Summary
현장이나 실험실에서 분석할 수 있는 루프 매개 이더스말 증폭(LAMP) 분석과 결합된 필터 종이 DNA 추출 방법을 사용하여 수원에서 피토프토라 캡시 동물원을 검출하는 방법을 개발했습니다.
Abstract
Phytophthora capsici는 매년 야채 생산에 상당한 경제적 손실을 일으키는 많은 중요 한 솔 라 와 cucurbit 작물에 영향을 미치는 파괴적인 oomycete 병원 체 병원 체. 식물성 캡시치는 풍화와 저하에 저항하는 오랜 생존 구조 (oospores 및 클라미도스포레스)로 인해 토양 매개 및 식물 분야에서 지속적인 문제입니다. 분산의 주요 방법은 표면이나 물로 채워진 토양 모공에서 존재하는 얇은 필름을 통해 수영할 수 있고 웅덩이와 연못에 축적 될 수있는 단일 세포, 기화 포자의 생산을 통해입니다. 따라서 관개 연못은 병원체및 질병 발생의 초기 지점의 원천이 될 수 있다. 피티움 스PP와 같은 환경에 존재하는 다른 미생물이 일반적으로 P. capsici를 과도하게 성장시켜 검출할 수 없기 때문에 관개 물에서 P. capsici를 검출하는 것은 전통적인 배양 기반 방법을 사용하기 어렵다. P의 존재를 결정합니다. 수원(관개물, 유출 등)의 캡시 포자는 병원체 의 포자(zoospores)를 포착하는 핸드 펌프 기반 필터 용지(8-10 μm) 방법을 개발했으며, 나중에 는 새로운 루프 매개 액티어를 통해 병원체의 DNA를 증폭시키는 데 사용됩니다. P. capsici. 이 방법은 기존 PCR보다 40배 더 민감한 1.2 x 102 동물원/mL농도로부터 DNA를 증폭하고 검출할 수 있다. 밀접하게 관련된 종을 테스트 할 때 교차 증폭을 얻을 수 없습니다. LAMP는 또한 착색 램프 마스터 믹스 염료를 사용하여 수행되었으며, 현장의 빠른 감지를 위해 육안으로 읽을 수 있는 결과를 표시했습니다. 이 프로토콜은 오염된 관개 시스템을 통해 거주하거나 축적되거나 분산되는 다른 병원균에 적응할 수 있습니다.
Introduction
물 비용의 증가와 물 사용 의 환경 문제로 인해 농장과 보육원의 재활용 물이 점점 더 인기를 끌고 있습니다. 식물 질환의 확산과 발생을 줄이기 위해 재배자를 위해 많은 관개 방법이 개발되었습니다. 물의 근원(관개 또는 강수량)에 관계없이 유출이 발생하고, 많은 채소와 보육 재배자가유출1을수집하고 재활용할 수 있는 연못이 있다. 이는 재활용물이 작물2,3,34를관개하는 데 사용될 때 병원균의 확산을 선호하는 병원균 축적 가능성을 위한저수지를만든다. Oomycete 식물 병원체는 특히 동물원포어가 물에 축적되고 1 차 분산 포자는 자기 motile하지만 표면 물5,,6,,7이필요하기 때문에이 관행에서 특히 이점을 누릴 수 있습니다. Phytophthora capsici는 다른 방법으로 solanaceous cucurbit 작물의 상당수에 영향을 미치는 oomycete 병원체8. 종종 증상은 모종, 뿌리 및 크라운 부패의 감쇠입니다. 그러나 오이, 스쿼시, 멜론, 호박, 수박, 가지 및 후추와 같은 작물에서는 과일 부패9로인해 전체 수확량이 손실될 수 있습니다. 이 식물 병원균을 검출하는 알려진 방법이 있지만, 대부분은 이미 어떤 예방 살균제에 대한 너무 늦은 일이 발생 감염을 필요로10.
