Summary
Das Ziel dieser Technik ist die ex vivo Visualisierung von pulmonalen arteriellen Netzwerken von frühpostnatalen und erwachsenen Mäusen durch Lungeninflation und Injektion einer radio-opaque polymerbasierten Verbindung über die Lungenarterie. Mögliche Anwendungen für gegossenes Gewebe werden ebenfalls diskutiert.
Abstract
Blutgefäße bilden komplizierte Netzwerke im dreidimensionalen Raum. Daher ist es schwierig, visuell zu schätzen, wie vaskuläre Netzwerke interagieren und sich verhalten, indem sie die Oberfläche eines Gewebes beobachten. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die komplexe dreidimensionale Gefäßarchitektur der Lunge zu visualisieren.
Um dies zu erreichen, wird ein Katheter in die Lungenarterie eingeführt und die Vaskulatur wird gleichzeitig von Blut gespült und chemisch erweitert, um den Widerstand zu begrenzen. Die Lunge wird dann bei einem Standarddruck durch die Luftröhre aufgeblasen und die Polymerverbindung wird bei einer Standarddurchflussrate in das Gefäßbett infundiert. Sobald das gesamte arterielle Netzwerk gefüllt ist und geheilt werden kann, kann die Lungenvaskulatur direkt visualisiert oder auf einem Mikro-CT-Scanner abgebildet werden.
Wenn erfolgreich durchgeführt, kann man das lungenarteriende Netzwerk bei Mäusen vom frühen postnatalen Alter bis zu Erwachsenen zu schätzen wissen. Darüber hinaus kann diese Methode, während sie im pulmonalen Arterienbett demonstriert wird, auf jedes Gefäßbett mit optimierter Katheterplatzierung und Endpunkten angewendet werden.
Introduction
Der Schwerpunkt dieser Technik liegt auf der Visualisierung der pulmonalen arteriellen Architektur mit einer polymerbasierten Verbindung bei Mäusen. Während umfangreiche Arbeiten an systemischen Gefäßbetten wie Gehirn, Herz und Niere1,2,3,4,5durchgeführt wurden, stehen weniger Informationen über die Vorbereitung und Füllung des lungenarterienartigen Netzwerks zur Verfügung. Das Ziel dieser Studie ist es daher, auf frühere Arbeiten6,7,8 zu erweitern und eine detaillierte schriftliche und visuelle Referenz zu liefern, die die Forscher leicht folgen können, um hochauflösende Bilder des Lungenarterienbaums zu erzeugen.
Während es zahlreiche Methoden zur Kennzeichnung und bildgebenden Lungenvaskulatur gibt, wie Magnetresonanztomographie, Echokardiographie oder CT-Angiographie9,10, können viele dieser Modalitäten die kleinen Gefäße nicht ausreichend füllen und/oder erfassen, was den Umfang dessen, was untersucht werden kann, begrenzt. Methoden wie serielle Schnitte und Rekonstruktionen bieten eine hohe Auflösung, sind aber zeit-/arbeitsintensiv11,12,13. Die umgebende Weichteilintegrität wird in traditionellen Korrosionsguss10,13,14,15,16kompromittiert. Auch Tieralter und -größe werden zu Faktoren, wenn man versucht, einen Katheter einzuführen, oder die Auflösung fehlt. Die Polymerinjektionstechnik hingegen füllt die Arterien auf kapillarer Ebene und ermöglicht in Kombination mit dem CT eine unvergleichliche Auflösung5. Proben aus der Mauslunge, die noch jung sind, wurden bis zum 14. Tag erfolgreichgegossen und innerhalb weniger Stunden verarbeitet. Diese können auf unbestimmte Zeit erneut gescannt oder sogar zur histologischen Präparat-/Elektronenmikroskopie (EM) geschickt werden, ohne das vorhandene Weichgewebe17zu beeinträchtigen. Die Haupteinschränkungen dieser Methode sind die Vorabkosten von CT-Geräten/-software, Herausforderungen bei der genauen Überwachung des intravaskulären Drucks und die Unfähigkeit, Daten längs im selben Tier zu erfassen.
Dieses Papier baut auf bestehenden Arbeiten auf, um die Pulmonale-Arterieninjektionstechnik weiter zu optimieren und alters-/größenbezogene Grenzen auf den postnatalen Tag 1 (P1) zu verschieben, um markante Ergebnisse zu erzielen. Es ist am nützlichsten für Teams, die arterielle Gefäßnetzwerke studieren möchten. Dementsprechend bieten wir neue Anleitungen für die Katheterplatzierung/-stabilisierung, eine erhöhte Kontrolle über Füllrate/Volumen und weisen auf bemerkenswerte Fallstricke für einen erhöhten Gusserfolg hin. Die resultierenden Gussteile können dann für zukünftige Charakterisierungen und morphologische Analysen verwendet werden. Vielleicht noch wichtiger ist, dass dies die erste visuelle Demonstration ist, nach unserem Wissen, die den Benutzer durch dieses komplizierte Verfahren führt.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) des National Heart Lung and Blood Institute genehmigt.
1. Vorbereitung
- Injizieren Sie die Maus intraperitoneal mit Heparin (1 Einheit/g Maus Körpergewicht) und lassen Sie es für 2 min ambulate.
- Euthanisieren Sie das Tier in einerCO2-Kammer.
- Ordnen Sie die Maus in einer Supine-Position auf einem chirurgischen Brett an und sichern Sie alle vier Gliedmaßen mit Klebeband am Brett. Verwenden Sie die Vergrößerung für die feine Sezierung.
2. Aussetzen von Lungen und Luftröhre
- Sprühen Sie die ventrale Seite der Maus mit 70% Ethanol, um Haarstörungen zu minimieren.
- Greifen Sie die Bauchhaut mit Derrpen und machen Sie einen kleinen Schnitt mit der Schere in der Nabelregion. Schieben Sie die Spitzen der Schere in die Faszienschicht zwischen Bauchmuskulatur und Haut und beginnen Sie, die beiden Schichten zu trennen. Arbeiten Sie rostral, entfernen Sie die Haut aus dem Bauch, Dem Brustkorb und dem Hals.
