Cancer Research

大肠癌HT29衍生癌症干细胞类肿瘤球中的驱动基因发现

Published: July 22, 2020 doi: 10.3791/61077

Summary

这里介绍的是一个协议，用于发现过度表达的驱动基因，维持从结肠直肠HT29细胞中提取的癌症干细胞样细胞。RNAseq 与可用的生物信息学执行调查和筛选基因表达网络，以阐明参与目标肿瘤细胞生存的潜在机制。

Abstract

癌症干细胞对临床治疗起着至关重要的作用，导致肿瘤复发。有许多肿瘤基因与肿瘤的发生和癌症干细胞特性的启动有关。由于结直肠癌衍生肿瘤球形成中的基因表达尚不清楚，因此需要时间来发现一次对一个基因进行工作的机制。这项研究演示了一种快速发现参与体外结直肠癌干细胞存活的驱动基因的方法。在本研究中选择并使用了用于表达LGR5的结肠直肠HT29癌细胞，这些癌细胞在培养为球类时伴随增加CD133茎度标记。所提出的协议用于使用可用的生物信息学执行RNAseq，以快速发现在结直肠HT29衍生的茎类肿瘤球的形成中过度表达的驱动基因。该方法可以快速筛选和发现其他疾病模型中的潜在驱动基因。

Introduction

结肠直肠癌（CRC）是导致全球高患病率和高死亡率^{的主要原因}^,^。由于基因突变和扩增，癌细胞生长没有增殖控制，这有助于细胞生存^3，抗凋亡^4，癌症干细胞⁵^,^5，6，7。^,⁷在肿瘤组织内，肿瘤异质性使肿瘤细胞在治疗期间能够适应和^存活。癌症干细胞（CSCs）自我更新率和多能性高于差异性癌症类型，主要负责肿瘤复发^9、10^,¹⁰和转移性CRC^11。CSC具有更多的耐药性12，13，14和抗凋亡的¹²^,¹³^,¹⁴^特性^15，16，¹⁶从而生存肿瘤化疗。

在这里，为了研究所选CRC干细胞中干细胞的潜在机理，RNAseq对肿瘤球体中不同表达的基因进行了筛选。癌细胞在低粘附条件下生长，受培养基（包括EGF、bFGF、HGF和IL6）的生长因子刺激时，可以形成球状体（也称为肿瘤球）。因此，我们选择了CRC HT29肿瘤细胞，在用氧化铂和伊里诺特康¹⁷治疗时，抗化疗的磷酸化STAT3增加。此外，HT29 在所述培养条件下培养时表示较高的干性标记。HT29衍生的CSC模型表示高量的白化素富含重复性G蛋白耦合受体5（LGR5）18，CRC干细胞¹⁸^{的特定标记}^19，20。²⁰此外，CD133，被认为是癌症干细胞的一般生物标志物，在HT29细胞系^{21中也高度表达}。该协议的目的是发现基于生物信息学数据集的既定癌症干细胞类肿瘤球中的驱动基因组，而不是研究个体肿瘤^基因22。它通过RNAseq分析研究潜在的分子机制，然后进行现有的生物信息学分析。

下一代测序是一种高通量、易用、可靠的DNA测序方法，基于计算帮助，用于全面筛选驱动基因，指导肿瘤^治疗23。该技术还用于检测基因表达从逆转录的分离的RNA样本^24。然而，当使用RNAseq进行筛选时，以治疗为目标最重要的基因在实验样本和控制样本之间可能没有最高的表达差异。因此，一些生物信息学被开发用于根据当前数据集（如KEGG^{25、GO26、27}²⁶^,^或^黑豹28）对基因进行分类和识别，包括独创性通路分析（IPA）29和网络分析²⁹^30。该协议显示 RNAseq 和 NetworkAnalyst 的集成，以快速发现与亲 HT29 细胞相比，所选 HT29 衍生球体中的一组基因。建议将这种方法应用到其他疾病模型，以发现重要基因的差异。

与个体基因表达研究相比，高通量技术为肿瘤精密医学寻找潜在驱动基因提供了优势。借助 KEGG、GO 或 PANTHER 等有用数据集，可以根据疾病模型、信号通路或特定功能识别特定基因，从而快速关注特定的重要基因，从而节省时间和研究成本。类似的应用在以前的研究^14，18，31^,¹⁸^,^使用。特别是，肿瘤是更复杂的，因为不同类型的肿瘤表达区分基因和生存和增殖的途径。因此，本协议可以拾取不同情况下区分不同肿瘤类型的基因。通过了解特定基因表达的机制，有可能找到有效的癌症策略。

