Summary
Erişkin zebra balıklarında yüksek frekanslı ekokardiyografi kullanarak kalp morfolojisini ve işlevini değerlendirmek için bir protokol tanımladık. Bu yöntem kalbin görüntülenmesine ve kalp hızı (HR), kardiyak debi (CO), fraksiyonel alan değişimi (FAC), ejeksiyon fraksiyonu (EF) ve kan giriş ve çıkış hızları gibi fonksiyonel parametrelerin daha sonra ölçülmesine olanak sağlar.
Abstract
Zebra balığı(Danio rerio)kardiyovasküler araştırmalarda çok popüler bir model organizma haline gelmiştir, insan kalp hastalıkları da dahil olmak üzere, büyük ölçüde embriyonik şeffaflık nedeniyle, genetik straktör, ve hızlı, yüksek iş yapma çalışmaları için uygunluk. Ancak, şeffaflık kaybı yetişkin aşamasında kalp fonksiyon analizi sınırlar, hangi yaşa bağlı kalp koşullarının modelleme karmaşıklaştırır. Bu tür sınırlamaları aşmak için, zebra balığında yüksek frekanslı ultrason ekokardiyografi uygun bir seçenek olarak ortaya çıkmaktadır. Burada erişkin zebra balıklarında kardiyak fonksiyonu yüksek frekanslı ultrason kullanarak non-invaziv ekokardiyografi ile değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sayılmaktadır. Bu yöntem zebrabalığı kalp boyutunun görüntülenmesi ve analizini ve kalp hızı, inme hacmi, kardiyak çıkış ve ejeksiyon fraksiyonu gibi önemli fonksiyonel parametrelerin ölçülmesine olanak sağlar. Bu yöntemde balıklar anestezi edilir ve su altında tutulur ve işlemden sonra geri kazanılabilir. Yüksek frekanslı ultrason pahalı bir teknoloji olmasına rağmen, aynı görüntüleme platformu farklı türler için kullanılabilir (örneğin, murine ve zebrabalığı) farklı dönüştürücüler adapte ederek. Zebrabalığı ekokardiyografisi, özellikle geç başlangıçlı hastalıklar olmak üzere hastalık modellerinin doğrulanmasında ve karakterizasyonunda yararlı olan kardiyak fenotipleme için sağlam bir yöntemdir; uyuşturucu ekranları; ve kalp hasarı, iyileşme ve rejeneratif kapasite çalışmaları.
Introduction
Zebra balığı(Danio rerio)gelişimsel süreçler ve insan hastalıkları çalışmaları için iyi kurulmuş omurgalı modeli1. Zebra balıkları insanlara göre yüksek genetik benzerliğe sahiptir (%70), genetik sistemlenebilirlik, yüksek fecundity, ve embriyonik gelişim sırasında optik şeffaflık, hangi organ ve dokuların doğrudan görsel analizi sağlar, kalp de dahil olmak üzere. Sadece bir atriyum ve bir ventrikülolmasına rağmen, zebra balığı kalbi(Şekil 1)fizyolojik olarak memeli dört odalı kalplere benzer. Daha da önemlisi, zebrabalığı kalp hızı, elektrokardiyogram morfolojisi ve eylem potansiyeli şekli insanların daha fazla murinetürleri2 benzer. Bu özellikler zebra balığı kardiyovasküler araştırma için mükemmel bir model yaptık ve kardiyak gelişim içine önemli anlayışlar sağlamıştır3,4, rejenerasyon5, ve patolojik koşullar1,3,4, arterioskleroz dahil, kardiyomiyopatiler, aritmiler, konjenital kalp hastalıkları, ve amiloid Hafif zincir kardiyotoksisite1,4,6. Kardiyak fonksiyonun değerlendirilmesi embriyonik evre de (1 gün sonrası döllenme) yüksek hızlı video mikroskopi7,8kullanarak doğrudan video analizi ile mümkün olmuştur. Ancak, zebra balığı normal olgun kalplerin fonksiyonel değerlendirmelerini ve geç başlangıçlı kalp koşullarını sınırlayarak embriyonik evrenin ötesinde saydamlığını kaybederler. Bu sınırlamayı aşmak için, ekokardiyografi yetişkin zebrabalığı kalp fonksiyonu,9,10,11,12,13,14,15değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı, noninvaziv görüntüleme alternatifi olarak başarıyla kullanılmıştır.10
Zebra balığında kalp, ventriküle kadar bulunan atriyum ile solungaçların hemen posterior torasik kavitede ventrally bulunur. Atriyum sinüs venöz venöz venöz venöz venöz kan toplar ve daha bulbus arteriosus pompalanır ventrikül aktarır (Şekil 1). Burada, 30 μm çözünürlükte B-mod görüntüleme için 50 MHz'lik merkez frekansı olan doğrusal dizili ultrason probu kullanılarak erişkin zebrabalıklarında kardiyak fonksiyonu nanvaziv olmayan ekokardiyografi ile değerlendirmek için fizyolojik, sualtı protokolünü tanımlıyoruz. Ultrason dalgaları kolayca su ile seyahat edebilirsiniz bu yana, balık ve tarama sonda su altında arasında yakın tutmak ultrason jel gerek kalmadan kalp tespiti için yeterli temas yüzeyi sağlar ve balık için genel olarak daha az stresli. Alternatif zebra balığı ekokardiyografi sistemleri çeşitli yazarlar tarafından rapor olmasına rağmen9,12,13, Burada hayvanlarda yüksek frekanslı ultrason için geçerlidir genel ve en sık kullanılan kurulum salıyoruz.