- Öffnen Sie die Bauchmuskulatur mit einer Schere und schneiden Sie seitlich auf beiden Seiten, bis das Zwerchfell freigelegt ist.
- Greifen Sie vorsichtig den xiphoiden Prozess und heben Sie den Brustkorb leicht an, um den Blick auf die kaudale Lunge durch die dünne, halbtransparente Membran zu maximieren. Machen Sie vorsichtig einen kleinen Schnitt in der Membran direkt unter dem xiphoiden Prozess. Die Lunge kollabiert und zieht sich vom Zwerchfell zurück. Sezieren Sie das Zwerchfell weg vom Brustkorb und achten Sie darauf, das Lungenparenchym nicht zu nicken.
- Suchen und trennen Sie die minderwertige Vena cava (IVC) und Speiseröhre, wo sie durch das Zwerchfell passieren. Verwenden Sie Gaze, um alle Pooling-Blut in der Brusthöhle zu reinigen, Kontakt mit der Lunge zu vermeiden.
- Greifen Sie das Xiphoid noch einmal und heben Sie sanft an. Schneiden Sie den Brustkorb bilateral (etwa an der midaxillären Linie) und vermeiden Sie den Kontakt mit der Lunge. Entfernen Sie den vorderen Brustkorb vollständig, so dass der letzte Schnitt entlang des Heckwinkels kurz vor dem Manubrium.
- Mit einer Fertigspritze die Lunge großzügig mit phosphatgepufferter Saline (PBS, pH 7,4) befeuchten, um ein Austrocknen zu verhindern. Setzen Sie diese Routine während des gesamten Verfahrens fort.
- Mit Zangen, greifen Sie das Manubrium und heben Sie sanft weg vom Körper. Mit der Schere 1-2 mm seitlich zum Manubrium schneiden, Dieklalen trennen und entfernen. Dadurch wird der Thymus darunter entblößt.
- Greifen Sie jeden Lappen des Thymus, ziehen Sie sie auseinander und entfernen Sie ihn. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit der submandibulären Drüse. Schließlich entfernen Sie das Muskelgewebe, das die Luftröhre überlagert.
HINWEIS: Nach der Zerlegung sollten das Herz, die aufsteigende Aorta (AA), der lungenarterienhafte Stamm (PAT) und die Luftröhre sichtbar sein. Stellen Sie sicher, dass die primären arteriellen Zweige vom Stamm nicht geteilt oder verletzt werden.
3. PA-Katheterisierung und Blutperfusion
- Zur Montage von Einheit 1 1 15 cm PE-10-Schläuche auf die Nabe einer 30 G-Nadel und an einer 1 ml Spritze befestigen, die mit 10-4 M Natriumnitroprussid (SNP) in PBS vorgefüllt ist. Primieren Sie die Schläuche, indem Sie den Kolben voranbringen, bis die gesamte Luft von diesem Gerät gereinigt wird ( Abbildung 1).
VORSICHT: SNP ist giftig, wenn es geschluckt wird. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut und den Augen. Waschen Sie die Haut nach der Handhabung gründlich. Tragen Sie eine geeignete persönliche Schutzausrüstung.- Alternativ können Sie Einheit 2 zusammenbauen. Für Mäuse postnatalen Tag 7 (P7) und jünger, verwenden Sie ein Hämostat, um eine zusätzliche 30 G Nadel von ihrer Nabe zu lösen und die Nadel auf das offene Ende des Schlauches von Einheit 1 (Abbildung 1) einzufädeln.
- Anstelle einer Nadel verwenden Sie gekrümmte scharfe Zangen, um ein Ende einer 10 cm Langen 7-0 Seide zu erfassen. Durchdringen Sie die Spitze des Herzens von einer Seite eindringen und die Spitzen der Zange durch den Muskel und von der anderen Seite passieren. Greifen Sie die Seide mit einem anderen Satz Zange und ziehen Sie etwa 2 cm Länge durch und binden Sie ab. Nehmen Sie das verbleibende 8 cm Ende der Naht, zerren Sie das Herz kauarisch, und band das Ende auf das chirurgische Brett.
HINWEIS: Dies erzeugt Spannung, setzt die großen Gefäße weiter frei und hängt das Herz an Ort und Stelle, was eine einfachere Platzierung des Katheters in der Lungenarterie ermöglicht. - Haken Sie die Spitzen der gekrümmten Zange unter der AA und PAT. Ziehen Sie eine 3 cm Länge von 7-0 Seide zurück durch die Öffnung und erstellen Sie eine einzelne Wurf lose Naht.
- Mit einer Schere machen Sie einen 1-2 mm Schnitt in Richtung der Spitze des Herzens, durchdringen die dünnwandigen rechten Ventrikel (RV), um das Einführen des Katheters (Einheit 1) zu ermöglichen. Bestätigen Sie vor dem Einsetzen, dass sich keine Luft im System befindet. Führen Sie den grundierten Schlauch in den rechten Ventrikel ein und gelangen Sie vorsichtig in den halbtransparenten dünnwandigen PAT.
- Stellen Sie visuell sicher, dass der Katheter weder in den linken noch in den rechten Lungenzweig vorgerückt ist und nicht an den Zweigpunkt der Lungenarterie anschließt. Mit Klebeband, sichern Sie den distalen Teil des Schlauches auf dem operationschirurgischen Brett.
HINWEIS: Um das Wohnmobil zu identifizieren, verwenden Sie Zangen, um die rechte Seite des Herzens zu kneifen. Im Gegensatz zum linken Ventrikel sollte die relativ dünne freie Wand des Wohnmobils leicht zu erfassen sein. - Bei Mäusen, die jünger als P7 sind, schließen Sie Block 2 an einen Mikromanipulator an und führen Sie das Nadelende der Einheit wie oben beschrieben mit dem Manipulator in das PAT ein.
- Stellen Sie visuell sicher, dass der Katheter weder in den linken noch in den rechten Lungenzweig vorgerückt ist und nicht an den Zweigpunkt der Lungenarterie anschließt. Mit Klebeband, sichern Sie den distalen Teil des Schlauches auf dem operationschirurgischen Brett.