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Protocol

1. 细胞培养和肿瘤球的形成

培养HT29细胞在10厘米的培养皿含有Dulbecco的改良鹰介质（DMEM）与10%的胎儿牛血清（FBS）和1%青霉素链霉素抗生素（P/S）。
在37°C的培养箱中生长细胞，在无菌条件下湿度为5%CO₂和95%，直到达到80%的汇合。
在37°C下用1 mL 0.25% trypsin对HT29细胞进行试穿，5分钟，从而通过添加2 mL的DMEM和1%的P/S来中和尝试。
使用血细胞计计算HT29细胞。
将 2，000 个细胞/孔添加到低附 6 孔板中，带 2 mL 无血清 DMEM，带 1% P/S，并辅以 0.2% B27，表皮生长因子（EGF）20纳克/mL，成纤维细胞生长因子20纳克/mL，肝细胞生长因子20纳克/mL，白细胞间6（IL6）20纳克/mL。
在37°C下生长细胞，在无菌条件下，_在5%CO2和95%的湿度下生长细胞。
每2天加入0.5 mL的癌症干细胞培养，直到肿瘤球测量直径大于100μm，至少7天。
使用带数字细胞成像系统的倒置显微镜观察和测量肿瘤球直径。
当肿瘤球的直径达到>100 μm时，在37°C下用0.25%胰腺素对肿瘤球进行胰腺素的试穿，用5分钟进行胰腺素，通过添加生长介质体积的2倍来中和胰腺素。使用血细胞计计算细胞。
以 1，200 rpm 的速度离心 10 分钟，然后取出上一代。
在室温下，单独在100μL的DMEM中孵育5 x 10⁴个细胞，其中2μL抗LGR5-PE和2μL抗CD133-PE，在室温下30分钟，在200转/时摇动。
注：CD133是一种一般癌症干细胞生物标志物，在HT29细胞中高度表达。
加入 900 μL 的 PBS，并使用流式细胞学分析 LGR5 和 CD133 表达式。FL2-H通道中荧光的变化表示基因表达。

2. RNA分离

注：使用商业套件（参见材料表），按照制造商的说明进行RNA分离的快速列。

将 50 μL 的 PBS 添加到收获的细胞（2 x 10⁵细胞）中，然后用移液重新暂停。
加入含有2μLβ-甲醇（+-ME）的200μL解液缓冲液。漩涡快速，让站立5分钟。
以 16，000 x g离心溶液 10 分钟，收集上一代，与 200 μL 的 70% 乙醇混合。
使用附加的柱以 14，000 x g的离心去除溶剂 1 分钟。
使用洗涤液 1 和 2 清洗，以 14，000 x g的离心完全去除非RNA，1 分钟。
再次以 14，000 x g 离心2 分钟，以去除残留乙醇。
加入50μL的蒸馏水，以14，000 x g离心1分钟，并收集溶液。
使用 OD₂₆₀使用分光光度计测量 RNA 浓度。
RNA 浓度（μg/mL） = （OD₂₆₀） x （40 μg RNA/mL）和 OD₂₆₀/OD₂₈₀ > 2。RNA 样本应具有 RNA 完整性编号（RIN） > 7。

3. RNAseq 剖析和生物信息学分析

注：RNAseq 分析是商业上进行的（参见材料表），以研究 HT29 衍生肿瘤球中与亲 HT29 细胞相比的差分基因。

使用商业服务执行 RNAseq 步骤，包括图书馆建设、图书馆质量控制和 DNA 测序。
数据报告应包含重要信息，包括读取计数、log2 折叠更改和 p 值。根据以下参数选择差异基因：HT29 肿瘤球组中读取计数为 >100 的基因，读取计数大于 1 的对数变化的基因，在 HT29 父母组中具有读取计数 >100 的基因。。在这种情况下，p 值 < 0.05 被认为是可接受的，并且使用了数据（表 1）
注：在这里，基因计数>100被用作阈值，以继续研究特定基因并验证其表达。
使用统计分析软件（参见材料表），以显示热图并识别过度表达的基因>1和下导基因<1 在日志2 折叠变化中。
使用 R 软件绘制火山图与 x： log2 折叠变化;y： -log10 （p 值）以显示差异基因。
1. 安装 R 库
  安装.包（库（校准））
2. 使用以下程序阅读 RStudio 中的数据：
  res <- read.csv（"/用户/x.csv"，标题\T）
  头（res）
  与（res，绘图（log2foldchange， - log10 （pvalue）， pch= 19，主= "HT29CSC vs HT29"， xlim=c （-6， 6）， col= "#C0C0C0"）
  与（子集（res、pvalue<.05 和 log2FoldChange>1），点（log2FoldChange，-log10（pvalue），pch=19，col="red"）
  与（子集（res、pvalue<.05 和 log2FoldChange<（-1），点（log2FoldChange， -log10（值），pch=19，col="蓝色"）
  与（子集（res， pvalue>.05），点（log2FoldChange， - log10 （pvalue）， pch=19， col="#444444"）
  abline（h=1.3，lty=2）
  abline（v=1，lty=2）
  abline（v=（-1），lty=2）
3. 执行运行以获取火山图。

