Summary
Presentato qui è un protocollo per scoprire i geni del pilota sovraespressi che mantengono le cellule staminali tumorali stabilite derivate dalle cellule del colon-retto HT29. È stato eseguito RNAseq con bioinformatica disponibile per studiare e vagliare le reti di espressione genica per chiarire un potenziale meccanismo coinvolto nella sopravvivenza delle cellule tumorali mirate.
Abstract
Le cellule staminali tumorali svolgono un ruolo vitale contro le terapie cliniche, contribuendo alla ricaduta del tumore. Ci sono molti oncogeni coinvolti nella tumorigenesi e l'avvio delle proprietà dello stelo del cancro. Poiché l'espressione genica nella formazione delle sfere tumorali derivate dal cancro colorettale non è chiara, ci vuole tempo per scoprire i meccanismi che lavorano su un gene alla volta. Questo studio dimostra un metodo per scoprire rapidamente i geni del conducente coinvolti nella sopravvivenza delle cellule staminali del cancro colorettale in vitro. Le cellule tumorali del coloretalizzatore HT29 che esprimono il LGR5 quando coltivate come sferoidi e accompagnano un aumento dei marcatori di stelo CD133 sono state selezionate e utilizzate in questo studio. Il protocollo presentato viene utilizzato per eseguire RNAaseq con bioinformatica disponibile per scoprire rapidamente i geni del pilota sovraespressi nella formazione di sfere tutolali di tipo stelo derivato dall'HT29. La metodologia è in grado di vagliare e scoprire rapidamente potenziali geni del conducente in altri modelli di malattia.
Introduction
Il cancro colorettale (CRC) è una delle principali cause di morte con un'elevata prevalenza e mortalità in tutto il mondo1,2. A causa di mutazioni genetiche e amplificazioni, le cellule tumorali crescono senza controllo proliferativo, che contribuisce alla sopravvivenza cellulare3, anti-apoptosi4e stesità del cancro5,6,7. All'interno di un tessuto tumorale, l'eterogeneità tumorale permette alle cellule tumorali di adattarsi e sopravvivere durante i trattamenti terapeutici8. Le cellule staminali tumorali (CSC), con un più alto tasso di auto-rinnovamento e pluripotenza rispetto ai tipi di cancro differenziale, sono principalmente responsabili della recidiva tumorale9,10 e CRC metastatico11. I CSC presentano più resistenza ai farmaci12,13,14 e proprietà anti-apoptosi15,16, superstiggino così le chemioterapie tumorali.
Qui, al fine di studiare il potenziale meccanismo di stelo nelle cellule staminali CRC selezionate, è stato eseguito RNAseq per vagliare i geni espressi in modo differenziale negli sferoidi tumorali. Le cellule tumorali possono formare sferoidi (chiamati anche sfere tumorali) quando coltivati in condizioni di bassa aderenza e stimolati da fattori di crescita aggiunti al mezzo coltivato, tra cui EGF, bFGF, HGF, e IL6. Pertanto, abbiamo selezionato le cellule tumorali CRC HT29 che resistono alle chemioterapie con un aumento della STAT3 fosforolata quando trattate con oxaliplatin e irinotecon17. Inoltre, HT29 ha espresso marcatori di gambo più elevati quando coltivato nelle condizioni di coltura descritte. Il modello CSC derivato dall'HT29 esprimeva quantità più elevate di recettore G-proteina accoppiato a proteina 5 (LGR5)18,un marcatore specifico delle cellule staminali CRC19,20. Inoltre, CD133, considerato un biomarcatore generale per le cellule staminali tumorali, è anche altamente espresso nella linea cellulare HT2921. Lo scopo di questo protocollo è quello di scoprire gruppi di geni di guida nelle sfere tumorali simili a stelo del cancro stabilite basate su set di dati bioinformatici anziché studiare oncogeni individuali22. Esamina i potenziali meccanismi molecolari attraverso l'analisi degli RNAeq seguita da analisi bioinformatiche disponibili.