- Ziehen Sie vorsichtig die lose Naht um beide großen Gefäße und schneiden Sie die 8 cm Länge der Naht in Schritt 3.2 erstellt, um das Herz in eine natürliche Ruheposition zurück. Der Katheter ist nun innerhalb des PAT fest gesichert.
- Clip die linke Ohrmuschel des Herzens, damit Perfusate das System verlassen kann.
- Sichere SNP-haltige Spritze (Einheit 1 oder Einheit 2, größenabhängig) in der Spritzenpumpe und durchdringen Die Lösung mit einer Rate von 0,05 ml/min, um das Blut zu spülen und die Vaskulatur maximal zu erweitern. Blut/Perfusate wird über die abgeschnittene Aurikel verlassen. Setzen Sie die Perfusion fort, bis Perfusate klar verläuft (bei einer erwachsenen Maus 200 ,L, weniger für jüngere Tiere).
HINWEIS: Bei der Durchlässigkeit der niedrigen Viskosität PBS/SNP wurde eine relativ höhere Infusionsrate verwendet, um Zeit zu sparen. Die zähflüssigere Polymerverbindung wird langsamer infundiert, um Überfüllung, Bruch und maximierte Kontrolle über distale Endpunkte zu verhindern.
4. Tracheostomie und Lungeninflation
- Konstruieren Sie die Lungeninflationseinheit (Abbildung 2).
- Verbinden Sie einen flexiblen 24 G intravenösen (IV) Katheter (Nadel entfernt)/Schmetterlingsinfusion mit einem Stopphahn, der an einer offenen 50 ml Spritze (kein Kolben) befestigt ist. Hängen Sie die Spritze von einem Ringständer.
- Fügen Sie 10% gepuffertes Formalin in die Spritze. Öffnen Sie den Hahn, so dass Formalin in den Schlauch eindringen und die gesamte Luft aus dem System reinigen kann. Schließen Sie den Hahn und heben Sie die Spritze an, bis der Meniskus 20 cm über der Luftröhre8liegt.
VORSICHT: Formalin ist entzündlich, krebserregend, bei der Verunstaltung akut toxisch und verursacht Hautreizungen, schwere Augenschäden, Sensibilisierung der Haut und Mutagenität der Keimzellen. Vermeiden Sie Einnahme und Kontakt mit Haut und Augen. Vermeiden Sie das Einatmen des Dampfes oder Nebels. Von Zündquellen fernhalten. Tragen Sie eine geeignete persönliche Schutzausrüstung.
- Legen Sie zwei lose Nähte unter dem Cricoid Knorpel 2-4 mm auseinander.
- Mit der Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt in der Cricothyroid Band überlegen, die Nähte.
- Setzen Sie den IV-Katheter in die Öffnung ein und bringen Sie die Spitze über die beiden lockeren Nähte hinaus.
- Ziehen Sie die Nähte um die Luftröhre und öffnen Sie den Hahn. Lassen Sie das Formalin durch Schwerkraft in die Lunge eindringen und warten Sie 5 min, bis sich die Lunge vollständig aufbläht. Wenn die Lunge während der Inflation am Brustkorb haftet, greifen Sie die Außenseite des Brustkorbs mit stumpf gekippten Zangen und bewegen Sie sich in alle Richtungen, um bei der Befreiung der Lappen zu helfen. Nehmen Sie keinen direkten Kontakt mit der Lunge auf.
- Nach 5 min, zurück der IV Katheter über die erste Naht und Ligate. Wiederholen Sie dies für die zweite Naht. Die Lunge ist nun in einem geschlossenen, unter Druck stehenden Zustand aufgeblasen.
5. Gießen der Vaskulatur
- In einem 1,5 ml Rohr 1 ml einer 8:1:1-Lösung8 polymer:verdünnt:härtungsmittel vorbereiten und mehrmals sanft invertieren, um eine gute Mischung zu gewährleisten.
- Entfernen Sie den Kolben von einer 1-c-Ccs-Spritze, bedecken Sie das gegenüberliegende Ende mit einem gehandicapten Finger und gießen Sie die Polymerverbindung in die Spritze. Setzen Sie den Kolben vorsichtig wieder ein, invertieren Sie ihn und bringen Sie den Kolben voran, um die luftige Luft zu entfernen und an der Spitze der Spritze einen Meniskus zu bilden.
- Entfernen Sie die SNP/PBS-Spritze von der Nabe der Nadel und tropfen Sie zusätzliche PBS in die Nabe, um einen Meniskus zu erzeugen. Überprüfen Sie die Drehscheibe sorgfältig auf eingeschlossene Luft, lösen Sie sie bei Bedarf und reformieren Sie den Meniskus. Verbinden Sie die Nabe mit der spritze, die mit der Polymerverbindung gefüllt ist.
HINWEIS: Das Erstellen eines Meniskus an beiden Enden verringert die Wahrscheinlichkeit, dass Luft in das System gelangt. - Befestigen Sie die gefüllte Polymerverbindung an der Spritzenpumpe und infundieren Sie sie bei 0,02 ml/min.
HINWEIS: Bei kleineren Lungen kann eine langsamere Rate hilfreich sein, um eine Überfüllung zu verhindern, ist aber nicht unbedingt erforderlich. - Überwachen Sie die Verbindung, während sie sich frei nach unten bewegt die PE-Schläuche und notieren Sie das Spritzenvolumen, wenn es in den PAT eintritt. Füllen Sie weiter, bis alle Lappen vollständig bis zur Kapillarebene gefüllt sind und stoppen Sie die Spritzenpumpe. Überprüfen Sie das Spritzenvolumen erneut.
HINWEIS: Nach mehreren Durchläufen kann ein geschätztes Volumen verwendet werden, um einen ungefähren Endpunkt zu messen (35 L für eine erwachsene Maus und 5 L für einen P1-Welpen). Nach dem Anhalten der Pumpe wird der Restdruck im System die Polymerverbindung weiterhin in die Lungenarterien schieben. Alle Lungenlappen sollten mit einer ähnlichen Rate füllen. - Bedecken Sie die Lunge mit einem Glasfaser-Reinigungstuch, wenden Sie PBS freimütig an und lassen Sie den Kadaver 30-40 min bei Raumtemperatur ungestört sitzen. Während dieser Zeit wird die Polymerverbindung aushärten und aushärten.