표적 미생물의 검출 및 진단을 위해 관개수를 테스트하는 전통적인 방법은 속도와 감도가 성공과 수익성 있는 작물생산(11,,12)에결정적인 시기에 구식 접근법이다. 표적 병원체(예를 들어, P. capsici용가지)에 취약한 식물 조직은 감염을 제거하고 검사하기 전에 장시간 관개 연못에 매달린 수정된 트랩에 부착된다. 식물 조직으로부터의 샘플은 반선택적 미디어(PARPH)에 도금되고 배양 성장을 위해 배양한 다음, 복합현미경(13)을이용하여 형태학적 식별이 수행된다. 선택적 매체를 이용하여 소량의 오염된 물을 소량도금하여14,,15를하위 배양하기 전에 다른 식물 병원균에 대한 다른 유사한 검출 방법이 있다. 이러한 방법은 유기체를 분리하기 위해 2 주에서 6 주, 여러 차례의 하위 배양이 필요하며, 각 종의 주요 형태학적 문자를 인식할 수 있도록 Phytophthora 진단에 대한 경험이 필요합니다. 이러한 전통적인 방법은 수원에 존재하는 다른 미생물에 의한 간섭과 같은 요인으로 인해 P. capsici에 의해 오염된 관개 수를 검출하는 데 잘 작동하지 않습니다. 파이티움 스프와 수인성 박테리아와 같은 일부 빠르게 성장하는 미생물은 접시에 과도하게 자랄 수 있어 P. capsici를 탐지할 수 없는16,,17.
이 연구의 목적은 관개 물에서 P. capsici 동물원포자를 검출하기 위해 현장 및 실험실 설정 모두에서 사용할 수있는 민감하고 구체적인 분자 방법을 개발하는 것이었습니다. 이 프로토콜은 P. capsici,18,19의1121베이스 쌍(bp) 단편을 기반으로 P. capsici를구체적으로 증폭시킬 수 있는 새로운 루프 매개 이스테어 증폭(LAMP) 프라이머 세트의 개발을 포함한다. 동외에서 이전에 개발된 LAMP 프라이머(2015)는 이 연구를 위해 개발된분석서(20)에비해 사용되었다.
LAMP 분석체는 종래의 중합효소 연쇄반응(PCR)(21)보다더 빠르고 민감하며 특이적임을 입증된 비교적 새로운 형태의 분자 검출이다. 일반적으로, 기존의 PCR 어설션은 500부(1.25 pg/μL) 미만을 감지할 수 없다. 대조적으로, 이전 연구는 LAMP의 감도가 종래의 PCR보다 10 ~ 1,000 배 높을 수 있으며 게놈 DNA22,,23의1 fg /μL조차도 쉽게 감지 할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, 분석체는 증폭을 위한 휴대용 가열 블록을 사용하여 현장에서(종종 30분) 및 현장(현장에서) 신속하게 수행될 수 있으며, 양성 시료에 대한 색을 변화시키는 색염염(전기포혈의 필요성 제거). 이 연구에서는 필터 추출 방법을 사용하여 PCR 및 LAMP 분석의 감도를 비교했습니다. 제안된 검출 방법을 통해 연구자와 확장 에이전트는 2시간 이내에 다른 수원에서 P. capsici 포자의 존재를 쉽게 감지할 수 있습니다. 분석은 종래의 PCR보다 더 민감하다는 것이 입증되었으며 재배자가 사용하는 관개물에서 병원균의 존재를 검출함으로써 시상에서 검증되었다. 이 검출 방법은 재배자가 관개에 사용되는 다양한 수원에서 병원균의 존재와 인구 밀도를 추정할 수 있게 하여 파괴적인 발병과 경제적 손실을 방지할 수 있습니다.
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Protocol
1. 휴대용 루프 매개 이더피 증폭을 사용하여 관개물에서 피토프토라 캡시의 현장 감지
- 펌프 및 필터 설정
- 펌프가 활성화되면 여과 플라스크의 입을 통해 공기가 당겨지도록 핸드 펌프에 연결된 튜브에 여과 플라스크를 부착합니다.
- Buchner 깔때기를 필터 플라스크의 입에 고무 스토퍼에 넣고 적절하게 크기의 필터 용지를 Buchner 깔때기에 넣어 공기가 필터 용지를 통해 당겨지도록 합니다. 필터 용지의 고정 크기는 15 μm이어야 합니다.
참고: 필터 용지는 Buchner 깔때기의 가장자리에 맞아야 최소한의 물이 필터 용지 주위에 흐르도록 합니다.
- 물 샘플링 및 필터링
- 대상 소스에서 물 샘플을 채취하십시오. 물은 소량의 파편을 가질 수 있지만 상당한 퇴적물이나 토양은 없을 수 있습니다.