4. 驾驶员基因选择

在网络分析中选择单个基因输入。
复制并粘贴表1中选定的过度表达基因，将"人类"指定为生物体和ID类型官方基因符号。
注意：或者，使用Ensembl基因ID进行复制和粘贴。
通过单击"上传"并按照遗传PPI 使用蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）来插入数据。
使用信念分数截止值为 900 的 STRING 相互作用数据库显示种子基因与上传的基因交叉链接。与更多个体基因相关的种子基因被选为驱动基因，这些基因可能有助于维持HT29衍生肿瘤球的形成。
注意：有三个交互组数据集供使用：IMEx、STRING 和 Rolland。STRING 包含更高的置信度实验证据。使用较低的上传基因数，可以选择 IMEx 来预测和拾取交互组网络中的驱动基因。
在映射概述中选择"继续"。
在"布局"旋钮中选择"背景"中的"白色"和"强制图集"。
选择黑豹BP来分析上调节基因组。
注：这表明HSPA5在这项研究中对HT29衍生肿瘤球的抗凋亡负责（图3A）。为了缩小特定功能领域，可以替代使用 KEGG、GO 或豹分类来选择特定的驱动基因。

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Representative Results

为了建立研究癌症干细胞机制的模型，将结肠直肠HT29细胞用于在含有B27、EGF、bFGF、HGF和IL6的低附板中体外培养癌症干细胞类肿瘤球。肿瘤球直径为100μm，在7天内形成（图1A）。肿瘤球被胰腺素化为单细胞，并使用流式细胞学检测LGR5和CD133表达进行分析。LGR5在HT29驱动肿瘤球中从1.1%增加到11.4%，并且使用流细胞学检测细胞（图1B）。与亲亲HT29细胞相比，另一种干细胞标记CD133在培养的HT29衍生肿瘤球中也从61.8%增加到81.1%（图1C）。然后，肿瘤球为RNAseq调查做好准备。

RNAseq 用于研究与亲 HT29 细胞相比，HT29 衍生肿瘤球中的基因表达特征。两个样品核苷酸读数的误差率为0.03%。HT29的总基因映射率为87.87%，HT29衍生肿瘤球的总基因映射率为87.25%。每百万份转录本（FPKM）的片段，使检测计数正常化，用于指示转录本（mRNA）表达，0和1之间的间隔为HT29细胞的75.87%，HT29衍生肿瘤球的77.16%。结果适用于随后的测序。测序读取后，选择了在上调节中具有对数2折叠变化和在下调节中变化<--1的基因，其p值为<0.05（图2A，表1，表2）。有79个向上调节基因和33个向下调节的基因被选中。此外，使用对数2折叠变化和p值（-log10 p值）的火山图用于区分HT29衍生肿瘤球和亲亲HT29细胞之间的重要基因（图2B）。根据初步选择，在HT29衍生肿瘤球中确定了三个潜在的上升调节基因，包括ACS2、HMGCS1和PCSK9（图2A）。 ACSS2 HMGCS1此外，为了识别驱动基因不仅仅根据对数2折叠的变化，网络分析使用。对具有对数2折叠变化的上调节基因>1（p值<0.05）进行了分析，结果10个种子基因交叉连接基因网络，包括HSPA5、HSP90AA1、BRCA1、SFN、E2F1、CYCS、CDC6、ALY、SQSTM1和汤姆姆40（图3A）。 HSPA5 HSP90AA1 BRCA1 SFN E2F1 CYCS CDC6 ALYREF SQSTM1为了确定种子基因的功能和意义，分类界面可用于执行黑豹BP，以确定在HT29衍生肿瘤球中涉及抗凋亡的基因。结果表明，HSPA5和SQSTM1与凋亡的负调控有关（图3A）。此外，所选的10个基因因此得到验证;使用 qPCR 确认的 HT29 衍生肿瘤球中的表达增加（图 3B）。