- Entfernen Sie den Katheter, trennen Sie die Arme/untere Hälfte der Maus, und legen Sie den Kopf/Thorax in eine 50 ml konische gefüllt mit 10% gepufferten Formalin über Nacht gefüllt.
- Nach der Fixierung die Luftröhre greifen und die Herz-Lungen-Einheit sanft vom restlichen Rippenkäfig und Thorax trennen. Legen Sie den Herz-Lungen-Block in eine formal in gefüllte Szintillationsflasche. Verwerfen Sie den Rest.
6. Alternative Gefäßbetten zum Gießen (Tabelle 1)
HINWEIS: Jedes Zielgefäßbett kann unterschiedliche Katheterplatzierungen, Infusionsraten und optimale Füllzeiten erfordern. Daher werden mehrere Tiere notwendig sein, um mehrere Organe zu werfen.
- Befolgen Sie bei systemischen Gefäßbetten, die der Membran überlegen oder unterlegen sind, die Schritte 1.1-2.5 wie oben. Weitere Hinweise zum Portalsystem und zur Membran (Tabelle 1).
- Greifen Sie den xiphoiden Prozess mit einem Hämostat und schneiden Sie den Brustkorb bilateral (etwa in der midaxillären Linie) kurz vor den inneren Brustarterien.
- Falten Sie den noch verbundenen Brustkorb so, dass er auf dem Hals/Kopf des Tieres ruht und die Brusthöhle vollständig freilegt.
- Folgen Sie Schritt 3.1 oben, und entfernen Sie dann die Lunge. Sobald die Thoraxaorta (TA) sichtbar ist, haken Sie die Spitzen der gekrümmten Zangen darunter, 10 mm höher als die Membran. Greifen Sie eine 3 cm Lange von 7-0 Seide, ziehen Sie zurück durch die Öffnung unter der TA, und erstellen Sie eine einzelne Wurf lose Naht. Wiederholen Sie diesen Vorgang um 8 mm über der Membran.
- Verwenden Sie für Strukturen, die der Membran überlegen sind, eine Federschere, um ein kleines Loch (30 % des Gesamtumfangs) auf dem ventralen Teil der TA zu erzeugen, 2 mm niedriger als die losen Nähte, die in Schritt 6.4 platziert sind.
- Für Strukturen, die der Membran unterlegen sind, erstellen Sie stattdessen ein kleines Loch von 2 mm, das den losen Nähten überlegen ist.
- Je nach Tiergröße Einheit 1 oder 2 in das Gefäß einführen, über lose Nähte hinausgehen und das Gefäß sanft auflegen.
- Folgen Sie Schritt 3.7, stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine Rate von 1,0 ml/min ein und durchdringen Sie mindestens 5 ml. Perfusate wird über das IVC verlassen.
- Befolgen Sie die Schritte 5.1 - 5.4, um die Infusionsrate auf 0,05 ml/min anzupassen und das Zielgewebe in Echtzeit visuell zu überwachen.
HINWEIS: Das Infusionsvolumen wird organ- und tieraltersspezifisch sein. Das Volumen kann weiter begrenzt werden, indem arterielle Zweige, die zu nicht zielorientierten Gefäßbetten (d. h. Gehirn, Leber, Niere, Darm) führen. - Folgen Sie 5.6 dann entfernen Zielgewebe und platzen in formalin.
7. Probenmontage, Scan und Rekonstruktion für Micro-CT
- Erstellen Sie mit Paraffinfolie eine flache Oberfläche auf dem Scanbett und zentrieren Sie die nasse Probe auf dieser Oberfläche (Abbildung 3A).
HINWEIS: Wenn Bewegungsartefakt erkannt wird, kann die Probe eine weitere Stabilisierung erfordern. - Leicht Zelt-/Abdeckungsprobe mit zusätzlicher Paraffinfolie zur Vermeidung von Austrocknung. Achten Sie besonders darauf, den Paraffinfilm nicht auf der Probe zu ruhen, was zu einer Verformung des Gewebes führt (Abbildung 3B).
- Scannen Sie das Beispiel anhand der in Tabelle 2 beschriebenen Einstellungen, und standardisieren Sie diese Parameter innerhalb eines bestimmten Experiments.
HINWEIS: Dies ist experiment/endpunktabhängig. Standardisieren Sie die ausgewählten Parameter für die einfache Vergleich zwischen Stichproben. - Übertragen Sie die rekonstruierten Scans für die Nachbearbeitung und Analyse.
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Representative Results
Eine erfolgreiche Besetzung wird eine gleichmäßige Befüllung des gesamten Lungenarteriennetzes aufweisen. Wir zeigen dies in C57Bl/6J-Mäusen im Alter: Postnataler Tag P90 (Abbildung 4A), P30 (Abbildung 4B), P7 (Abbildung 4C) und P1 (Abbildung 4D). Durch die Steuerung der Durchflussrate und die visuelle Überwachung der Füllung in Echtzeit wurden zuverlässige Endpunkte der distalsten Vaskulatur erreicht (Abbildung 5A).
Häufige Herausforderungen sind Schäden an der Lunge, unvollständige Füllung, Unterfüllung oder Überfüllung, Verweigung des Katheters und Tiergröße.