Il sequenziamento di nuova generazione è un metodo di sequenziamento del DNA ad alta produttività, facilmente reperibile e affidabile basato su un aiuto computazionale, utilizzato per vagliare in modo completo i geni del conducente per guidare le terapie tumorali23. La tecnologia viene utilizzata anche per rilevare l'espressione genica dalla trascrizione inversa di un campione di RNA isolato24. Tuttavia, durante lo screening con RNAseq, i geni più importanti da rivolgere con la terapia potrebbero non avere il differenziale di espressione più alto tra campioni sperimentali e di controllo. Pertanto, sono state sviluppate alcune bioinformatice per classificare e identificare i geni in base ai set di dati attuali come KEGG25, GO26,27o PANTHER28, tra cui Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 e NetworkAnalyst30. Questo protocollo mostra l'integrazione di RNAseq e NetworkAnalyst per scoprire rapidamente un gruppo di geni negli sferoidi selezionati derivati dall'HT29 rispetto alle cellule parentali HT29. L'applicazione di questo metodo ad altri modelli di malattia è anche suggerita per scoprire le differenze nei geni importanti.
Rispetto allo studio dell'espressione genica individuale, una tecnica ad alto throughput offre vantaggi per trovare facilmente potenziali geni del conducente per la medicina di precisione del tumore. Con set di dati utili come KEGG, GO o PANTHER, geni specifici possono essere identificati sulla base dei modelli di malattia, dei percorsi di segnalazione o di funzioni specifiche, e questo permette di concentrarsi rapidamente su geni specifici e importanti, risparmiando tempo e costi di ricerca. Un'applicazione simile viene utilizzata negli studi precedenti14,18,31. In particolare, un tumore è più complicato perché diversi tipi di tumori esprimono geni distintivi e percorsi per la sopravvivenza e la proliferazione. Pertanto, questo protocollo può raccogliere geni che distinguono diversi tipi di tumore in circostanze diverse. C'è il potenziale per trovare strategie efficaci contro i tumori comprendendo il meccanismo di un'espressione genica specifica.
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Protocol
1. Coltura cellulare e formazione della sfera della tumore
- Coltura cellule HT29 in un piatto da 10 cm contenente il mezzo aquila modificato di Dulbecco (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% antibiotico penicillina-streptomicina (P/S).
- Coltiva le cellule in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 e il 95% di umidità in condizioni aptiche, fino a raggiungere l'80% di confluenza.
- Provare le celle HT29 con 1 mL di 0,25% trypsin per 5 min a 37 s c e di conseguenza neutralizzare la trypsin aggiungendo 2 mL di DMEM con 10% FBS e 1% P/S.
- Contare le cellule HT29 usando un emocitometro.
- Aggiungere 2.000 cellule / pozzo ad un basso attaccato 6 piastre di pozzo con 2 mL di DMEM senza sè erolo con 1% P / S e integrato con 0.2% B27, 20 ng/mL del fattore di crescita epidermico (EGF), 20 ng/mL del fattore di crescita del fibroblasto (bFGF), 20 ng/mL del fattore di crescita epatocite (HGF) e 20 ng/mL di interleucina 6 (IL6).
- Far crescere le cellule a 37 gradi centigradi con un'umidità del 5% di CO2 e del 95% in condizioni aptiche.
- Aggiungere 0,5 mL di media delle cellule staminali tumorali ogni 2 giorni fino a quando le sfere tumorali misurano >100 m di diametro per almeno 7 giorni.
- Osservare e misurare il diametro della biosfera della tumore utilizzando un microscopio invertito con un sistema di imaging cellulare digitale.
- Quando le sfere tumorali raggiungono >100 m di diametro, provare le sfere tumorali con 0,25% di prova per 5 min a 37 gradi centigradi e neutralizzare la metapsina aggiungendo 2x il volume del mezzo di crescita. Contare le cellule usando un emocitometro.
- Centrifuga a 1.200 giri/mm per 10 min e rimuovere il supernatante.
- Incubare 5 x 104 celle con 2 -L di anti-LGR5-PE e 2 -L di anti-CD133-PE in 100 - L di DMEM singolarmente per 30 min a temperatura ambiente, tremando a 200 rpm.
NOTA: CD133 è un biomarcatore a cellule staminali tumorali generale altamente espresso nelle cellule HT29. - Aggiungere 900 l di PBS e analizzare l'espressione LGR5 e CD133 utilizzando la citometria di flusso. Un cambiamento di fluorescenza nel canale FL2-H indica l'espressione genica.
2. Isolamento dell'RNA
NOTA: Utilizzare un kit commerciale (vedere Tabella dei materiali) con una colonna rapida per l'isolamento dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere 50 l di PBS alle cellule raccolte (2 x 105 celle) e sospenderle con la pipettatura.
- Aggiungere 200 l di buffer di lisi contenente 2 - L di beta-mercaptoetanolo (z-ME). Vortice rapidamente e lasciare riposare per 5 min.