Bu yöntem, yetişkin zebrabalığı kalbinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine, kardiyak yapıların izlenmesine ve Doppler kan akımı ölçümlerinden pik hızların ölçülmesine olanak sağlar. Ejeksiyon fraksiyonu (EF), fraksiyonel alan değişimi (FAC), ventriküler kan giriş ve çıkış hızları, kalp hızı (HR) ve kardiyak debi (CO) gibi önemli sistolik ve diyastolik parametrelerin in vivo nicel olarak güvenilir olarak ölçülmesini göstermekteyiz. Patolojik durumların daha hassas bir şekilde değerlendirilmesine olanak sağlamak için güvenilir bir dizi normal sağlıklı yetişkin zebrabalığı kardiyak fonksiyonel ve boyutsal parametrelerin oluşturulmasına katkıda bulunuyoruz. Genel olarak, zebra balığı kalp fonksiyonlarını değerlendirmek için sağlam bir yöntem saðlamak için sağlam bir yöntem saðlamak, zebrafish kalp hastalığı modelleri kurulması ve doğrulanmasında son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır6,16, kalp yaralanması ve kurtarma10,13, ve rejenerasyon 11,12, ve daha fazla potansiyel ilaçları değerlendirmek için kullanılabilir.12
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebra balığı ile ilgili tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve USDA Hayvan Refahı Yasası'na uygun olarak uygulanmaktadır.
1. Deneysel kurulum
-
Görüntü edinimi için platform ayarlama
- Küçük makas veya neşter kullanarak tarama sırasında balık tutmak için saat 12 konumunda bir sünger üzerinde bir kesi yapmak. Süngeri cam bir kapta yerleştirin (Şekil 2A).
NOT: Kesinin konumu transdüseri hareket ettirmek için yeterli alan sağlayacak ve ayrıca platform tarama için eğildiğinde balığın su hattını körüklemesini sağlayacaktır(Şekil 2). Kesi balığın büyüklüğüne bağlı olarak değişebilir; ancak, standart bir boyut ve ağırlık için, kesi yaklaşık 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (uzunluk, genişlik ve derinlik, sırasıyla) olmalıdır. Cam kap balık görüntüleme sırasında su sızıntısı önlemek için en az 6 cm derinliğinde olmalıdır. - Örneğin çift taraflı bant kullanarak ultrason platformunda sünger içeren cam kutuyu yapıştırın. Cam kutunun platformun merkezinde olduğundan ve sıkıca bağlı olduğundan emin olun (Şekil 2B).
- Platform tutucunun sol tarafındaki ahzıtçıyı kullanarak platformu yaklaşık 30° öne doğru yatırın(Şekil 2B). Cam kareyi 0.2 mg/mL trikotin metansülfonat (MS222) içeren 200-250 mL balık sistemi suyu ile doldurunuz.