Wenn die Lunge/Atemwege beschädigt werden, verhindern kleine Lecks, dass die Lunge Druck hält (Abbildung 5B,C). In Ermangelung einer vollständigen Inflation wird es schwierig, genaue quantitative und räumliche Vergleiche über Stichproben hinweg vorzunehmen. Um das Risiko für das Lungenparenchym zu minimieren, vermeiden Sie es, beim Entfernen des Brustkorbs zu nah an der Lunge zu schneiden und halten Sie die Lunge während des gesamten Verfahrens mit PBS feucht, um Austrocknung und Haftung an umgebenden Strukturen zu vermeiden. Wenn ein Lappen während der Inflation am Rippenkäfig haftet, greifen Sie vorsichtig die Außenseite des Brustkorbs (weg von der Lunge) mit Zangen und bewegen Sie ihn in eine Richtung, um die Lappen zu befreien. Alternativ kann ein stumpfes Instrument, wie z. B. ein Spachtel, mit einer glatten Kante verwendet werden, um die aufgeblasene Lunge vom Brustkorb wegzuheben oder zu schieben. Beim Aufblasen der Lunge, halten Sie sich an die vorgeschlagenen Druckparameter und vermeiden Sie eine Überinflation, da dies zu einem Bruch der Atemwege führen kann. Schließlich entfernen Sie die Lunge nicht aus der Brusthöhle, bis die Post-Fixierung abgeschlossen ist. Die Luftröhre, die Lunge und das Herz sollten en bloc aus den restlichen Teilen der Brusthöhle entfernt werden.
Patchy (Abbildung 5D) oder unvollständige (Abbildung 5E) Füllung kann aus einer "Luftschleuse" entstehen, in der Luft in das Gefäßsystem über den Katheter eingebracht wird, was den nachgeschalteten Fluss der Verbindung blockiert. Um die Wahrscheinlichkeit einer Luftschleuse zu minimieren, spülen Sie die Luft vor dem Einsetzen (Schritt 3.4) und während des Spritzenübergangs von SNP/PBS zu Polymerverbindung wachsam von der Katheterspitze. Bleibt die Füllung lückenhaft oder unvollständig, könnte dies ein Hinweis auf eine erhöhte Gefäßresistenz infolge von Fokal-/Langsegmentstenose oder Tortuosität sein. Blutgerinnsel können auch zu unvollständiger Füllung führen und können leicht vermieden werden, indem Sie Heparin vor dem Eingriff verwenden.
Unsachgemäßes Injektionsvolumen führt zu Unterfüllung oder Überfüllung. Unterfüllung tritt auf, wenn zu wenig Verbindung in die Vaskulatur eingeführt wird (Abbildung 5F). Alternativ kann eine überfüllende oder zu viel Polymerverbindung zu schnell entweder arterielle Brüche (Abbildung 5G) oder, häufiger, venösen Transit (Abbildung 5H) verursachen. Beide Probleme können durch den Einsatz einer Spritzenpumpe gelindert werden. Die Ermittler sollten sich sorgfältig an die vorgeschlagenen Tempo- und Volumenbeschränkungen halten oder ihre eigenen Tarife auf der Grundlage ihres spezifischen Modells und ihrer Optimierung festlegen. Die Überwachung der Polymerverbindungperfusion in Echtzeit unter Vergrößerung ist entscheidend, und die Füllung kleiner Arteriolen/Kapillaren sollte als Endpunkt verwendet werden.
Das Zu weit nach unten anrückende Katheter kann dazu führen, dass sich die Spitze in einen Lungenarterienzweig verkeilt und ein Ungleichgewicht im Fluss erzeugt. Infolgedessen füllt sich eine Seite schneller als die andere (Abbildung 5I), was häufig zu einer Überfüllung in einer Lunge und einer Unterfüllung in der anderen führt. Während Katheter-Wedging der wahrscheinlichste Grund in diesem Szenario ist, können "Airlock" und mangels Heparin auch Faktoren beitragen.
Schließlich präsentieren kleinere Tiere ihre eigenen zusätzlichen Hindernisse. Jüngere Tiere verlangen stetige Hände und kleine Fehler sind weniger verzeihend. Hochwertige Instrumente, die speziell für die Mikrochirurgie entwickelt wurden, werden zu frühen postnatalen Zeitpunkten immer wichtiger. Die Verwendung eines Mikromanipulators hilft dabei, nicht nur eine Katheterversetzung zu verhindern. Es ist auch wichtig, die Spritzenpumpe an Kleintieren zu nutzen, um Endpunkte genau zu kontrollieren und zu verwalten.
Während speziell für die Lungenvaskulatur gezeigt, kann dieses Verfahren leicht auch auf systemische Zielgefäßbetten angewendet werden (Tabelle 1). Zusätzlich zu den oben aufgeführten Herausforderungen ist die Wahl des richtigen Einstiegspunkts von entscheidender Bedeutung. Das Gießen über die Thoraxaorta liefert hervorragende Ergebnisse für die meisten Gefäßbetten. Es sollte jedoch beachtet werden, dass das Einsetzen des Katheters als proximal an die Zielstelle wie möglich und das Ligandern der Nichtzielvaskulatur bei der Durchfluss- und Volumensteuerung hilft. Diese Verfeinerungen in Kombination mit einer angemessenen direkten Überwachung der distalen vaskulären Endpunkte (Abbildung 6A-F) und Standardinfusionsraten optimieren die Füllung. Viele Beispiele solcher Gießmethoden existieren in der Literatur und sind zu zahlreich für eine vollständige Referenzierung. Weitere Details können jedoch in organspezifischen Texten wie diesen4,5,7,18,19,20,21gefunden werden.
Nach dem Gießen können Proben für das Scannen von CT verarbeitet werden (Abbildung 7A,B). Für die Nachbearbeitung erzeugte ein kommerzielles Softwarepaket (siehe Tabelle der Materialien) eine 3D-Volumenwiedergabe des Lungengefäßbaums, der als Standbilder ( Abbildung7C) oder Filme dargestellt wurde. Weitere statistische Analysen, die vaskuläre Eigenschaften wie Segmentlänge und -anzahl, Tortuosität, Reihenfolge (Generation oder Rang), Volumen und Arcade-Länge untersuchen, können ebenfalls durchgeführt werden. Zusätzlich zum Scannen von CT können die gegossenen Proben auch gelöscht werden, um Bruttobilder zu erhalten, oder für die histologischeAnalyse8 verarbeitet und geschnitten werden.