- Centrifugare la soluzione a 16.000 x g per 10 min. Raccogliere il supernatante e mescolare con 200 l undi 70% di etanolo.
- Utilizzare la colonna allegata per rimuovere il solvente mediante centrifugazione a 14.000 x g per 1 min.
- Lavare utilizzando la soluzione di lavaggio 1 e 2 per rimuovere completamente i non-RNA con centrifugazione a 14.000 x g per 1 min.
- Centrifuga di nuovo a 14.000 x g per 2 min per rimuovere l'etanolo residuo.
- Aggiungete 50 l di acqua distillata, centrifugate a 14.000 x g per 1 min e raccogliete la soluzione.
- Misurare la concentrazione di RNA utilizzando OD260 con uno spettrofotometro.
Concentrazione di RNA (G/mL) - (OD260) x (40 g di RNA/mL) e OD260/OD280 > 2. I campioni di RNA devono avere un numero di integrità dell'RNA (RIN) > 7.
3. Profilazione degli RNA e analisi bioinformatica
NOTA: L'analisi degli RNAseq è stata eseguita commercialmente (vedi Tabella dei materiali)per studiare i geni differenziali nelle sfere tumorali derivate dall'HT29 rispetto alle cellule hT29 dei genitori.
- Utilizzare servizi commerciali per fasi RNAseq, tra cui la costruzione della libreria, il controllo qualità della libreria e il sequenziamento del DNA.
- Il report dei dati deve contenere informazioni importanti, tra cui i conteggi di lettura, la modifica della piega log2 e il valore p. Selezionare i geni differenziali in base ai seguenti parametri: geni con un > 1 log2 fold change con conteggi di lettura >100 nel gruppo HT29 tumorsphere e gene <-1 log2 (conta piegatura con read count >100 nel gruppo genitoriale HT29). In questo caso, un valore p < 0.05 è stato considerato accettabile e i dati sono stati utilizzati(tabella 1).
NOTA: Qui, un conteggio genico >100 è stato utilizzato come soglia per continuare lo studio di un particolare gene e convalidarne l'espressione. - Utilizzare un software di analisi statistica (vedere Tabella dei materiali), per mostrare una mappa termica e identificare i geni sovraespressi >1 e i geni downregulated < 1 nella modifica della piega log2.
- Utilizzare il software R per disegnare il grafico vulcano con x: log2 modifica piega; y: -log10 (valore p) per mostrare i geni differenziali.
- Installare la libreria RInstall R library
install.packages(libreria(calibrato)) - Leggere i dati in RStudio con il seguente programma:
res <-read.csv("/Users/xxx.csv", intestazione: T)
head(res)
with(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch-19, main,"HT29CSC vs HT29", xlim-c(-6,6), col'"#C0C0C0"))
with(subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange>1), punti(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch
with(subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), punti(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch-19, col "blue"))
with(subset(res, pvalue>.05), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch-19, col'"#444444"))
abline (h , 1,3, lty - 2)
abline(v, 1, lty-2)
abline(v) (-1), lty - Eseguire la corsa per ottenere il grafico vulcano.
- Installare la libreria RInstall R library
4. Selezione genica del conducente
- Selezionare Input gene singolo in NetworkAnalyst.Select Single gene Input in NetworkAnalyst.
- Copiare e incollare i geni sovraespressi selezionati dalla Tabella 1 con "umano" specificato come organismo e ID tipo Simbolo Gene ufficiale.
NOTA: In alternativa, utilizzare Ensembl Gene ID per copiare e incollare. - Inserire i dati facendo clic su Carica e procedi per analizzarli utilizzando l'interazione proteina-proteina (PPI) in seguito al PPI genetico.
- Utilizzare il database dell'interactoma STRING con un punteggio di confidenza di 900 per mostrare i geni dei semi che collegano i geni caricati. I geni dei semi che si associano a più geni individuali sono stati selezionati come geni guida che possono essere coinvolti nel mantenimento della formazione di sfere tumorali derivate dall'HT29.
NOTA: sono disponibili tre set di dati di interazione da utilizzare: IMEx, STRING e Rolland. STRING contiene prove sperimentali di maggiore sicurezza. Con un numero di geni caricati più bassi, IMEx può essere selezionato per prevedere e raccogliere i geni del conducente nelle reti interagentiche. - Selezionare Procedi nella panoramica del mapping.
- Selezionare Bianco nell'Atlante sfondo e Forza nella manopola Layout.
- Selezionare PANTHER BP per analizzare il gruppo genico di upregulation.
NOTA: Questo mostra che HSPA5 era responsabile dell'anti-apoptosi nelle tumori derivanti dall'HT29 in questo studio (Figura 3A). Per restringere il campo funzionale specifico, la classificazione KEGG, GO o PANTHER può essere utilizzata in alternativa per selezionare i geni del conducente specifici.
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Representative Results
Per stabilire il modello per studiare il meccanismo nelle cellule staminali tumorali, le cellule del colon-retto HT29 sono state utilizzate per colture le sfere tumorali simili a stelo del cancro in vitro in una piastra a basso attaccamento contenente B27, EGF, bFGF, HGF e IL6. Le sfere tumorali > 100 m di diametro si sono formate in 7 giorni (Figura 1A). Le sfere tumorali sono state provate in singole cellule e analizzate usando la citometria di flusso per rilevare l'espressione LGR5 e CD133. LGR5 è aumentato nelle sfere tumorali guidate dall'HT29 dall'1,1% all'11,4% e le cellule sono state rilevate utilizzando la citometria di flusso (Figura 1B). Un altro marcatore di stelo, CD133, è aumentato dal 61,8% all'81,1% nelle sfere tumorali coltivate derivate dall'HT29 rispetto alle cellule parentali HT29 (Figura 1C). Poi, le sfere tumorali erano pronte per l'indagine RNAseq.
RNAseq è stato utilizzato per studiare il profilo di espressione genica nelle sfere tumorali derivate dall'HT29 rispetto alle cellule hT29 parentali. Il tasso di errore nella lettura dei nucleotidi era dello 0,03% per entrambi i campioni. Il tasso totale di mappatura genica era dell'87,87% per HT29 e dell'87,25% per le sfere tumorali derivate dall'HT29. I frammenti per chilobase di trascrizione per milione (FPKM), normalizzando i conteggi poliziesci per indicare l'espressione della trascrizione (mRNA), l'intervallo tra 0 e 1 era del 75,87% per le cellule HT29 e del 77,16% per le sfere tumorali derivate da HT29. I risultati sono stati adatti per il conseguente sequenziamento. Dopo aver letto il sequenziamento, sono stati selezionati i geni con log2 fold change >1 in upregulation e <-1 in downregulation con valore p < 0.05 mostrato dalla mappa di calore (Figura 2A,Tabella 1, Tabella2). C'erano 79 geni upregulated e 33 geni downregulated selezionati. Inoltre, il grafico Vulcano utilizzando log2 fold change e p value (valore -log10 p) è stato utilizzato per distinguere i geni significativi tra le sfere tumorali derivate da HT29 e le cellule parentali HT29 (Figura 2B). Sulla base della selezione preliminare, sono stati identificati tre geni potenzialmente upregolati, tra cui ACSS2, HMGCS1e PCSK9, nelle sfere tumorali derivate dall'HT29 (Figura 2A). Inoltre, al fine di identificare i geni del conducente non solo in base al cambiamento di piega log2, è stato utilizzato NetworkAnalyst. I geni upregulated con log2 fold change >1 con valore p <0.05 sono stati analizzati e hanno portato a 10 geni di semi che collegano le reti geniche, tra cui HSPA5, HSP90AA1, BRCA1, SFN, E2F1, CYCS, CDC6, ALYREF, SQSTM1e TOMM40 (Figura 3A). Per identificare la funzione e il significato dei geni dei semi, l'interfaccia di classificazione potrebbe essere utilizzata per eseguire PANTHER BP per determinare i geni coinvolti nell'anti-apoptosi nelle sfere tumorali derivate dall'HT29. I risultati hanno indicato che HSPA5 e SQSTM1 sono stati associati a una regolazione negativa dell'apoptosi (Figura 3A). Inoltre, i 10 geni selezionati sono stati convalidati; l'espressione è aumentata nelle sfere tumorali derivate dall'HT29 come confermato utilizzando qPCR (Figura 3B).