NOT: Tris 40 mM pH 7'de 4 mg/mL stok çözeltisi olarak triain hazırlanabilir ve balık sistemi suyunda istenilen konsantrasyona seyreltilebilir; 0.2 mg/mL en iyi konsantrasyon16olarak bulunmuştur. 4 mg/mL trikotin etek çözeltisi -20 °C'de veya 4 °C'de bir ay süreyle uzun süre saklanabilir. - Transdüseri çalışan tren istasyonuna mikromanipülatör tutucunun içine takın ve transdüserin çifeniyi operatöre doğru çevirin. Diziyi, çalışma tarafı ile zemine paralel olarak, sahneye göre uzunlamasına tutun (Bkz. Şekil 2B). X- ve y-eksenleri boyunca hareket etmek için artık bağlı transdüser raylı sistem için yeterli oda (her iki tarafta 10 cm) bırakın.
- Kontrol yazılımına giriş yapın ve Fare (Küçük) Vasküler'iseçin. Çalışmaya dahil edilen her hayvan için yeni bir çalışmanın yanı sıra yeni bir seri oluşturun. Tarayıcı sayfasında ekranın sol alt tarafında bulunan yeni çalışma düğmesini bulun (görünüm B modunda başlar).
- Küçük makas veya neşter kullanarak tarama sırasında balık tutmak için saat 12 konumunda bir sünger üzerinde bir kesi yapmak. Süngeri cam bir kapta yerleştirin (Şekil 2A).
2. Balık Taşıma
NOT: Bu çalışmada kullanılan zebra balıkları yetişkin, 11 aylık yabani tip ab/Tuebingen (AB/TU) erkektir. Zebra balıkları 28 °C'de tek başına akış lı akvaryum sisteminde 14 saat açık/10 h karanlık olarak ayarlanmış sabit bir ışık döngüsünde muhafaza edildi. Zebra balığı salamura karides(Artemia nauplii)ve kuru gıda gevreği ile günde iki kez beslendi.
- Balık ağı kullanarak, balığı 0,2 mg/mL tricaine ile sistem suyu içeren küçük bir tanka aktarın. Balık tamamen anestezi (hiçbir hareket ve dokunmaya yanıt) kadar bekleyin.
- Plastik bir çay kaşığı kullanarak, yavaşça ve hızlı bir şekilde yukarı bakan balık ventral tarafı ile daha önce yapılmış kesi içine sünger içeren cam kutuiçine balık aktarın.
NOT: Daha iyi kalp görselleştirmesi elde etmek için balığın başının operatöre (transdüserin çentikle aynı yönde) ve vücudun geri kalanına göre biraz daha yüksek bir seviyede konumlandırıldığından emin olun. - Raylı sistemdeki sapı kullanarak transdüseri (orijinal konumunu koruyarak) yavaşça düşürün, uzunlamasına yerleştirin ve işleticinin çentikiyle balığın ventral tarafına yakın hale getirin. Balıktan 2-3 mm (en fazla 1 cm) açıklık bırakın. Platform, balık kalbi görselleşene kadar 3 eksendeki mikromanipülatörü kullanarak dönüştürücüye göre ayarlayın ve görüntü edinimi başlatın. Transdüserin açısı tüm görüntü edinimi sırasında değiştirilmemelidir (Şekil 2C).
NOT: Yeterli yakınlık olduğu sürece (1 cm'ye kadar), balığın üzerindeki su, ultrason dalgalarının sonda ile balık arasında iletilmesini sağlayan sıvı yüzey gerilimi ile temas yüzeyi sağlayacaktır. Bu nedenle transdüseri balıklara doğru itmeye gerek yoktur. Bu adımı tamamlamak ve balık ölümü veya görüntü edinimi sırasında kalp hızının bir azalma önlemek için az 3 dakika içinde tarak bitirmek deneyin. Gerekirse, bir zamanlayıcı kullanın. Kalp, ekranın üst kısmında gözün sol tarafına doğru bulunabilir ve x eksenini sağa doğru hareket ettirili olarak kolayca görüntülenebilir. B modundayken kalbi bulmakta zorluk devam ederse, kan akışının izlenmesine (kırmızı, operatörün doğru akan kan akıtmasını gösterir) ve kalbin yerinin bulunmasına olanak sağlayacak renkli Doppler moduna geçin.
3. Görüntü edinimi
NOT: Görüntüleme sistemi ve görüntü analiz yazılımı için Malzeme Tablosu'na bakınız.
- Uzunlamasına Görünüm B-Modu
- Kalbi lokalize ettikten sonra, B-Modu'nu seçin veya kalın (yeni bir seri başlattıktan sonra dokunmatik ekranın sol alt tarafında bulunan) ve yakınlaştırmak ve analiz sırasında daha kolay izleme için kalbe daha yakından bakmak için alanı küçültün.