Abbildung 1:Katheter- und Nadelaufbau. Spritzen werden mit angeschlossenen Schläuchen und Nadeln (Unit1 und Unit2) gezeigt. Einset: Nahaufnahme von Nadel und Schläuchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2:Einrichtung der Lungeninflation. Ringständer, Klemme, eine mit Formalin gefüllte Spritze und Schläuche mit angeschlossenem Katheter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Mikro-CT-Probenvorbereitung Vorscan. (A) Hier wurde die Probe auf einer Paraffin-Filmbasis zentriert, (B) Hier wurde die Probe zentriert und auf der Parafilmbasis abgedeckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Vaskuläre Lungen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien von 3 Monaten bis 1 Tag alt. Dorsale Ansicht der Lunge, (A) P90, (B) P30, (C) P7 und (D) P1 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Beispiele für ideale Füllung und häufige Fehler bei der Polymerverbindungsinfusion. (A) Beim Erreichen des Füllendpunkts wurde ein robustes und feines Gefäßnetz beobachtet. (B) Vollständig aufgeblasene formalin perfundierte Lunge wird durch eine weiße gestrichelte Linie dargestellt, (C) Unter-/deflationierte Lunge werden angezeigt. Dies wurde aufgrund einer beeinträchtigten Lungenatemwege beobachtet. Die ursprüngliche aufgeblasene Position wird durch eine weiße gestrichelte Linie dargestellt und die deflationierte Position wird durch eine schwarze gepunktete Linie dargestellt, (D) Patchy Füllung: die Vaskulatur von Teilen des Lappens bleibt ungefüllt, während andere Bereiche vollständig gefüllt wurden, (E) Unvollständige Füllung: Die Polymerverbindung konnte nicht ganze Abschnitte der Lunge durchdringen, (F) Unterfüllung: die Polymerverbindung konnte distale Vaskulatur nicht füllen, (G) Ruptur: der Pfeil zeigt auf die Polymerverbindung, die aus der Vaskulatur extrudiert wird, (H) Venöse Füllung: beachten Sie den Pfeil, der auf die arteriellen Segmente zeigt, die vollständig gefüllt sind und sich in das Venensystem ausdehnen. Venen und Venen waren von deutlich größerem Kaliber, (I) Katheterkeil: Hier wurde der Katheter in eine Arterie geschoben, die verhinderte, dass sich die Vaskulatur der rechten Lappen vollständig füllte, während der linke Lappen überfüllt war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6. Gefäßguss und Endpunkte in zusätzlichen Organen. (A) Niere: das punktuelle Auftreten der Polymerverbindung im Glomerulus lieferte den Endpunkt. (B) Leber: Beachten Sie die kleinen Gefäße, die an den Rändern des Organs sichtbar sind. (C) Magen: kleine Gefäße waren sichtbar und vollständig gefüllt. (D) Dickdarm: Kleine Gefäße sind leicht identifizierbar und gefüllt. (E) Zwerchfell: Der Muskel ist hier dünn und durchscheinend mit kleinen gefüllten Gefäßen sichtbar. (F). Gehirn: kleine Gefäße waren im Kortex sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7. CT-Bilder und 3D-Volumen-Rendering von Polymer-Verbindung gefüllten Lungen. (A) Eine einzelne grau skalierte rekonstruierte Lungenscheibe(B) Dies war eine maximale Intensitätsprojektion eines CT-Scans, der aus polymer gefüllten Lungen hergestellt wurde, (C) Eine 3D-Volumenwiedergabe der Gefäßarkade wurde mit kommerziell verfügbarer Software erzeugt (siehe Tabelle der Materialien). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Ziel arterielles Gefäßbett | Katheterplatzierung | Infusionsrichtung | Infusionsrate | Notizen |
| Gehirn | Thorax-Aorta zeigt kranially | Retrograde in die Carotis | .05ml/min | Kanülatthorakta, Flip-Maus in die anfällige Position, offene Kopfhaut und visuell überwachen Fortschritt des Polymers durch Schädel. |
| Membran | Left Ventrical | Anterograde in innere thorakale, phrenische und interkostale | .05ml/min | Öffnen Sie ein Fenster in der Seite des Brustkorbs, so dass der Großteil des Brustkorbs und des Zwerchfells intakt bleibt. Kantülieren Sie das linke ventrische, cliprechte Atrium, und überwachen Sie den Fortschritt von der kaudalen Seite des Zwerchfells. |
| Muskulatur der oberen Gliedmaßen | Thorax-Aorta zeigt kranially | Retrograde in die brachiocephale und linke Subklave | .02ml/min | Um den Gliedmaßenfluss zu optimieren, binden Sie die Karotisarterien ab und entfernen Sie die Gliedmaßenhaut, um eine visuelle Überwachung des Polymertransits in die Gliedmaßenmuskulatur zu ermöglichen. |
| Niere | Thorax-Aorta zeigt kaudisch | Anterograde in Nierenarterien | .05ml/min | Die innere Vaskulatur ist blind gefüllt. Um venösen Transit zu vermeiden, beenden Sie die Injektion, wenn Polymer in einem einheitlichen Punktionsmuster über die Niere sichtbar ist. |
| Portalsystem | Portalvene | Anterograde in Portalsystem | .02ml/min | Falten Sie die Leber vorsichtig nach oben, um die Portalvene freizulegen. |
| Leber | Thorax-Aorta zeigt kaudisch | Anterograde in die Hepatische Arterie | .05ml/min | Binden Sie Portal Vene vor der Infusion, um venösen Transit aus Demdarm in die Leber fließen zu vermeiden. |
| Magen/Darm | Thorax-Aorta zeigt kaudisch | Anterograde in den Zöliakie, überlegene mesenterische und/oder minderwertige mesenteric | .05ml/min | Einige Bereiche des Darms werden durch mehrere Arterien versorgt und können zu verschiedenen Zeiten füllen. Um venösen Transit zu vermeiden, binden Sie Arterien ab, die für Bereiche von Interesse nicht erforderlich sind, und überwachen Sie visuell den Fortschritt des Polymers. |
| Intraabdominale Fettpolster | Thorax-Aorta zeigt kaudisch | Anterograde, aber Gefäß hängt davon ab, Fettpad untersucht wird | .05ml/min | Fettpolster werden von mehreren Arterien geliefert und können zu unterschiedlichen Zeiten gefüllt werden. Um venösen Transit zu vermeiden, binden Sie Arterien ab, die für einen genauen Interessenbereich nicht erforderlich sind, und überwachen Sie den Fortschritt des Polymers visuell. |
| Untere Gliedmaßenmuskulatur | Infrarot-Aorta zeigt kaudal | Anterograde in die Femoralarterien | .02ml/min | Entfernen Sie die Gliedmaßenhaut, um eine visuelle Überwachung des Polymertransits in die Gliedmaßenmuskulatur zu ermöglichen. |
Tabelle 1. Gießen alternativer Gefäßbetten.