Figura 1: Istituzione della tumore del cancro simile a quello del tronco in vitro. (A) HT29 è stato utilizzato per formare le sfere tumorali, e (B) LGR5 è stato rilevato nelle sfere tumorali derivate dall'HT29 (barra di scala 100 m). (C) CD133 è stato utilizzato come un altro marcatore per identificare i caratteri di stelo nelle sfere tumorali stabilite. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Heatmap e Volcano plot sono stati utilizzati per selezionare i geni differenziali nelle sfere tumorali derivate dall'HT29. Log2 fold change >1 e <-1 con read count >100, il valore p < 0.05 sono stati utilizzati per escludere i geni non significativi e assicurarsi che i dati fossero accurati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: NetworkAnalyst è stato utilizzato per identificare i geni del conducente nelle sfere tumorali derivate dall'HT29. (A) I geni upregulated sono stati selezionati e analizzati di conseguenza, e un'interfaccia di classificazione, PANTHER BP, ha fornito le potenziali funzioni per i geni del conducente differenziale. (B) Poi, qPCR è stato utilizzato per convalidare i 10 geni regolati nelle tumori derivate dall'HT29 rispetto alle cellule parentali HT29. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: I geni upregulated nelle tumori dell'HT29 rispetto alle cellule parentali HT29 analizzate da RNAseq. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: I geni downregolati nelle sfere tumorale serived hT29 rispetto alle cellule parentali HT29 analizzate da RNAseq. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
In questo studio, le tumori del cancro coltivato sono state utilizzate come modello nell'analisi dei dati degli RNA con la bioinformatica disponibile. Per un modello di malattia, sono state utilizzate sfere tumorali derivate dall'HT29. Poiché le sfere tumorali hanno resistenza ai farmaci contro le terapie tumorali, il modello stabilito può essere utilizzato per studiare i meccanismi dettagliati della resistenza studiando le differenze nell'espressione genica. Inoltre, la tecnologia genomica che utilizza l'RNAseq con la bioinformatica disponibile fornisce una rapida comprensione del modello di studio in modo che i geni potenzialmente coinvolti possano essere convalidati con maggiore fiducia. Inoltre, è possibile identificare il tipo di geni coinvolti nella formazione delle sfere tumorali.
La qualità dell'RNA è fondamentale per l'analisi degli RNAaseq32. Assicurarsi che il campione abbia RIN >7, perché aumenta la certezza tra la mappatura delle letture, i geni di mappatura e FPKM. Durante l'analisi dei dati RNAseq, IPA29 e NetworkAnalyst30 erano disponibili per identificare potenziali geni e percorsi di segnalazione. Tuttavia, è essenziale escludere i geni non necessari in base ai seguenti parametri: geni che mostrano una modifica di piega >1 log2 con conta lettura >100 nel gruppo sperimentale e geni <-1 log2 modifica piega con conteggio di lettura > 100 nel gruppo di controllo. Un numero di letture più elevato è più facile per la convalida conseguente tramite qPCR o Western blots.
Sulla base della comprensione delle funzioni e dei processi biologici, ci sono molti strumenti bioinformatici che consentono una rapida ricerca dei potenziali meccanismi di malattie di interesse. In combinazione con uno strumento ad alto throughput per lo screening per l'espressione genica come RNAseq, i potenziali meccanismi che regolano lo sviluppo delle malattie studiate possono essere proposti e studiati. Qui, il metodo per studiare la formazione di sfere tumorali simili a CRC derivate da HT29 ha rivelato che SQSTM1 e HSPA5 erano i geni bersaglio regolati e coinvolti nell'anti-apoptosi nelle sfere tumorali. Pertanto, più esperimenti possono essere progettati per studiare il meccanismo dettagliato di questi geni, che si traduce in una maggiore fiducia ed efficacia quando si conducono studi di ricerca.
Qui, solo i geni upregulated nelle sfere tumorali sono stati analizzati perché l'upregulation è stata considerata indotta dall'aggiunta dei fattori di crescita. Altrimenti, se l'esperimento utilizzasse il knockdown genico nelle cellule tumorali, i geni downregolati sarebbero considerati come bersagli che possono essere selezionati per lo studio utilizzando la bioinformatica. Anche se la metodologia è rapida e affidabile, la convalida successiva è ancora necessaria tramite qPCR e blots occidentali. Si suggerisce inoltre di utilizzare più linee cellulari per la convalida dell'espressione genica, in particolare per i campioni clinici.
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Disclosures
Gli autori non hanno informazioni finanziarie rilevanti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Radiation Biology Core Laboratory of Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, per il supporto tecnico. Questo studio è stato sostenuto dalle sovvenzioni del Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1J0321), del Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06) e del Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 e MMH-106-61). Gli organismi finanziatori non hanno avuto alcuna influenza nella progettazione dello studio e nella raccolta, analisi e interpretazione dei dati o nella scrittura del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
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