- 부흐너 깔때기 내부에 배치된 필터 용지 위에 최대 1,000mL(1리터)의 테스트 워터를 붓고, 핸드 펌프(또는 진공)는 물을 통해 끌어당기는 흡입을 생성하는 데 사용되고 있다.
참고: 이 방법을 사용하여 테스트할 수 있는 최소 물량은 없으며, 최소 50mL가 제안되지만 이 방법의 최대값은 1000mL입니다. - 집게를 사용하여 Buchner 깔때기에서 필터 용지를 제거하고 멸균 가위로 작은 조각으로 자른다. 프로토콜에 필요한 추출 버퍼(자기 비드 기반 추출용 400 μL)의 양에 침수될 수 있는 만큼 의약(8-12)을 1.5mL 튜브로 추가합니다. 첫 번째 세트를 추출한 후 처리를 위해 남은 필터 용지를 저장합니다.
- 소용돌이 또는 그렇지 않으면 5 분 동안 10 분마다 10 초 동안 필터 용지 및 추출 버퍼 조각을 동요. 그런 다음, 집게를 사용하여, 가능한 한 추출 버퍼의 작은 잃고 필터 용지를 제거합니다. 모든 조각이 소용돌이/교반되고 추출 버퍼에 담글 때까지 나머지 필터 용지와 함께 이 단계를 반복합니다.
- 필터 용지에서 DNA의 자기 비드 기반 추출
- 1.5 mL 튜브 (현재 추출 버퍼의 약 200-300 μL을 포함)에, 단백질 제 K의 20 μL과 10 ng / μL RNase의 10 μL을 추가합니다.
- 실온에서 15분 동안 배양하거나, 소용돌이를 치거나, 3분마다 튜브를 흔들어 주세요.
- 500 μL의 마그네틱 비드를 결합 버퍼와 함께 샘플에 넣고 흔들어 잘 섞습니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 모든 구슬이 자석으로 당겨질 때까지 튜브를 자기 분리기 랙에 2분 간 놓습니다. 상체를 제거하고 폐기합니다.
- 자기 분리기에서 튜브를 제거합니다. 워시 버퍼 1의 500 μL을 추가하고 튜브를 적극적으로 흔들어 구슬을 다시 일시 중단합니다. 30s를 기다린 다음 튜브를 자기 분리기에 다시 놓습니다. 모든 구슬이 자석쪽으로 당겨질 때까지 2분 동안 기다렸다가 상퍼를 제거하고 폐기하십시오.
참고: 마그네틱 비즈가 분리기에게 자화되기를 기다리는 경우, 튜브의 모자와 측면에 붙어 있는 자기 구슬을 빼내고 더 많은 수의 구슬이 부착될 수 있는 튜브를 반전시키는 것이 좋습니다. - 워시 버퍼 2의 500 μL로 1.3.5 단계를 반복하십시오.
- 80% 에탄올의 500 μL로 1.3.5단계를 반복합니다.
- 실온(18-27°C)에서 15분 동안 자석 비드 펠릿을 에어드라이로 드시고 뚜껑을 열어 놓습니다. 온도가 허용하지 않는 경우, 15 분 동안 열려 모자와 장갑 손에 인큐베이션.
- 자기 분리기에서 튜브를 제거합니다. 용출 버퍼 50 μL을 추가하고 1 분 동안 위아래로 파이프하여 구슬을 다시 일시 중단합니다.
- 튜브를 다시 자기 분리기에 놓습니다. DNA 저장을 위해 구슬을 별도의 튜브로 옮기지 않고 상퍼를 옮기기 전에 2 분 기다립니다.
참고: 이동하기 전에 실험을 일시 중지할 수 있습니다. 추출된 DNA는 얼음이나 -20°C 냉동고에 저장되어야 합니다.
- 새로 개발 된 램프 분석의 응용 프로그램
- 각 F3 및 B3 프라이머의 0.2 μM, 각 루프-F 및 루프-B 프라이머의 0.8 μM, 각 FIP 및 BIP 프라이머의 1.6 μM(표2)을사용하여 LAMP 프라이머 믹스를 준비합니다.
- 다음 LAMP 용액을 단일 PCR 튜브 또는 8 튜브 스트립의 각 개별 튜브에 추가합니다: 프라이머 믹스의 2.5 μL(단계 1.4.1), LAVA LAMP 마스터 믹스의 12.5 μL, 추출된 DNA 1μL, ddH2O의9 μL. 총 부피는 25 μL입니다.