| CT-Einstellungen | |
| kVp | 90 |
| Zielmaterial | Wolfram |
| Macht | 8w |
| Filtration | Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm |
| Projektionszahl | 6424 |
| Detektorgröße | Flachbildschirm CMOS - 2944 x 2352 Pixel |
| Sichtfeld (FOV) | 36 mm |
| Voxel Größe | 72 m |
| Räumliche Auflösung | voxel Größe x 1.5 |
| Akquisitionszeit | 14 Min. |
| Wiederaufbau | FBP und kommerzieller Algorithmus |
| Binning | 1x1 |
Tabelle 2. CT-Scanparameter.
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Discussion
Diese Methode, die richtig ausgeführt wird, liefert eindrucksvolle Bilder von pulmonalen arteriellen Netzwerken, die Vergleich und Experimente in Nagetiermodellen ermöglichen. Mehrere kritische Schritte auf dem Weg sorgen für den Erfolg. Zunächst müssen die Ermittler das Tier in der Vorbereitungsphase heparinisieren, um zu verhindern, dass sich Blutgerinnsel in der Lungenvaskulatur und den Kammern des Herzens bilden. Dies ermöglicht den vollständigen arteriellen Transit von Polymerverbindungen. Zweitens, wenn Sie das Zwerchfell punktieren und den Brustkorb entfernen, achten Sie darauf, die Lunge vor unbeabsichtigten Schäden, Schnitten oder Verletzungen zu schützen. Jedes Leck in der Atemwege verhindert eine vollständige Inflation und macht Vergleiche zwischen Proben ungenau. Drittens, das Herz an die Spitze zu kleben hilft Katheter Platzierung. Viertens wird die Verwendung eines starken Vasodilatators wie SNP sowohl bei der Entfernung von Blut als auch bei der vollständigen Füllung von Arteriolen und Kapillaren5,8helfen. Fünftens, wenn Sie den Katheter in den PAT legen, achten Sie darauf, die Spitze nicht in die Bifurkation zu vergraben. Dies führt zu einem Ungleichgewicht im Durchfluss, das Polymerverbindung auf die linke oder rechte Seite schiebt, was zu einem ungleichen Druckgradienten führt. Sechstens, die Verwendung einer Spritzenpumpe ermöglicht es dem Benutzer, die Rate zu steuern und titer das Volumen, um sowohl Maus Dehnung und Alter. Lassen Sie schließlich das Herz/die Lunge an der restlichen Brusthöhle befestigt, über Nacht fixieren und am nächsten Tag entfernen. Die Lunge wird gut fixiert und das Deflationspotenzial durch versehentliche Nicks während der Trennung minimiert.
Während diese Methode die gewünschten Ergebnisse erzielt, können alternative Techniken für einige Benutzer hilfreich sein. Zur Unterstützung bei der Platzierung des Katheters kann ein Mikromanipulator eingesetzt werden. Wir haben uns für eine Version mit einem kleinen Profil und magnetischer Basis entschieden, um Eingriffe in einen bereits begrenzten Arbeitsbereich zu minimieren und gleichzeitig eine stabile Basis zu bieten (wenn Sie eine magnetische Basis verwenden, stellen Sie sicher, dass Sie eine Stahlplatte unter den Arbeitsraum legen, damit der Magnet eingreifen kann). Dadurch kann der Anwender die Spitze des Katheters in einem Winkel, der der natürlichen Flugbahn der Arterie folgt, präzise in den PAT stellen. Darüber hinaus ist der Katheter sicher und hat ein geringeres Risiko, sich zu lösen. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung einer trompetenden Katheterspitze8. Ein trompeter Katheter ist zwar nicht trivial zu erstellen, ist aber viel sicherer und weniger geneigt, versehentlich aus dem PAT herauszurutschen. Eine Änderung des Polymerverhältnisses: Verdünnungsmittel verändert die Viskosität und die Leichtigkeit, mit der kleine Gefäße gefüllt werden. Je nach Zielvaskulatur und experimentellen Endpunkten kann dies eine wertvolle Überlegung sein. Euthanasie überCO2 kann bei einem kleinen Prozentsatz der Tiere lungenblutungen verursachen und ist stammabhängig22. Erwägen Sie ein alternatives Euthanasieprotokoll, falls sich dies auf experimentelle Endpunkte auswirken sollte. Beim Aufblasen der Lunge hilft die Verwendung von Formalin zur Fixierung des Organs an Ort und Stelle am gegebenen Druck. Ein physiologisch neutraler Puffer kann ersetzt werden, wenn periphere Gefäße in einem unfixierten Zustand gefüllt werden müssen. Wenn Infusionsrate und Kontrolle für ein bestimmtes Experiment von geringerer Bedeutung sind, ist auch eine Durchblutung von Hand möglich. Handinjektion erfordert Praxis und Echtzeit-Überwachung unter Vergrößerung, um Überfüllung oder Gefäßbruch zu vermeiden8. Schließlich sollten die Gewebehalterung/-bedingungen, scannparameter und die minimale Nachbearbeitung, die wir für dieses Papier eingesetzt haben, lediglich als Ausgangspunkt dienen. Verschiedene Scanner, Gewebe, experimentelle Endpunkte/Benutzeranforderungen können alternative Parameter erfordern.
Während die vaskulären Bilder, die aus dieser Technik erzeugt werden, beeindruckend sind, gibt es Einschränkungen. In erster Linie ist die obige Methode suboptimal für die Messung von Gefäßkaliber aufgrund der Unfähigkeit, den intravaskulären Druck während der Infusion zu überwachen und zu kontrollieren. Andere Gruppen haben es geschafft, diese Druckbedenken in der systemischen Vaskulatur durch die Überwachung des Antriebsdrucks4,23etwas anzugehen, aber solche Bedenken werden auf der Lungenseite aufgrund der relativ dünnen Lungenarterienwände, die mit kleinen Druckänderungenleicht distensierbar sind, und der Unfähigkeit, den pulmonalen intravavaskulären Druck präzise zu messen und statisch zu steuern, weiter verstärkt.