- B-Mode görüntü ediniminde kalbin daha yakın ve net bir görünümünü elde etmek için, yakınlaştırarak alanı küçültün. Hem x hem de y eksenlerinde alanı el ile daraltmak için dokunmatik ekranı kullanın.
- Gerekirse, dinamik aralığı 45-50 dB'ye ayarlayarak görüntünün kalitesini/kontrastını artırın. Daha Fazla Denetim seçeneğindeki B modu denetimlerine gidin ve daha sonra değişikliği Mode Hazır Ayarlar'akaydedin. Yeni bir seri resmine başlamadan önce her seferinde en iyi duruma getirilmiş görüntü edinme ayarını seçmek için Mod Hazır Ayarları'na dokunun.
- Görüntü Kaydet'iseçerek uzun eksen düzleminde istediğiniz kadar görüntü alın.
NOT: Görüntü edinimi ile ilgili daha ayrıntılı bilgi ve eğitim kaynaklarını https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab ve https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
- Uzunlamasına Görüş Darbe Dalgası
- Kan akışı algılama (Renk düğmesini seçin) ve satın alma (yeni bir seri başlattıktan sonra dokunmatik ekranın sol alt tarafında bulunan) için Color Doppler'a geçin.
- Dokunmatik ekran kullanarak atriyoventriküler valf üstüne çeyrek konumlandırmak ve kırmızı renk sinyali ile ayırt edilecektir giriş lokalize(Şekil 3A). Kare hızını artırmak için mümkün olduğunca çeyrek alanını azaltın.
NOT: Renk Doppler görüntüsünün hız profilinde sarı rengin görülebilmesini sağlamak için Renk darbesi tekrarlama frekansını (Color PRF) (hız aralığı) düşürün. Bu görülebilir hızaralığı artacak ve daha net pik hızları görselleştirmek için izin verecek renk bir mozaik oluşturmak için yardımcı olacaktır. - Ventriküler kan giriş hızını örneklemek için nabız dalgasını (seçip PW)Doppler Mode'u etkinleştirin. Maksimum akış hızını algılamak için örnek hacim kapısını atriyoventriküler valfin (kırmızı renk sinyalinin daha sarımsı olduğu yerde) merkezine yerleştirin. Parmaklarınızı kullanarak ekrandaki PW açısını kan girişinin yönüyle aynı hizaya uyacak şekilde ayarlayın. Ventriküle akan kanın hızını örneklemeye başlamak için başlat veya güncelleyin.
NOT: Tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için açı doğru çizginin kan akışına paralel olduğundan emin olun. Açının doğru çizgiye kan akışının yönüne uygun hale yerleştirilmesi, hızların doğru bir şekilde yakalanmasını sağlayacaktır. - Ventrikül ve bulbus (bülbül valf) arasındaki kavşakta Color Doppler quadrant yerleştirerek çıkış hızını belirlemek için adım 3.2.3 tekrarlayın ve mavi bir renk sinyali ile ayırt edilecektir akışı, lokalize (Şekil 3B). Örnek hacim kapısını ventrikül-bulbus kavşağından hemen önce yerleştirin ve açı düzeltme çizgisini kan akışının yönüyle eşleşecek şekilde ayarlayın.
NOT: Daha önce de belirtildiği gibi, doğru hız değerleri elde etmek için, PW açısı kan akışı ile hizalanmış olduğundan emin olun. - Sinyal tepelerini tamamen tespit etmek ve izlemek için taban çizgisini (çubuk) ayarlayın, akış hızı panelinde düşürün veya yükseltin(Şekil 3C,D). Üst/pozitif kadranda (sondaya doğru giden sinyal) giriş tepelerini ve alt/negatif çeyreğindeki çıkış tepelerini (probdan uzağa giden sinyal) tanımlayın.
4. Balık kurtarma
- En kısa sürede görüntü edinimi tamamlandığında, bir çay kaşığı kullanarak, düzenli sistem atlanan su tricaine ücretsiz balık transferi ve balık kurtarmak sağlar (genellikle solungaç hareketi ve yüzme devam etmek için 30 s 2 dk sürer).
- Kurtarma yardımcı olmak için, su ve oksijen transferi havalandırma teşvik etmek için bir transfer pipet kullanarak solungaçları üzerinde tekrar tekrar su fışkırtmak.
5. Görüntü analizi
- Görüntü analizi yazılımını açın.
- Bir resim seçin ve resim işleme simgesine tıklayın (Şekil 4). Mevcut ölçeği(Şekil 4)kullanarak, ventriküler duvarların veya kan akış deseninin net bir şekilde görüntülenmesi için görüntünün parlaklığını ve kontrastını ayarlayın.
- B modu görüntüsünü kullanarak, kardiyak paket/ölçümlerdeki PSLAX (parasternal uzun eksen) seçeneğinden açılır listeyi açın(Şekil 4). Systole (VAs) ve diastole (VAd), end diyastolik hacim (EDV) ve sonu sistolik hacim (ESV)(Şekil 5A,B)ve son sistolik hacim elde etmek için sistriküler iç duvar izlemek ve sistriküler iç duvar izlemek seçin.
NOT: Ses değerleri 2B görüntü izlemelerinden tahmin edilir ve 3B varlıktan sapabilir. Tüm ölçümler için, hayvan başına ortalama en az 3 temsili kardiyak döngüleri. - Yazılım tarafından otomatik olarak hesaplanacak ve görüntülenecek kontur hacmine ve çıkarma kısmına dikkat edin.
NOT: Kontur hacmi ve fırlatma fraksiyonu formüller kullanılarak el ile hesaplanabilir
SV = EDV-ESV
EF = (EDV-ESV)/EDV
SV inme hacmi, EDV son diyastolik hacim, ESV sonu sistolik hacim ve EF ejeksiyon fraksiyonu - Formülü kullanarak kesirli alan değişikliğini hesaplama
FAC = (VAd - VAs)/ VAd
FAC kesirli alan değişikliği olduğu yerde, VAd diastole ventriküler alan, ve VAs sisstole ventriküler alandır. - Formülü kullanarak kardiyak debi hesaplama
CO = İk x SV
CO kardiyak debi, HR kalp hızı ve SV inme hacmi - Darbeli Dalga Doppler Modu görüntüsünü kullanarak, kardiyak paketin altındaki MV Akış seçeneğini seçerek giriş kan hızını ölçün(Şekil 4). Sırasıyla erken diyastole ve geç diyastole için E veya A'yı seçin ve grafikteki pik hızları belirleyin(Şekil 3C).
- AoV Akışını seçerek çıkış kan hızını ölçün ve izlemedeki zirveleri belirleyin (Şekil 3D).
- Daha güvenilir bir değerlendirme için 2 farklı metodoloji kullanarak kalp hızını ölçün:
- Görüntü edinimi sırasında kalp ekranda görüntülendiğinde, 10'lu s içindeki atışları sayın ve 6 ile çarp.
- Vevo LAB yazılımındaki Pulse Wave Doppler görüntüsünü kullanarak, kalp atış hızı düğmesini ve ardışık 3 aort akış tepe noktası arasındaki izleme aralıklarını seçin(Şekil 4 ve Şekil 6).
- LV ve kan akışının zirveleri takip ettikten sonra bir elektronik tabloya veri aktarmak için, rapor | ihracat | olarak kaydedin | exceltıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan protokol, insan ve hayvan ekokardiyografisinde kullanılan tekniğe benzer şekilde önemli kardiyak boyutlu ve fonksiyonel parametrelerin ölçülmesine olanak sağlar. B-Mode görüntüleri, ventriküler iç duvarın siston ve diyastole(Şekil 5)olarak izlenmesine ve oda ve duvar boyutları gibi boyutsal verilerin ve kalp hızı, inme hacmi ve kardiyak debi gibi fonksiyonel verilerin yanı sıra kesirli alan değişimi ve ejeksiyon fraksiyonu gibi ventriküler sistolik fonksiyonun parametrelerinin elde edilmesine olanak sağlar (Tablo 1). Renkli Doppler Modu görüntülerini kullanarak atriyoventriküler kapak düzeyinde yapılan ölçümler de ventriküler giriş ve çıkış kan hızlarını sağlar (sırasıyla kanın dolduğu ve ventrikülden çıktığı hız)(Şekil 3 ve Tablo 1).
Bu çalışmada elde edilen parametreler, daha önceki çalışmalarda benzer deneysel koşullar6,16,17 (Tablo 1)kullanılarak bildirilen parametrelerle karşılaştırılabilir ve yöntemin tekrarlanabilirliğini daha iyi gösterişsiz kalmıştır. Genel olarak, bu ayrıntılı protokolü kullanarak bir zebrabalığı kardiyak fonksiyonunu etkili ve tutarlı bir şekilde değerlendirebileceğini gösteriyoruz, ki bu çalışma sırasında farklı kardiyak fenotipleri karşılaştırırken önemlidir.