참고: 컬러메트릭 염료(예: 웜스타트)가 있는 휴대용 증폭 기기(예: 지니 III)를 사용하는 경우 섹션 2.4.2- 2.4.3을 참조하십시오. - 두 개의 튜브를 긍정적이고 부정적인 컨트롤로 지정합니다. 양성 제어를 위해, LAVA LAMP 키트또는 알려진 양성 DNA 샘플에서 제공하는 컨트롤을 사용하십시오. 음수 제어의 경우 ddH2O를 사용합니다. 둘 다, 양성 대조군 또는 ddH2O의 1 μL에 대해 추출된 DNA의 1 μL을 대체한다.
- 샘플을 45분 동안 64°C로 설정된 열 블록(또는 휴대용 증폭 기기)으로 설정합니다.
참고: 다른 추출 방법은 마그네틱 비드 기반 추출 대신 여기에서 사용할 수 있습니다. CTAB 및 상용 DNA 추출 키트는 모두 표준 프로토콜을 사용하여 성공적으로 테스트되었으며 식물 샘플24,,25에대한 필터 용지 조각을 대체하였다. 결과는 표 2에서비교되었습니다. DNA의 농도가 정량화 될 수 있는 경우, 1-10 ng 게놈 DNA 사이 사용.
- 결과 시각화
- 실험실 환경에서 수행되는 경우 각 샘플의 5 μL을 1% 아가로즈 젤로 적재하고 젤 전기 전광 기계에서 실행하고 UV 이미징 기계에서 이미징하여 증폭 제품을 볼 수 있습니다.
- 색염료(예: Warmstart)를 사용한 경우 색상 변화를 확인하여 결과를 양수 또는 음수로 결정합니다.
- 휴대용 증폭 기기(예: 지니 III)를 사용한 경우 화면의 증폭 그래프를 보고 결과를 확인합니다.
- 이전에 개발된 PCR 분석기의 적용
참고: 기존의 PCR 분석서를 사용하는 경우 1-3단계는 동일하게 유지되며 1.4 단계 및 1.5 단계 대신 다음 단계를 적용해야 합니다.- 다음 구성 요소를 포함하는 개별 튜브에 각 DNA 추출의 1 μL을 추가: 녹색 PCR 마스터 믹스의 12.5 μL, ddH2O의 9.5 μL, 그리고 전방 및 역 프라이머의 1 μL(표 2).
- 마이크로센티르슈어를 사용하여 각 샘플을 회전시키고 튜브를 열 사이클러에 넣습니다.
- 이전 간행물에 따라 다음과 같은 열 사이클러 설정을 사용하십시오: 5분 동안 94°C, 30초 동안 94°C에서 30사이클, 54°C에서 30초, 72°C에서 10분 동안 연장, 최종 연장은 10분 동안 72°C로 한다.
- 1% 아가로즈 젤로 제품을 실행합니다. 긍정적 인 반응이 ~ 508 bp의 밴드 크기를 가질 UV 빛 아래 밴드의 존재를 관찰하십시오.
- 기존의 탐지 방법
참고: 병원균 검출을 위한 선택적 도금의 여러 방법이 있으며, 다음은 P. capsici에대한 일반적인 프로토콜이다.- 먼저 건강한 가지 과일(P. capsici의경우 취약한 숙주)을 얻고 과일 표면을 70% 이소프로필 알코올로 세척하여 표면 살균을 얻습니다.
- 부양 장치 (폴리에틸렌 폼 또는 기타)와 우유 상자에 가지 과일을 배치하고 관개 연못에 배포합니다. 각 미끼 트랩을 한 지점으로 고정하고 트랩을 저수지(재활용 관개수)에 적어도 7일 동안 또는 과일 부패 증상이 관찰될 때까지 방치한다. 과일을 수집하고 실험실로 운반하십시오.
- 감염된 조직의 작은 조각을 제거하기 전에 멸균 후드에 과일을 헹구고 건조하고 25 mg / L 펜타 클로로 오니트로 벤젠, 0.0005 % 피마리신, 250 mg / L 암피실린, 10 mg / L+lmex로 개정 PARPH 매체의 접시에 배치합니다. 5 일 동안 25 °C에서 플레이트를 배양하십시오.
- 격리 후 4일 후에 전통적인 형태학적 식별을 위한 복합 현미경으로 플레이트를 볼 수 있습니다.
