונים לאומיים של פרסי בריאות P30 CA016042 ו 5P30 AI028697, ועל ידי JCCC, מכון האיידס של UCLA, בית הספר לרפואה ע ש דויד גפן באוניברסיטת קליפורניה, משרד הקנצלר של UCLA, ומשרד המחקר של סגן הנשיא באוניברסיטת ucla. שירותי ייעוץ וניתוח נתונים לסטטיסטיקה סופקו על ידי תוכנית ביוסטטיסטיקה, אפידמיולוגיה ותכנון מחקר (BERD) הנתמכת על ידי NIH/המרכז הלאומי לקידום מדעי המדינה באוניברסיטת UCLA מספר UL1TR001881.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate Corning 25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit Dremel 8050-N/18
anti-VHL antibody Abcam ab135576
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes BD Biosciences 14-826-79
BD Pharm Lyse BD Biosciences 555899
BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles Fisher Scientific 14-826-5D
DAB Chromogen Kit Biocare Medical DB801R
D-Luciferin Firefly, potassium salt Goldbio LUCK-1G
DPBS without Calcium and Magnesium Gibco LS14190250
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) eBioscience 14-6681-82
Ethanol 200 Proof Cylinders Management 43196-11 Prepare 70% in water
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions Fisher Scientific 10-437-028
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-940
Fisherbrand Sterile Cotton Balls Fisher Scientific 22-456-885
FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology MilliporeSigma 1.00496.5000
Hamilton customized syringe Hamilton 80408 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm
HA-probe Antibody (Y-11) Santa Cruz Biotechnology sc805
Hemocytometer Hausser Scientific 3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit Incubator Warehouse HB1588D
Isothesia (Isoflurane) solution Henry Schein Animal Health 1169567762
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System Perkin Elmer
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning C354230
Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" Medex Supply MED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation MilliporeSigma 2910-25GM
Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin Fisher Scientific MT-30-002-CI
Pentobarbital Sodium Sigma Aldrich 57-33-0 Prepare 1% in saline
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-062
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-045
Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use Ricca Chemical 395516
pSicoR Addgene 11579
Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC227420500
Renca ATCC CRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine Corning 10040CV
Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile Fisher Scientific AB-0700
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) Thomas Scientific 1159M40
Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls Office Depot 220717
Suture Ethicon J385H
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" Moore Medical 1634
Thermo-Chicken Heated Pad K&H manufacturing 1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) Tygon AACUN017
VHL-KO CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase
VHL-WT Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase
World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR Fisher Scientific 50-822-331
Wound autoclips kit Braintree scientific, inc. ACS KIT
Xylenes (Histological), Fisher Chemical Fisher Scientific X3S-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
  3. Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
  4. Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
  5. Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
  6. Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
  7. Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
  8. Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
  9. Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
  10. Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
  11. Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
  12. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
  13. Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
  14. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
  15. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  16. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
  17. Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
  18. Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
  19. Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
  20. Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
  21. Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
  22. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  23. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
  24. Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
  25. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
  26. Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
  27. Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
  28. Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 156 קרצינומה של תאי הכליה גרורות מודל בעל חיים השתלת כליות קאם מחיקת גנים VHL intrאטומוראלית טרוגניות
השוואת הכליה גרורות תא כליות קרצינומה של תא מודל הוקמה בתוך כליה העכבר על עוף כוראולאלי ממברנה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ishihara, M., Hu, J., Zhang, X.,… More

Ishihara, M., Hu, J., Zhang, X., Choi, Y., Wong, A., Cano-Ruiz, C., Zhao, R., Tan, P., Tso, J. L., Wu, L. Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane. J. Vis. Exp. (156), e60314, doi:10.3791/60314 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter