Summary
We beschrijven een protocol om hartmorfologie en functie bij volwassen zebravissen te beoordelen met behulp van hoogfrequente echocardiografie. De methode maakt visualisatie van het hart en de daaropvolgende kwantificering van functionele parameters mogelijk, zoals hartslag (HR), hartoutput (CO), fractionele gebiedsverandering (FAC), uitwerpfractie (EF) en bloedinstroom en uitstroomsnelheden.
Abstract
De zebravis (Danio rerio) is uitgegroeid tot een zeer populair model organisme in cardiovasculair onderzoek, met inbegrip van menselijke hartziekten, grotendeels te wijten aan de embryonale transparantie, genetische traktaat, en voorzieningen om snelle, high-throughput studies. Echter, het verlies van transparantie beperkt hartfunctie analyse in het volwassen stadium, die modellering van leeftijd-gerelateerde hartaandoeningen bemoeilijkt. Om dergelijke beperkingen te overwinnen, high-frequency echografie echocardiografie bij zebravissen is in opkomst als een haalbare optie. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de hartfunctie bij volwassen zebravissen te beoordelen aan de hand van niet-invasieve echocardiografie met behulp van hoogfrequente echografie. De methode maakt visualisatie en analyse van zebravissen hartdimensie en kwantificering van belangrijke functionele parameters, met inbegrip van hartslag, slag volume, cardiale output, en uitwerping fractie. Bij deze methode worden de vissen verdoofd en onder water gehouden en kunnen ze na de procedure worden teruggewonnen. Hoewel hoogfrequente echografie een dure technologie is, kan hetzelfde beeldvormingsplatform worden gebruikt voor verschillende soorten (bijvoorbeeld murine en zebravissen) door verschillende transducers aan te passen. Zebravis echocardiografie is een robuuste methode voor cardiale fenotypering, nuttig bij de validatie en karakterisering van ziektemodellen, met name late-onset ziekten; drugsschermen; en studies van hartletsel, herstel en regeneratieve capaciteit.
Introduction
De zebravis(Danio rerio) is een gevestigd eikmodel voor studies naar ontwikkelingsprocessen en menselijke ziekten1. Zebravissen hebben een hoge genetische gelijkenis met de mens (70%), genetische traktatabiliteit, hoge vruchtbaarheid, en optische transparantie tijdens de embryonale ontwikkeling, die het mogelijk maakt directe visuele analyse van organen en weefsels, met inbegrip van het hart. Ondanks het feit dat slechts een atrium en een ventrikel, de zebravissen hart (Figuur 1) is fysiologisch vergelijkbaar met zoogdier vier-kamerharten. Belangrijk is dat de zebravis hartslag, elektrocardiogram morfologie, en actie potentiële vorm lijken op die van de mens meer dan murine soorten2. Deze kenmerken hebben zebravissen een uitstekend model voor cardiovasculair onderzoek en hebben belangrijke5inzichten in hartontwikkeling43,,4 , regeneratie 5 , en pathologische aandoeningen1,3,4, met inbegrip van aderverkalking, cardiomyopathies, hartritmestoornissen, aangeboren hartziekten, en amyloïde lichtketen cardiotoxiciteit1,4,6. Beoordeling van de hartfunctie is mogelijk geweest tijdens de embryonale fase (1-daagse na bevruchting) door middel van directe video-analyse met behulp van high-speed video microscopie7,8. Zebravissen verliezen echter hun transparantie na het embryonale stadium, waardoor functionele evaluaties van normale volwassen harten en late hartaandoeningen worden beperkt. Om deze beperking te overwinnen, echocardiografie is met succes gebruikt als een hoge resolutie, real-time, niet-invasieve beeldvorming alternatief voor de evaluatie van volwassen zebravissen hartfunctie9,10,11,12,13,14,15.
Bij zebravis bevindt het hart zich ventrally in de borstholte onmiddellijk achterstelijk aan de kieuwen met het atrium gelegen rugspier aan de ventrikel. Het atrium verzamelt veneuze bloed uit de sinus venosus en brengt het over naar de ventrikel waar het verder wordt gepompt naar de bulbus arteriosus (Figuur 1). Hier beschrijven we een fysiologisch, onderwaterprotocol om de cardiale functie bij volwassen zebravissen te beoordelen aan de hand van niet-invasieve echocardiografie met behulp van een lineaire array echografiesonde met een middenfrequentie van 50 MHz voor B-modus beeldvorming met een resolutie van 30 μm. Aangezien ultrasone golven gemakkelijk door water kunnen reizen, biedt het houden van de nabijheid tussen de vissen en de scansonde onderwater genoeg contactoppervlak voor hartdetectie zonder behoefte aan ultrasone gel en is over het algemeen minder belastend voor de vissen. Hoewel alternatieve zebravissen echocardiografie systemen werden gemeld door verschillende auteurs9,12,13, hier presenteren we de algemene en meest gebruikte setup die van toepassing is op hoge frequentie echografie bij dieren.
De methode maakt hoge resolutie beeldvorming van de volwassen zebravissen hart, het traceren van hartstructuren, en kwantificering van piek-snelheden van Doppler bloedstroom metingen. We tonen betrouwbare in vivo kwantificering van belangrijke systolische en diastolische parameters, zoals uitwerpfractie (EF), fractionele gebiedsverandering (FAC), ventriculaire bloedinstroom en uitstroomsnelheden, hartslag (HR) en cardiale output (CO). We dragen bij aan het vaststellen van een betrouwbaar scala aan normale gezonde volwassen zebravissen cardiale functionele en dimensionale parameters om een meer nauwkeurige evaluatie van pathologische toestanden mogelijk te maken. Over het algemeen bieden we een robuuste methode om de hartfunctie bij zebravissen te beoordelen, die zeer nuttig is gebleken bij het vaststellen en valideren van zebravissen hart-en vaatziekten modellen6,,16,hartletsel en herstel10,13, en regeneratie11,12, en kan verder worden gebruikt om potentiële geneesmiddelen te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met zebravissen zijn goedgekeurd door ons Comité voor institutionele dierenverzorging en -gebruik en voldoen aan de USDA Animal Welfare Act.
1. Experimentele opzet
-
Het opzetten van het platform voor beeldverwerving
- Met behulp van kleine schaar of een scalpel maken een incisie op een spons op de 12 uur positie om de vis te houden tijdens het scannen. Plaats de spons in een glazen container (figuur 2A).
OPMERKING: De positie van de incisie moet voldoende ruimte bieden om de transducer te verplaatsen en ook om de vis balg de waterlijn te houden wanneer het platform wordt gekanteld voor het scannen(figuur 2). De incisie kan variëren afhankelijk van de grootte van de vis; Voor een standaardgrootte en gewicht moet de incisie echter ongeveer 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (lengte, breedte en diepte) bedragen. De glazen container moet ten minste 6 cm diep zijn om waterlekkage te voorkomen tijdens het beeldvorming van de vis. - Breng de glazen doos met de spons op het ultrasone platform aan, bijvoorbeeld met dubbelzijdige tape. Zorg ervoor dat de glazen doos zich in het midden van het platform bevindt en stevig vastzit(figuur 2B).
- Kantel het platform ongeveer 30° naar voren met de knop aan de linkerkant van de platformhouder(figuur 2B). Vul het glasvierkant met 200-250 mL vissysteemwater dat 0,2 mg/mL tricaine methaansulfonaat bevat (MS222).
OPMERKING: Tricaine kan worden bereid als een 4 mg/mL voorraad oplossing in Tris 40 mM pH 7 en verder verdund tot de gewenste concentratie in het vissysteem water; 0,2 mg/mL bleek de beste concentratie te zijn16. De 4 mg/mL tricaine stock oplossing kan gedurende een maand lang worden opgeslagen bij -20 °C of bij 4 °C. - Plaats de transducer in de micromanipulatorhouder op het werkstation en draai de inkeping van de transducer naar de operator. Houd de array parallel aan de grond met de werkende kant longitudinale met betrekking tot het podium (zie figuur 2B). Laat voldoende ruimte (10 cm aan beide zijden) voor de nu aangesloten transducer-rail systeem te bewegen langs de x- en y-assen.
- Log in op de besturingssoftware en kies Muis (Klein) Vasculair. Maak een nieuwe studie en een nieuwe serie voor elk dier opgenomen in de studie. Zoek de nieuwe studieknop aan de linkerkant van het scherm op de browserpagina (de weergave begint in de B-modus).
- Met behulp van kleine schaar of een scalpel maken een incisie op een spons op de 12 uur positie om de vis te houden tijdens het scannen. Plaats de spons in een glazen container (figuur 2A).
2. Behandeling van de vis
OPMERKING: Zebravissen die in deze studie werden gebruikt, waren volwassen, 11 maanden oude mannen van de wilde stam AB/Tuebingen (AB/TU). Zebravissen werden onderhouden in een stand-alone flow-through aquarium systeem op 28 °C in een constante lichtcyclus ingesteld als 14 uur licht / 10 h donker. Zebravissen werden twee maal per dag gevoed met pekelgarnalen (Artemia nauplii) en droogvoedselvlokken.
- Breng met behulp van een visnet de vis over in een klein tankmet systeemwater met 0,2 mg/mL tricaine. Wacht tot de vis volledig verdoofd is (geen beweging en geen reactie op aanraking).
- Met behulp van een plastic theelepel, voorzichtig en snel de vis in de glazen doos met de spons in de eerder gemaakte incisie met ventrale kant van de vis naar boven.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het hoofd van de vis is gepositioneerd in de richting van de exploitant (dezelfde richting als de inkeping van de transducer) en op een iets hoger niveau in vergelijking met de rest van het lichaam om een betere hartvisualisatie te bereiken. - Laat de transducer (met het handvat op het railsysteem) voorzichtig zakken en plaats deze in de lengterichting en dicht bij de ventrale kant van de vis met de inkeping van de transducer tegenover de operator. Laat 2-3 mm (niet meer dan 1 cm) speling van de vis. Pas het platform aan met betrekking tot de transducer met behulp van de micromanipulator in alle 3 assen totdat het vishart wordt gevisualiseerd en start vervolgens met het verwerven van afbeeldingen. De hoek van de transducer mag niet worden gewijzigd tijdens de volledige beeldverwerving(figuur 2C).
OPMERKING: Zolang er voldoende nabijheid is (tot 1 cm), zorgt het water bovenop de vis voor een contactoppervlak via vloeibare oppervlaktespanning die overdracht van de ultrasone golven tussen de sonde en de vis mogelijk maakt. Daarom is het niet nodig om de transducer tegen de vis te duwen. Probeer deze stap te voltooien en voltooi de scan in minder dan 3 minuten om vissterfte of een afname van de hartslag tijdens het verkrijgen van afbeeldingen te voorkomen. Gebruik indien nodig een timer. Het hart is te vinden aan de bovenzijde van het scherm naar de linkerkant van het oog, die gemakkelijk kan worden gevisualiseerd als het verplaatsen van de x-as helemaal naar rechts. Als er nog steeds moeite is om het hart te vinden terwijl u in de B-modus zit, schakelt u over naar de Doppler-modus, die het mogelijk maakt de bloedstroom te volgen (rood geeft het bloed dat naar de operator stroomt) en het lokaliseren van het hart.
3. Beeldverwerving
OPMERKING: Zie Tabel met materialen voor imaging systeem en beeldanalyse software.
- B-modus voor longitudinale weergave
- Na het lokaliseren van het hart, selecteren of verblijven in B-Mode (gevonden aan de linkerkant van het touchscreen na het starten van een nieuwe serie) en het veld te verminderen om in te zoomen en hebben een kijkje op het hart voor gemakkelijker traceren tijdens de analyse.
- Om een beter en duidelijker zicht op het hart in B-Mode beeldverwerving, verminderen het veld door in te zoomen. Gebruik het touchscreen om het veld op zowel de x- als y-assen handmatig te verkleinen.
- Verbeter indien nodig de kwaliteit/het contrast van de afbeelding door het dynamisch bereik in te stellen op 45-50 dB. Ga naar de besturingselementen in de B-modus in de optie Meer besturingselementen en sla de wijziging vervolgens op in Modus-voorinstellingen. Tik op Voorinstellingen voor modus om telkens de instelling voor geoptimaliseerde beeldacquisitie te selecteren voordat u een nieuwe reeks gaat weergeven.
- Neem zoveel afbeeldingen als gewenst in het lange asvlak door Afbeelding opslaante selecteren.
OPMERKING: Meer gedetailleerde informatie en trainingsbronnen over het werven van afbeeldingen zijn te vinden op https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab en https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
- Longitudinale Weergave Pulsgolf
- Schakel over naar Color Doppler voor bloedstroomdetectie (selecteer Kleurknop) en acquisitie (linksonder in het touchscreen na het starten van een nieuwe serie).
- Met behulp van het aanraakscherm plaats het kwadrant op de top van de atrioventriculaire klep en lokaliseren van de instroom, die zal worden onderscheiden door de rode kleur signaal(figuur 3A). Verminder het kwadrantgebied zoveel mogelijk om de framesnelheid te verhogen.
OPMERKING: Verlaag de kleurpuls-herhaling-frequentie (Color PRF) (snelheidsbereik) om ervoor te zorgen gele kleur kan worden gezien in de snelheid profiel van de Color Doppler afbeelding. Dit zal het bereik van snelheden die kunnen worden gezien en zal helpen om een mozaïek van kleur die het mogelijk maken om duidelijker te visualiseren de pieksnelheden te creëren. - Activeer pulsgolf (selecteer PW)Doppler Mode om de instroomsnelheid van ventriculaire bloedte te bemonsteren. Plaats de monstervolumepoort in het midden van de atrioventriculaire klep (waarbij het rode kleursignaal gelish wordt) om de maximale stroomsnelheid te detecteren. Pas de PW-hoek op het scherm aan met uw vingers, zodat deze wordt uitgelijnd met de richting van de bloedinstroom. Druk op start of update om te beginnen met het bemonsteren van de snelheid van het bloed stroomt in de ventrikel.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de hoek juiste lijn is parallel aan de bloedstroom om consistente en reproduceerbare resultaten te bieden. Het plaatsen van de hoek juiste lijn, zodat het overeenkomt met de richting van de bloedstroom zal ervoor zorgen dat snelheden nauwkeurig worden vastgelegd. - Herhaal stap 3.2.3 om de uitstroomsnelheid te bepalen door het Kleur Doppler-kwadrant op de kruising tussen de ventrikel en de bulbus (boluventriculaire klep) te plaatsen en de stroom te lokaliseren, die zal worden onderscheiden door een blauw kleursignaal(figuur 3B). Plaats de monstervolumepoort vlak voor de splitsing van de ventrikel-bulbus en pas de hoekcorrectielijn aan om de richting van de bloedstroom aan te passen.
OPMERKING: Zoals eerder vermeld, om nauwkeurige snelheidswaarden te bereiken, moet u ervoor zorgen dat de PW-hoek is uitgelijnd met de bloedstroom. - Pas de basislijn (balk) aan en verlaag of hoger in het deelvenster stroomsnelheid om de signaalpieken(figuur 3C,D) volledig te detecteren en te traceren. Identificeer de instroompieken in het bovenste/positieve kwadrant (signaal richting de sonde) en de uitstroompieken in het onderste/negatieve kwadrant (signaal dat weggaat van de sonde).
4. Terugwinning van vissen
- Zodra het beeld te verwerven is voltooid, met behulp van een theelepel, de overdracht van de vis in regelmatig systeem belucht water vrij van tricaine en laat de vis herstellen (meestal duurt 30 s tot 2 min om kieuw beweging en zwemmen te hervatten).
- Om te helpen herstel, spuit water herhaaldelijk over de kieuwen met behulp van een overdracht pipet ter bevordering van beluchting van het water en zuurstofoverdracht.
5. Beeldanalyse
- Open de beeldanalysesoftware.
- Selecteer een afbeelding en klik op het pictogram voor afbeeldingsverwerking(figuur 4). Met behulp van de beschikbare schaal(figuur 4)pas u de helderheid en het contrast van de afbeelding aan om een duidelijke visualisatie van ventriculaire wanden of bloedstroompatroon mogelijk te maken.
- Open met de afbeelding in de B-modus de vervolgkeuzelijst van de optie PSLAX (parasternal long axis) op het hartpakket/metingen(figuur 4). Selecteer LV-traceer en traceer de ventriculaire binnenwand bij systole en diastole om het ventriculaire gebied (VA) in systole (VAA's) en diastole (VAd), end diastolisch volume (EDV) en einde systolisch volume (ESV) (figuur 5A,B) te verkrijgen.
OPMERKING: Volumewaarden worden geëxtrapoleerd van 2D-afbeeldingstraceringen en kunnen afwijken van de 3D-entiteit. Voor alle metingen gemiddeld ten minste 3 representatieve hartcycli per dier. - Let op het lijnvolume en de uitwerpfractie die automatisch door de software worden berekend en weergegeven.
OPMERKING: Lijnvolume en uitwerpfractie kunnen ook handmatig worden berekend met behulp van de formules
SV = EDV-ESV
EF = (EDV-ESV)/EDV
waar SV lijnvolume is, is EDV einddiastolisch volume, is ESV eindsystolisch volume en is EF uitwerpfractie - Fractionele gebiedswijziging berekenen met behulp van de formule
FAC = (VAd - VAs)/ VAd
waar FAC is fractionele gebied te veranderen, VAd is ventriculair gebied in diastole, en VA's is ventriculair gebied in systole. - Bereken de hartoutput met behulp van de formule
CO = HR x SV
waar CO is hartoutput, HR is hartslag, en SV is beroerte volume - Meet met behulp van de afbeelding Pulsed Wave Doppler Mode de instroombloedsnelheid door de MV Flow-optie onder het hartpakket te selecteren(figuur 4). Selecteer respectievelijk E of A voor vroege diastole en late diastole en bepaal de pieksnelheden op de grafiek(figuur 3C).
- Meet de uitstroombloedsnelheid door AoV Flow te selecteren en de pieken op de tracering te bepalen (figuur 3D).
- Meet de hartslag met behulp van 2 verschillende methoden voor een betrouwbaardere beoordeling:
- Wanneer het hart wordt gevisualiseerd op het scherm tijdens het verkrijgen van afbeeldingen, tel de beats binnen 10 s en vermenigvuldig het met 6.
- Kies met behulp van de Pulse Wave Doppler-afbeelding op de Vevo LAB-software de hartslagknop en de spoorintervallen tussen 3 opeenvolgende aortastroompieken(figuur 4 en figuur 6).
- Als u gegevens naar een spreadsheet wilt exporteren nadat u de LV en de pieken van de bloedstroom hebt getraceerd, klikt u op rapport | export | opslaan als | excel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het beschreven protocol maakt het mogelijk om belangrijke cardiale en functionele parameters te meten, analoog aan de techniek die wordt gebruikt in de echocardiografie tussen mens en dier. De Beelden van de B-Modus maken het mogelijk om ventriculaire binnenwand in systole en diastole (figuur 5) te traceren en dimensionale gegevens te verkrijgen, zoals kamer- en wandafmetingen, en functionele gegevens, zoals hartslag, slagvolume en cardiale output, evenals parameters van ventriculaire systolische functie, zoals fractionele gebiedsverandering en uitwerpfractie(tabel 1). Metingen op het niveau van de atrioventriculaire klep met behulp van kleuren Doppler Mode beelden bieden ook ventriculaire instroom en uitstroom bloedsnelheden (snelheid waarmee het bloed vult en verlaat de ventrikel, respectievelijk) (Figuur 3 en Tabel 1).
De parameters die in deze studie werden verkregen, waren vergelijkbaar met die welke in eerdere studies werden gerapporteerd met vergelijkbare experimentele omstandigheden6,16,17 ( tabel1), waaruit de reproduceerbaarheid van de methode werd aangetoond. Over het algemeen tonen we aan dat met behulp van dit gedetailleerde protocol men effectief en consequent kan beoordelen zebravissen cardiale functie, die van cruciaal belang is bij het vergelijken van verschillende cardiale fenotypes tijdens een studie.
Figuur 1: Illustratie van volwassen zebravissen hart. De bloedstroom wordt vertegenwoordigd door pijlen: het bloed stroomt van de sinusvenosus naar het atrium en wordt verder overgebracht naar de ventrikel, waar het naar de bulbus arteriosus wordt gepompt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Visbeeldkamer. (A) Om een vis-imaging "kamer" voor te bereiden, wordt een spons met een incisie naar het ene uiteinde in een verticale oriëntatie in een glazen container geplaatst. (B) De glazen container wordt vervolgens stevig afgeplakt op het hellende beeldplatform. (C) De transducer is gemonteerd op de manipulator en parallel geplaatst aan de incisie voor de juiste beeldpositionering (de transducer inkeping wijst naar de operator). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Atrioventriculaire instroom (A) en uitstroom (B) in de Color Doppler-modus en de bijbehorende Pulsed Wave Doppler om snelheden van de respectieve ventriculaire diastolische golfpieken (C) en ventriculaire uitstroom (D) te beoordelen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Beeldanalyse. Na beeldverwerking (om het gewenste contrast en de helderheid van het beeld te bereiken), kunnen metingen worden uitgevoerd in de PW Doppler-modus (links) en B-modus (rechts) beelden. Als u de LV-wand wilt traceren in de afbeelding in de B-modus, selecteert u Cardiac Package in het vervolgkeuzemenu, gaat u naar PSLAXen selecteert u LV Trace. Als u pieksnelheden in de afbeelding van de PW Doppler-modus wilt meten, selecteert u Cardiac Package in het vervolgkeuzemenu. Als u de instroomsnelheid van de ventriculaire bloedstroom wilt meten, selecteert u de MV Flow-optie en selecteert u Respectievelijk E of A voor vroege diastole en late diastole. Voor bepaling van de uitstroom bloedsnelheid, selecteer AoV Flow en AV pieksnelheid. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Afbeeldingen in de B-modus. (A) B-Mode beeld van de ventrikel (V) in diastole, gevuld met bloed uit het atrium (A). (B) B-Mode beeld van de ventrikel in systole, het uitwerpen van bloed door de bulbus arteriosus (B, groene tracering). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Pulse Wave Doppler afbeelding. Een hartslagwaarde kan worden gegenereerd door 3 opeenvolgende aortastroompieken te traceren. De aortastroompieken kunnen worden weergegeven door de hartslagknop te selecteren in het tabblad Metingen in de analysesoftware. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Parameters, eenheden ± sd | Deze studie | Wang, L. et al.,2017; Lee, L. et al., 2016 & Mishra, S. et al,2019 | Opmerkingen/beschrijving |
| Hartslag (HR), bpm | 133 ± 7 | 118 ± 14 - 162 ± 32 | Wild-types AB/ABTU mannetjes en vrouwtjes tussen 3-12 maanden verdoofd in tricaine 0,2 mg/mL |
| Fractionele gebiedswijziging (FAC) | 0,38 ± 0,03 | 0,29 ± 0,07 - 0,39 ± 0,05 | |
| Uitwerpfractie (EF), [%] | 42 ± 7 | 34 ± 0,04 - 48 ± 0,03 | |
| Lijnvolume (SV), μL | 0,21 ± 0,01 | 0,18 ± 0,06 - 0,28 ± 0,08 | |
| Cardiale output (CO), μL min-1 | 27,3 ± 1,69 | 19 ± 9,5 - 36,1 ± 7,8 | |
| E pieksnelheid (vroege ventriculaire instroom), mm/s | 30 ± 6,8 | 25 ± 7 - 51 ± 16 | |
| Een pieksnelheid (late ventriculaire instroom), mm/s | 152 ± 32 | 144 ± 36 - 288 ± 54 | |
| Ventriculaire uitstroom, mm/s | 86,6 ± 19 | N/a |
Tabel 1: Echocardiografische parameters bij volwassen zebravissen. Waarden verkregen voor de hartfunctie parameters geëvalueerd in de huidige studie voor volwassen mannelijke of vrouwelijke zebravissen tussen 3 en 12 maanden verdoofd in een 0,2 mg/mL tricaine oplossing. Een reeks van de waarden verkregen voor dezelfde parameters in eerdere studies6,16,17 uitgevoerd in vergelijkbare omstandigheden wordt gepresenteerd voor validatie en om te helpen standaardiseren van de methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een systematische methode voor echocardiografische beeldvorming en beoordeling van de hartfunctie bij volwassen zebravissen. Echocardiografie is de enige beschikbare niet-invasieve en meest robuuste methode voor levende volwassen vissen cardiale beeldvorming en functionele analyse, en het wordt steeds populairder in zebravissen cardiovasculair onderzoek. De benodigde tijd is kort en maakt een hoge doorvoer en longitudinale studies mogelijk. Er is echter een aanzienlijke variatie in de gebruikte methodologie en de gegevensanalyse. Standaardisatie van zebravis echocardiografie is erg moeilijk wanneer zoveel variabelen de outcoming parameters kunnen beïnvloeden. Bij het uitvoeren van experimentele studies, moet men rekening houden met aandoeningen die variabiliteit kunnen produceren, met inbegrip van anesthesie, lichaamsgewicht, leeftijd, geslacht, en achtergrond stam. Wang, L et al.16 beoordeelden de variabiliteit die door deze factoren werd geïntroduceerd en stelde de beschikbare gegevens over de cardiale functie van zebravissen samen om de methode te helpen standaardiseren. Hun studie is een zeer nuttige bron voor het ontwerpen van experimentele studies waarbij zebravis echocardiografische beoordeling. Op basis van de informatie van Wang, L et al.16 en referenties binnen en onze eigen waarnemingen6,geven we een overzicht van kritische stappen en omstandigheden die we belangrijk achtten voor protocoloptimalisatie en reproduceerbaarheid:
Keuze van het specimen: Eerdere studies suggereren dat, hoewel systolische functieparameters (EF, FAC) niet significant worden beïnvloed door geslachtsverschillen, de diastolische functie (namelijk piekgolf E/A-verhouding) aanzienlijk lager kan zijn bij vrouwen ouder dan 6 maanden. Er werd ook geconstateerd dat ventriculaire gebieden en volumes aanzienlijk toenemen met de visleeftijd (3 maanden en ouder) en aanzienlijk hoger zijn bij vrouwtjes vanwege hun hogere lichaamsgewicht en grootte. Indexering van diastolische volumes aan body-mass index (BMI) en lichaamsoppervlakte (BSA) kan helpen bij het afschaffen van verschillen tussen leeftijdsgebonden vrouwen en mannen, en indexering aan BSA en gewicht kan helpen overwinnen leeftijd gerelateerde diastolische volumeverschillen16. Er waren ook meldingen van verschillende diastolische functies tussen vissen met verschillende achtergrondstammen16. Over het algemeen, bij het kiezen van experimenteel ontwerp, is het raadzaam om leeftijds- en spanning-gematched controles te gebruiken en te voorkomen dat het mengen van verschillende geslachten. Met behulp van mannetjes wordt aanbevolen, als beeldkwaliteit lager was in gravid vrouwtjes.
Scanpositie: In deze opstelling zijn twee scanposities mogelijk: lengteas en korte as. We ontdekten dat het in de korte asmodus erg moeilijk was om de hartkamers te identificeren. Daarom gebruikten we alleen longitudinale as en raden de laatste voor afbakening van de hartkamers in B-modus en afleiding van ventriculaire grootte en functie.
Anesthesie: Adequate sedatie is van cruciaal belang om significante bradycardie tijdens de meting te voorkomen. Hartslag zal invloed hebben op cardiale functionele meting, afbreuk te doen aan de nauwkeurigheid van de studie. Tricaine is de meest voorkomende verdovingsmiddel en een dosis van 0,2 mg/mL bleek voldoende sedatie te bieden. De meettijd is echter van cruciaal belang omdat de hartslag begint te dalen na 3-4 min onder sedatie16. Om variabiliteit te voorkomen, is het van cruciaal belang om metingen onder 3 min te houden.
Kritieke parameters: Hartslag kan worden beschouwd als een kritieke parameter bij het streven naar consistentie en nauwkeurigheid. De hartslag moet vergelijkbaar zijn tussen geteste experimentele groepen en binnen het bereik van de gerapporteerde waarden voor de gebruikte omstandigheden. We vonden dat een bereik van 118 ± 14 tot 162 ± 32 bpm de normale waarden kan vertegenwoordigen voor wilde type zebravis 3-12 maanden oude volwassenen verdoofd met 0,2 mg/mL tricaine voor minder dan 3 min.
Resultaatnauwkeurigheid: Om de nauwkeurigheid te garanderen, moeten metingen worden uitgevoerd over minimaal 3 hartcycli. Om nauwkeurigere handmatige beeldtraceringen te verkrijgen, moet de analyse op een geblindeerde manier worden uitgevoerd.
Naast het kiezen van de meest geschikte omstandigheden, zijn verschillende aspecten van cruciaal belang om een nauwkeurige meting te garanderen. Idealiter moeten de omstandigheden zo dicht mogelijk bij de normale visfysiologische toestand worden gehouden. Het uitvoeren van de scan onder water heeft het voordeel dat de vis in hun natuurlijke omgeving blijft en dicht bij normale omstandigheden voor gasuitwisseling, watersamenstelling, hydrostatische druk en temperatuur. Dit zijn duidelijke voordelen ten opzichte van eerdere studies, waarbij tijdens het scannen vissen worden geplaatst in een natte spons blootgesteld aan kamerlucht en geleidbaarheid wordt mogelijk gemaakt door echografie gel in plaats van water9,10. Onderwater scanning maakt het ook mogelijk voor het herstel van de vis na de procedure, op voorwaarde dat de tijd tussen anesthesie en herstel wordt gehouden onder 3 min en de vis wordt teruggegeven aan het herstel water onmiddellijk na de meting. Om ervoor te zorgen dat de procedure zo snel en effectief mogelijk wordt uitgevoerd, is een aanzienlijke hoeveelheid tijd besteed aan training raadzaam voordat experimenten worden uitgevoerd.
Echocardiografie is een zeer gevestigde methode om de hartfunctie in de klinische praktijk te evalueren, evenals in murine (of andere zoogdieren) diermodellen. Echter, in tegenstelling tot murine of menselijke echocardiografie, het uitvoeren van vis echografie onderwater maakt het niet mogelijk verbinding van het monster op de elektroden. Daarom is directe meting van hart- en ademhalingssnelheden niet mogelijk. In dat geval kan de hartslag worden gemeten door de slagen per min te tellen in een interval van 10 of 15 minuten of door handmatig 3 opeenvolgende aortastroompieken te traceren (figuur 6). Hartslag beïnvloedt ook de bepaling van andere parameters, zoals cardiale output, die handmatig moeten worden berekend zodra parameters zoals slagvolume zijn verkregen door middel van ventriculaire binnenwand tracering. Een ander aspect om te overwegen is dat vishartmorfologie is heel anders dan zoogdieren. In de twee-kamerige zebravissen hart, ventriculaire vulling wordt meestal bepaald door atrium contractie, en vissen meestal aanwezig een veel lagere vroege tot late ventriculaire vulling verhouding in vergelijking met zoogdieren18. Dit verklaart het verschillende profiel verkregen door pulsgolf Doppler in A en E pieken tussen zebravis en gezonde zoogdierharten.
Echocardiografie maakt een grondige karakterisering van het vishartprofiel en kwantificering van meerdere functionele parameters mogelijk. De waarden verkregen voor uitwerpingsfractie, fractionele gebiedsverandering, bloedinstroom en uitstroomsnelheden, hartslag en cardiale output zijn in het bereik dat wordt gerapporteerd door eerdere studies(tabel 1),waarbij de reproduceerbaarheid van de methode wordt benadrukt. Samen tonen onze gegevens aan dat hoogfrequente echografie echocardiografie een robuuste en reproduceerbare methode is om de hartmorfologie en functie van zebravissen te meten bij de evaluatie van ziektemodellen of drugstesten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Fred Roberts' technische ondersteuning en herziening van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container - 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Nilius, B., et al. 171, Springer International Publishing. 99-136 (2016).