2. 동물원 포어 농도의 검출 한계 결정
- 동물원 스포어 서스펜션 만들기
- V8 P. capsici 한천(V8 주스 100mL, ddH2O900mL, CaCO31g) 플레이트에 26°C에서 1주일 동안 배양했습니다. 여러 접시를 사용하여 더 많은 양의 동물원 스포어 서스펜션을 얻을 수 있습니다.
- 포자를 자극하기 위해 3 일 동안 실온에서 연속 조명 아래 플레이트를 배양하십시오.
- 각 접시에 ddH2O15 mL을 추가하여 접시를 범람하고 25 분 동안 4 ° C 냉장고에 놓습니다. 그런 다음 30 분 동안 실온으로 돌아갑니다.
- 접시를 교반하여 동물원포지와 파이펫을 모든 플레이트에서 50mL 튜브 한 개에 넣습니다.
- 동물원 의 정확한 추정을 얻으려면, 발면 계에 포자 현탁액의 10 μL을 추가하고 동물원포자를 계산하고 평균 농도를 추정하기 위해 현미경으로 관찰한다.
- 직렬 희석
- 포자 서스펜션 1mL, ddH2O 9mL을 별도의 튜브에 추가합니다. 원하는 만큼 많은 10배 희석을 위해 이 단계를 반복합니다.
- 포자 용액은 여과 방법을 사용하여 이전 프로토콜에 기초하여 DNA 추출을 위해 제출된다.
참고: 더 큰 양의 서스펜션이 원하는 경우, 포자 서스펜션 2mL, ddH2O의 18mL의 볼륨을 두 배로 늘라.
- 동물원 포어 농도 제한 감지
- 명확하게 긍정적 인 결과가 더 이상 관찰되지 때까지 분석법을 통해 각 직렬 희석을 개별적으로 실행하여 포자 검출 제한을 평가합니다. 최종 희석이 얻어지면 2(이 예에서 4.8 ~ 2.4)의 계수로 희석하고 분석법을 다시 실행하여 보다 정확한 검출 한계를 얻습니다.
- LAMP 방법의 개발 및 최적화
참고: LAMP 프라이머는 보충도 2에도시된 바와 같이 P. capsici(Li et al.19)의1121베이스 쌍(bp) 단편을 기반으로 설계되었다.- 착색염염(예를 들어 Warmstart)이 사용되는 경우 프라이머 믹스 2.5 μL, 색염료 12.5 μL, 녹색 형광염의 0.5 μL, 추출된 DNA 1μL, ddH2O의8.5 μL 등의 솔루션을 사용한다. 총 부피는 25 μL입니다.
- LAVALAMP 마스터믹스와 휴대용 증폭 기기를 사용하는 경우, 제조 업체에 의해 권장되는 대로 3 분 동안 95 °C의 초기 단계를 가지고 있지만, 이것은 필요하지 않습니다. 색상 변화 또는 증폭 그래프를 관찰하기 위해 최종 어닐링 단계가 필요하지 않습니다. 상용 색염료를 사용할 경우 웜스타트 단계를 실행하지 마십시오.
- VIEW LAMP 분석결과 다음 방법 중 하나는 1% 아가로즈 젤에서 샘플을 실행하거나 지니 III 실시간 증폭 화면에서 육안으로 자외선 이미징 기계를 사용하여 보거나 볼 수 있습니다.
- 휴대용 증폭 계기기를 사용하여 램프 분석의 온도를 최적화하고 속도와 감도 의 수준을 위해 실시간 증폭 그래프를 사용하여 분석합니다. 고유한 온도가 있는 샘플을 실행하여 최고 수준의 감도로 가장 빠른 증폭을 결정합니다.
- 추출된 DNA의 직렬 희석(단계 2.2.1의 포자 현탁액과 마찬가지로)을 만들고 각 희석에 대해 이전에 설명된 바와 같이 반응 조건을 유지함으로써 개발된 LAMP의 검출 한계를 결정한다.
- 기존의 PCR 방법과의 검출 제한 측정 및 비교
- 섹션 1.3의 단계에서 추출된 DNA를 사용하여 기존의 PCR의 검출 수준을 LAMP 분석기와 비교합니다.
- 전방 및 역 PCR 프라이머(표2),그린 PCR 마스터믹스의 12.5 μL, 총 25μL에 ddH2O의 9.5 μL이 포함된 PCR 튜브에 DNA 1μL을 추가합니다.