Eine zweite Einschränkung dieser Methode ist, dass es ein postmortem, einzelnes Zeitpunktexperiment bleibt, das seinen Nutzen in Studien begrenzt, die wirklich physiologische Bedingungen oder einen Zeitverlauf erfordern. Andere, lebende Tiermaßnahmen, wie ct-Pulmonalangiographie (CTPA) oder kontrastverstärktes CT (CE-CT) bieten die Möglichkeit funktioneller und morphologischer Maßnahmen. Wiederholte Scans/Längsstudien sowie Messungen an verschiedenen Punkten des Herz-Lungen-Zyklus können10,25,26,27,28untersucht werden. Diese Methoden können neben der Echokardiographie zuverlässig eingesetzt werden, um das arterielle Kaliber zu messen. Allerdings beschränken sich sowohl CTPA- als auch Echokardiographie-Maßnahmen derzeit auf die Beurteilung der proximalen Vaskulatur. Bei Echokardiogrammen ist die Beurteilung auf den Lungenstamm beschränkt, während CTPA eine adäquate Berechnung des Ast-Lungenarterienkalibers potenziell 1-2 Orders weiter ermöglicht, aber die Auflösung ist begrenzt, wobei distale Teile der Vaskulatur7verdunkelt werden. Strahlung Dosierung ist auch ein Anliegen, das sorgfältig überwacht werden sollte, wenn CT vor allem in Multi-Scan-Längsstudien29,30. Für eine dieser Anwendungen können CT-Geräte, Scanzeit und Analysesoftware teuer sein und erfordern eine Schulung des Fachpersonals. Tierbild-Kerneinrichtungen an einigen Institutionen können diese Belastung verringern.
Als Alternative zu dieser Verbindung, einige Gruppen verwenden traditionelle Korrosionsguss-Techniken begleitet von Weichgewebe Entfernung31,32. Diese Methoden liefern ähnliche Ergebnisse wie diese Polymerverbindung, aber das Endprodukt ist spröde, was zu einem potenziellen Artefakt15führt. Darüber hinaus eliminiert die Entfernung von Weichgewebe das Potenzial für zukünftige Histologie33. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das Weichgewebe intakt zu lassen und einen Folgeschritt durchzuführen, bei dem das Weichgewebe "gerodet" wird, wodurch die Probe praktisch transparent34,35wird. Das Gewebelöschen gibt dem Benutzer eine gewisse Möglichkeit, tiefer in einer Stichprobe zu sehen, bleibt aber im Großen und Ganzen unter dem CT, da es nicht die gleiche 3D-Visualisierung bieten kann. Serielle histologische Schnitte und Arraytomographie sind Methoden, die eine außergewöhnlich hohe Auflösung bieten. Während diese Technik die Tür zu spannenden neuen Möglichkeiten öffnet, ist die Arbeitsbelastung exponentiell höher und nicht besonders förderlich für große Kohorten11,12. 3D-Röntgenhistologie ist ein zerstörungsfreier Ansatz, der sowohl die CT- als auch die traditionelle Histologie oder sogar EM36,37,38verbindet. Es nimmt eine übergeordnete Sicht der Pathologie, indem es die "CT" nutzt, um Regionen von Interesse global zu identifizieren und genau auszukundschaften, die dann mit routinemäßiger Histologie39weiterverfolgt werden. Das Ersetzen von Kontrastmitteln mit niedrigerer Auflösung (oder in einigen Fällen kein Kontrast) durch Polymerverbindung in die Vaskulatur könnte dazu dienen, beide Techniken nach Möglichkeit zu erhöhen. Ein weiterer zerstörungsfreier Ansatz, der rechnerisch intensiv ist und den Kontrast potenziell erhöht, ist die Phase-Retrieval-CT-Bildgebung40,41. Diese Methode kann nützlich sein, wenn sie bei lauten Daten verwendet wird, bei denen der Kontrast schwach oder nicht möglich ist42. Die bei dieser Technik verwendete Polymerverbindung leidet jedoch nicht unter dieser Einschränkung. Das heißt, Phase-Retrieval kann nützlich sein, wenn die Polymerverbindung möglicherweise verdünnt wird, zum Beispiel in distaler Vaskulatur43. Schließlich ist die Stereologie seit Jahren ein Standard in der quantitativen Strukturanalyse der Lunge44. Es verwendet zufällige, systematische Stichproben an Gewebequerschnitten, um 3D-Schlussfolgerungen zu ziehen, in der Annahme, dass die ausgewählten Proben ausreichend repräsentativ sind. Obwohl es ein leistungsfähiges Werkzeug ist, hat es das Potenzial, zu Fehlern und Voreingenommenheit zu führen. Die Kombination von CT-Bildgebung mit Stereologie ist jedoch vielversprechend45.
Die skizzierte Methode ist relativ einfach und mit der Ausbildung ist eine Erfolgsquote von >90% erreichbar. Einmal gemeistert, ermöglicht es das vollständige und zuverlässige Gießen der Lungenvaskulatur. In fixativen, Gewebe und Polymer bleiben auf unbestimmte Zeit für zukünftige Scans, potenzielle Histologie, oder EM46,47. Wir haben gezeigt, dass diese Technik bei Tieren so jung wie P1 bis zum Erwachsenenalter verwendet werden kann und glauben, dass embryonales Gießen über die Lungenarterie in Reichweite ist. Es sollte beachtet werden, dass diese Technik auf praktisch jedes andere Gefäßbett angewendet werden kann, indem einfach der Katheter-Einstiegspunkt verändert und geeignete Endpunkte bestimmt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten
Acknowledgments
Diese Forschung wurde teilweise durch das NHLBI Intramural Research Program (DIR HL-006247) unterstützt. Wir danken der NIH Mouse Imaging Facility für die Anleitung bei der Bildaufnahme und -analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
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