图1：在体外建立癌症干细胞样肿瘤球。（A） HT29用于形成肿瘤球，在HT29衍生肿瘤球中检测到LGR5（Scale bar = 100μm）。（C） CD133被用作另一个标记，用于识别已建立的肿瘤球中的茎字符。请单击此处查看此图的较大版本。

图2：使用热图和火山图来选择HT29衍生肿瘤球中的差分基因。Log2 折叠更改 >1 和 <--1，读取计数 >100，p 值 < 0.05 用于排除非重要基因并确保数据准确。请单击此处查看此图的较大版本。

图3：网络分析用于识别HT29衍生肿瘤球中的驱动基因。（A）因此选择了向上调节的基因，并由此对分类接口，豹BP，提供了差分驱动基因的潜在功能。（B）然后，qPCR用于验证与亲体HT29细胞相比，在HT29衍生肿瘤球中调节的10个基因。请单击此处查看此图的较大版本。

表1：与RNAseq分析的亲亲HT29细胞相比，HT29-血清肿瘤球的上调节基因。请点击这里下载此表。

表2：与RNAseq分析的亲亲HT29细胞相比，HT29-血清肿瘤球的向下调节基因。请点击这里下载此表。

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Discussion

在这项研究中，培养的癌症干细胞样肿瘤球被用作用可用的生物信息学分析RNAseq数据的模型。对于疾病模型，使用了HT29衍生的肿瘤球。由于肿瘤球对肿瘤疗法具有耐药性，因此利用建立的模型通过研究基因表达的差异来研究抗药性的详细机制。此外，使用RNAseq与可用的生物信息学的基因组技术提供了快速了解的研究模型，因此可能涉及的基因可以更有信心地验证。此外，可以识别肿瘤球形成中涉及的基因种类。

RNA质量对RNAseq分析^{32至关重要}。确保样本具有 RIN >7，因为它增加了映射读取、映射基因和 FPKM 之间的确定性。在分析RNAseq数据时，IPA²⁹和网络分析³⁰可用于识别潜在的基因和信号通路。但是，必须根据以下参数排除不必要的基因：在实验组中显示 >1 log2 折叠变化的基因与读取计数 >100，基因 <-1 log2 折叠变化与读取计数 > 100 对照组。使用 qPCR 或西方印迹进行后继验证时，读取计数越高。

基于对生物功能和过程的理解，有许多生物信息学工具，可以快速调查感兴趣的疾病的潜在机制。结合高通量工具筛选RNAseq等基因表达，可以提出并研究调节所研究疾病发展的潜在机制。在这里，研究从HT29衍生的CRC干细胞类肿瘤球的形成的方法表明，SQSTM1和HSPA5是肿瘤球中调节并参与抗凋亡的目标基因。因此，可以设计更多的实验来研究这些基因的详细机制，从而在进行研究时产生更多的信心和功效。

在这里，只分析了肿瘤球中的上调节基因，因为上升调节被认为是由生长因子的添加引起的。否则，如果实验在肿瘤细胞中使用基因敲打，则下调节基因将被视为可以使用生物信息学选择用于研究的目标。虽然该方法快速可靠，但仍需要通过 qPCR 和西方印迹进行后续验证。还建议使用更多的细胞系进行基因表达验证，特别是临床样本。

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Disclosures

提交人没有相关的财务披露。

Acknowledgments

作者感谢张群纪念医院放射研究所放射生物学核心实验室的技术支持。这项研究得到了长贡纪念医院（CMRPD1J0321）、成新综合医院（CHGH 106-06）和麦凯纪念医院（MMH-CT-10605和MMH-106-61）的资助。供资机构在设计和数据收集、分析和解释数据或撰写手稿方面没有任何影响。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
iRiS Digital Cell Imaging System	Logos Biosystems, Inc	I10999	for observing the formation of tumorspheres
Flow cytometry	BD biosciences	FACSCalibur	for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres
anti-LGR5-PE	Biolegend	373803	LGR5 detection reagent
anti-CD133-PE	Biolegend	372803	CD133 detection reagent
EGF	GenScript	Z00333	for culture of tumorspheres
bFGF	GenScript	Z03116	for culture of tumorspheres
HGF	GenScript	Z03229	for culture of tumorspheres
IL6	GenScript	Z03034	for culture of tumorspheres
PureLink RNA extraction kit	Invitrogen	12183025	isolate total RNA for RNAseq analysis
RNAseq performance	Biotools, Taiwan		RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan
NetworkAnalyst	Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada		http://www.networkanalyst.ca/
Prism	GraphPad Software		a statistical analysis software