- 다음 조건을 사용하여 열 사이클러에서 시료를 증폭: 5분 동안 94°C, 30초 동안 94°C에서 30사이클, 54°C에서 30초, 연장은 72°C에서 10분 동안 72°C로 연장한다.
- 1% 아가로즈 젤에서 전기전도 기계에서 샘플을 실행하고 UV 이미징 기계에서 볼 수 있습니다. 제외 된 밴드 크기는 508 bp였습니다.
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Representative Results
LAMP 방법의 최적화
이 연구에서는 휴대용 루프 매개 이더스말 증폭(LAMP) 분석기를 사용하여 관개물에 피토프토라 캡시의 존재를 검출했습니다. 먼저, 제안된 LAMP 분석은 상이한 LAMP 프라이머 농도를 테스트하여 최적화되었다[F3, B3 (각각 0.1-0.5 μM); LF, LB(각각 0.5-1.0 μM) 및 FIP, BIP(각각 0.8~2.4μM)], 지속시간(30~70분), 온도(55-70°C). 본 연구에서 사용된 최종 LAMP 프라이머 믹스는 각 F3 및 B3 프라이머의 0.2 μM, 각 루프-F 및 루프-B 프라이머의 0.8 μM, 각 FIP 및 BIP 프라이머의 1.6 μM이었다. 반응 온도의 최적화는 추가 음수 증폭 없이 가장 빠른 반응을 수행한 온도를 결정함으로써 휴대용 증폭 기기(예를 들어, 지니 III)에서 수행되었다. 최적 온도는 64°C(도시되지 않은 데이터)로 확인되었다. 64°C에서 분석체를 실행하는 최적의 시간은 45분이었고, 검출에 긍정적인 가장 낮은 농도(1.2 x 102 포자/mL)는 여전히 40분 증폭된 반면, 고농도는 20분(도2D)로증폭되었다. 증폭된 LAMP 제품은 증폭을 확인하기 위해 핵산 얼룩으로 염색된 1% 아가로즈 겔을 더욱 관찰하였다. 모든 반응은 적어도 세 번 반복되었다.
P. capsici의 격리테네시, 플로리다, 조지아에서 찍은 하 고 메서드에 설명 된 동일한 프로토콜에 제출 되었다. P. capsici 분리의 모든 샘플은 분석의 모든 실행에서 성공적으로 증폭되었다(도 3).
휴대용 LAMP 분석기를 사용하여 관개물에서 피토프토라 캡시검출 및 감도 테스트
P. capsici 포자서스펜션(그림 1)의직렬 희석을 이용하여 실험실 조건 하에서 이 필터 종이 기반 LAMP 방법을 표준화했습니다. 직렬 희석은 4.8 x 104 동물원 포기스 / mL에서 시작하여 삼중 으로 LAMP 분석으로 실행되는 P. capsici 포자 서스펜션으로 만들어졌습니다. 포자 농도는 DNA 추출에 관여하는 방법으로 인해 DNA 농도보다는 오히려 나타난다. 가장 높은 포자 농도의 CTAB DNA 추출은 나노드롭에 의해 측정된 4.5 ng/μL이었고, 자기 비드 DNA 추출 프로토콜은 3.8 ng/μL26을산출했다. 새로 설계된 LAMP 프라이머 세트는 모든 추출 방법으로 1.2 x 102 포자/mL(그림2B, 2C, 및 2D)의농도를 감지할 수 있습니다. 휴대용 증폭 기기의 증폭 그래프에 나타난 감도는 추가 감도 없이 UV 이미지에 표시된 것과 동일했습니다. 동일한 직렬 희석은 색염염을 사용하여 LAMP 반응에서 실행되어 필드 검출을 위한 육안으로의 민감도 수준을 결정했습니다. 가장 낮은 관찰 농도는 4.8 x 103 포자/mL(그림2C)이었다.
실제 샘플을 사용하여 이 분석의 능력을 평가하기 위해, 물 샘플은 조지아 주 티프카운티에서 상업용 채소 생산에 사용되는 7개의 연못에서 수집하였다(표1, 도 5,및 보충도 1). 7개의 연못 중 3개(P1, P4 및 P6)(그림Figure 66A, 6B, 및 6C)를나타냈다. 이러한 결과는 휴대용 필터 종이 기반 LAMP 방법이 낮은 zoospore 농도로도 병원균의 검출에 매우 유용 할 수 있음을 시사한다. 이는 P. capsici에 의한 관개 수오염을 선별하기 위한 PCR보다 더 민감한 검출 분석으로 LAMP의 적용 가능성을 보여줍니다.