Şekil 1: Yetişkin zebra balığı kalbinin illüstrasyonu. Kan akımı dolaşımı oklar ile temsil edilir: kan atriyum sinüs venöz akar ve daha fazla ventrikül aktarılır, bulbus arteriosus pompalanır nerede. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Balık görüntüleme odası. (A) Balık görüntüleme "odası" hazırlamak için, dikey yönde bir ucuna doğru kesi olan bir sünger cam bir kap içine yerleştirilir. (B) Cam kap daha sonra eğimli görüntüleme platformuna sıkıca bantlanır. (C) Dönüştürücü manipülatörüzerine monte edilir ve doğru görüntüleme konumlandırma için kesi paralel yerleştirilir (transdüser çentik operatöre doğru işaret ediyor). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Renk Doppler modunda atriyoventriküler giriş (A) ve çıkış (B) ve ilgili ventriküler diyastolik dalga zirvelerinin hızlarını değerlendirmek için karşılık gelen Darbeli Dalga Doppler (C) ve ventrikül çıkış (D). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Görüntü analizi. Görüntü işlemeden sonra (istenilen kontrast ve görüntü parlaklığını elde etmek için), ölçümler PW Doppler modunda (solda) ve B-modu (sağda) görüntülerde gerçekleştirilebilir. B modu görüntüsündeki LV duvarını izlemek için açılır menüden Kardiyak Paket'i seçin, PSLAX'agidin ve LV Trace'iseçin. PW Doppler modu görüntüsündeki pik hızları ölçmek için açılır menüden Kardiyak Paket'i seçin. Ventriküler kan giriş hızını ölçmek için, MV Flow seçeneğini seçin ve sırasıyla erken diyatoç ve geç diyatostole için E veya A'yı seçin. Çıkış kan hızı belirlenmesi için, AoV Akış ve AV pik hızseçin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: B-modu görüntüler. (A) Ventrikül 'in B-Mode görüntüsü (V) diastole, atriyumdan gelen kanla doldurulmuş (A). (B) Sisiyon ventrikül B-Mode görüntü, bulbus arteriosus (B, yeşil izleme) yoluyla kan çıkarma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Pulse Wave Doppler görüntüsü. Bir kalp hızı değeri 3 ardışık aort akış zirveleri izleyerek oluşturulabilir. Analiz yazılımındaki ölçümler sekmesinde kalp atış hızı düğmesini seçerek aort akış zirveleri görüntülenebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Parametreler, birimler ± sd | Bu çalışma | Wang, L. ve ark, 2017; Lee, L. ve ark, 2016 & Mishra, S. ve ark, 2019 | Yorumlar / Açıklama |
| Kalp hızı (HR), bpm | 133 ± 7 | 118 ± 14 - 162 ± 32 | Yabani tip AB/ABTU erkek ve dişiler 3-12 ay arasında tricaine anestezi 0.2 mg/mL |
| Kesirli alan değişimi (FAC) | 0,38 ± 0,03 | 0,29 ± 0,07 - 0,39 ± 0,05 | |
| Çıkarma fraksiyonu (EF), [%] | 42 ± 7 | 34 ± 0,04 - 48 ± 0,03 | |
| Kontur hacmi (SV), μL | 0,21 ± 0,01 | 0,18 ± 0,06 - 0,28 ± 0,08 | |
| Kardiyak debi (CO), μL min-1 | 27.3 ± 1.69 | 19 ± 9,5 - 36,1 ± 7,8 | |
| E pik hızı (erken ventrikül girişi), mm/s | 30 ± 6.8 | 25 ± 7 - 51 ± 16 | |
| Pik hız (geç ventrikül girişi), mm/s | 152 ± 32 | 144 ± 36 - 288 ± 54 | |
| Ventriküler çıkış, mm/s | 86.6 ± 19 | Yok |
Tablo 1: Erişkin zebra balıklarında ekokardiyografik parametreler. 0.2 mg/mL triain çözeltisi ile 3-12 ay arasında erişkin erkek veya dişi zebra balıkları için yapılan çalışmada kardiyak fonksiyon parametreleri için elde edilen değerler değerlendirildi. Daha önceki çalışmalarda aynı parametreler için elde edilen bir dizi değer6,16,17 benzer koşullarda gerçekleştirilen doğrulama ve yöntemin standardize edilmesine yardımcı olmak için sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Erişkin zebra balıklarında ekokardiyografik görüntüleme ve kardiyak fonksiyonun değerlendirilmesi için sistematik bir yöntem tanımladık. Ekokardiyografi canlı erişkin balık kardiyak görüntüleme ve fonksiyonel analiz için mevcut tek non-invaziv ve en sağlam yöntemdir, ve zebrabalığı kardiyovasküler araştırmalarda giderek daha popüler hale gelmektedir. İhtiyaç duyulan süre kısadır ve yüksek iş ve boylamsal çalışmalara olanak sağlar. Ancak, kullanılan metodoloji ve veri analizinde önemli farklılıklar vardır. Zebra balığı ekokardiyografisinin standardizasyonu, bu kadar çok değişken yaklaşan parametreleri etkileyebiliyorsa çok zordur. Deneysel çalışmalar yaparken, anestezi, vücut ağırlığı, yaş, cinsiyet ve arka plan gerginliği de dahil olmak üzere değişkenlik üretebilecek koşulları göz önünde bulundurmalıdır. Wang, L ve ark.16 bu faktörlerin getirdiği değişkenliği değerlendirdi ve yöntemin standardize edilmesine yardımcı olmak için zebra balığı kardiyak fonksiyonu hakkındaki mevcut verileri derledi. Onların çalışma zebrabalığı ekokardiyografik değerlendirme içeren deneysel çalışmalar tasarlamak için çok yararlı bir kaynaktır. Wang, L ve ark.16 tarafından sağlanan bilgilere ve kendi gözlemlerimiz6'yadayanarak, protokol optimizasyonu ve tekrarlanabilirlik için önemli olduğunu düşündüğümüz kritik adımların ve koşulların ana hatlarını salıyoruz:
Örnek seçimi: Önceki çalışmalarsistolik fonksiyon parametrelerinin (EF, FAC) cinsiyet farklılıklarından önemli ölçüde etkilenmediğini, diyastolik fonksiyonun (yani pik dalga E/A oranının) 6 aydan büyük kadınlarda önemli ölçüde daha düşük olabileceğini göstermektedir. Ayrıca ventriküler alanların ve hacimlerin balık yaşı (3 ay ve üzeri) ile önemli ölçüde arttığı ve yüksek vücut ağırlığı ve büyüklüğü nedeniyle kadınlarda önemli ölçüde daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Diyastolik hacimlerin vücut kitle indeksi (VKİ) ve vücut yüzey alanına (BSA) indekslemi, yaşla eşleşen kadınlar ve erkekler arasındaki farklılıkların ortadan kaldırılmasına yardımcı olabilir ve BSA ve kiloya indeksleme yaşa bağlı diyastolik hacim farklarının üstesinden gelinmeye yardımcı olabilir16. Ayrıca farklı arka plan suşları16ile balık arasında farklı diyastolik fonksiyonları raporlar vardı. Genel olarak, deneysel tasarım seçerken, yaş ve gerinim uyumlu kontroller kullanmak ve farklı cinsiyetleri karıştırma önlemek tavsiye edilir. Gravid dişilerde görüntü kalitesi daha düşük olduğu için erkek kullanılması önerilir.
Tarama pozisyonu: Bu kurulumda iki tarama pozisyonu mümkündür: uzunlamasına eksen ve kısa eksen. Kısa eksen modunda kardiyak odaları tanımlamanın çok zor olduğunu bulduk. Bu nedenle, sadece uzunlamasına eksen kullanılır ve B-modunda kardiyak odaların delihat ve ventriküler boyut ve fonksiyon türevi için ikinci öneririz.
Anestezi: Ölçüm sırasında önemli bradikardi önlemek için yeterli sedasyon önemlidir. Kalp hızı kardiyak fonksiyonel ölçümü etkileyecek, çalışmanın doğruluğu ödün. Triain en sık anestezik ajandır ve yeterli sedasyon sağlamak için 0.2 mg/mL doz bulundu. Ancak sedasyon16altında 3-4 dk sonra kalp hızı azalmaya başladığından ölçüm süresi önemlidir. Değişkenlik getirmekten kaçınmak için ölçümleri 3 dk'nın altında tutmak çok önemlidir.
Kritik parametreler: Tutarlılık ve doğruluk hedeflendiğinde kalp hızı kritik bir parametre olarak düşünülebilir. Kalp hızı test edilen deneysel gruplar arasında ve kullanılan koşullar için bildirilen değerler aralığında karşılaştırılabilir olmalıdır. 118 ± 14-162 ± 32 bpm aralığının yabani tip zebra balığı için normal değerleri temsil edebildiği bulunmuştur 3-12 aylık erişkinler 0.2mg/mL trikain ile 3 dk'dan daha az süreyle anestezi yetirilen erişkinler.
Sonuç doğruluğu: Doğruluğu sağlamak için ölçümler en az 3 kardiyak döngü üzerinden alınmalıdır. Daha doğru manuel görüntü izlemeleri elde etmek için, analiz kör bir şekilde yapılmalıdır.
En uygun koşulları seçmenin yanı sıra, doğru ölçüm sağlamak için çeşitli yönleri önemlidir. İdeal olarak, koşullar mümkün olduğunca normal balık fizyolojik durumuna yakın tutulmalıdır. Su altında tararmak, balıkları doğal ortamlarında ve gaz değişimi, su bileşimi, hidrostatik basınç ve sıcaklık için normal koşullara yakın tutma avantajına sahiptir. Bu tarama balık sırasında oda havası maruz ıslak bir sünger yerleştirilir ve iletkenlik su yerine ultrason jel tarafından etkinleştirilir önceki çalışmalara göre net avantajları vardır9,10. Sualtı taraması, anestezi ile iyileşme arasındaki sürenin 3 dk'nın altında tutulması ve balığın ölçümden hemen sonra geri kazanım suyuna geri dönmesi koşuluyla, işlemden sonra balığın geri kazanılmasına da olanak sağlar. Prosedürün mümkün olduğunca hızlı ve etkili bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlamak için, deneyler yapmadan önce eğitime harcanan önemli miktarda zaman tavsiye edilir.
Ekokardiyografi klinik uygulamada kardiyak fonksiyonu değerlendirmek için çok iyi kurulmuş bir yöntemdir yanı sıra murine (veya diğer memeliler) hayvan modellerinde. Ancak, murin veya insan ekokardiyografisinin aksine, su altında balık ultrasonu yapmak numunenin elektrotlara bağlanmasına izin vermez. Bu nedenle kalp ve solunum hızlarının doğrudan ölçümü mümkün değildir. Bu durumda kalp hızı, 10 veya 15 dk aralıkta dakika başına atımlar sayılarak veya ardışık 3 aort akış tepenoktasını manuel olarak izleyerek ölçülebilir(Şekil 6). Kalp hızı aynı zamanda ventriküler iç duvar takibi ile inme hacmi gibi parametreler elde edildikten sonra manuel olarak hesaplanması gereken kardiyak debi gibi diğer parametrelerin belirlenmesini de etkiler. Dikkate alınması gereken bir diğer yönü de balık kalp morfolojisi memelilerden oldukça farklı olmasıdır. İki odalı zebra balığı kalbinde, ventriküler dolgu çoğunlukla atriyal kontraksiyon ile belirlenir, ve balık genellikle memeliler ile karşılaştırıldığında çok daha düşük erken geç ventriküler dolum oranı mevcut18. Bu zebra balığı ve sağlıklı memeli kalpleri arasında A ve E zirvelerinde nabız dalga Doppler tarafından elde edilen farklı profili açıklar.
Ekokardiyografi balık kardiyak profilinin tam olarak karakterizasyonuna ve birden fazla fonksiyonel parametrelerin nicelleştirilmesine olanak sağlar. Ejeksiyon fraksiyonu, fraksiyonel alan değişimi, kan giriş ve çıkış hızları, kalp hızı ve kardiyak debi için elde edilen değerler önceki çalışmalarda rapor edilen aralıktadır(Tablo 1),yöntemin tekrarlanabilirliğini vurgulamaktadır. Birlikte ele alındığında, bizim veri yüksek frekanslı ultrason ekokardiyografi zebrabalığı kardiyak morfolojisi ve fonksiyon unu ölçerken hastalık modelleri veya ilaç testi değerlendirmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntem olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Fred Roberts'ın teknik desteğine ve el yazmasının revizyonuna teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container - 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Nilius, B., et al. 171, Springer International Publishing. 99-136 (2016).