다른 방법의 비교 분석 : 전통적인 미끼, 기존의 PCR 및 휴대용 LAMP 기반 분석
기존의 PCR과 LAMP의 검출 감도를 비교하기 위해, 포자 현탁액의 직렬 희석으로부터 추출된 DNA는 PCR 반응에서 실행되었다. 결과는 기존의 PCR이 램프보다 40배 덜 민감하다는 것을 보여주었으며, 4.8 x103 포자/mL(그림2A)만큼낮은 동물원스포어 농도만 검출할 수 있었다. 또한, 여과관연못수로부터 얻은 DNA 샘플은 종래의 PCR을 이용하여 시험되었고, 3개의 양성 샘플(P4) 중 하나만이 예상 대역 크기와 상당한 오염으로 성공적으로 증폭되어 일부 번짐 및 특이하지 않은 대역(도6D)을초래하였다. 표 3은 시간, 비용, 감도 및 준비와 같은 변수를 사용하는 검색 방법의 차이점을 표시합니다. LAMP는 이들 세 가지 방법 중 가장 저렴한 방법이었고 증폭(DNA 추출 제외)을 위해 30-60분에서 가장 빠르다. 종래의 PCR은 증폭을 위해 120-180분범위(DNA 추출 제외).
마지막으로, 프라이머의 특이성을 결정하기 위해, 밀접하게 관련된 oomycete 병원체의 샘플(피토프토라 산모마나, Phytophthora 소재, 피토프토라 계피미, 피토프토라 팔미포라, 피티움 ultimum var. 울티움, 피토피티움 벡산, 피토피티튬 헬리코이드및 피티움 아포니더마툼)을획득하였고, DNA는 일관성을 위해 동일한 프로토콜을 사용하여 추출되었고, 새로운 LAMP 분석에 의해 평가되었다(그림4)프라이머의 특이성을 결정하였다. 모든 비표적 샘플은 45분 동안 최적화된 64°C를 사용하여 음수하였다. 이는 실시간 증폭 그래프에서 관찰되었으며 UV 빛 아래 1% 아가로즈 젤로 이미지하였다.
그림 1: 실험실 조건 하에서 집중 된 포자 서스펜션의 직렬 희석에서 Phytophthora capsici에 관련 된 다른 단계를 보여주는 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 식물성 캡시치검출을 위한 한계의 실험실 최적화. (A)종래의 PCR 분석은 직렬 희석 인자에 대한 특정 P. capsici 프라이머를 사용하여 수행되었으며 1% 아가로즈 젤에 시각화하였다. 1, 사다리; 2-7, 4.8 x 104,4.8 x 103,4.8 x 102,2.4 x 102,1.2 x 102 포자 /mL, 각각 및 7, 음수 제어. (B)1% 아가로즈 젤에 시각화된 LAMP 분석 시리얼 희석 인자. 1-6, 감소 포자 농도 : 4.8 x 104,4.8 x 103,4.8 x 102,2.4 x 102,1.2 x 102 포자 / mL 및 7, 음수 물 제어. (C)착색염염을 사용하여 시각화된 램프 결과. 1-6, 감소 포자 농도 : 4.8 x 104,4.8 x 103,4.8 x 102,2.4 x 102,1.2 x 102 포자 / mL 및 7, 음수 물 제어. (D)증폭 그래프에 시각화된 램프 결과. 빨간색 = 4.8 x 104,다크 블루 = 4.8 x 103,오렌지 = 4.8 x 102,라이트 블루 = 2.4 x 102,녹색 = 1.2 x 102 포자 / mL, 핑크 = 네거티브 컨트롤 (기타 피토프토라 종), 노란색 = ddH2O. (E)실시간 결과에 도시된 값의 정량화를 나타내는 표준 곡선. Ln(포자 수)은 X축에 표시되고 Y축에서 증폭하는 데 는 분이 표시됩니다. (F)1% 아가로즈 젤에 시각화된 직렬 희석 인자에 대한 출판된 프라이머(Dong et al. 2015)를 가진 LAMP 분석. 1-6, 감소 포자 농도 : 4.8 x 104,4.8 x 103,4.8 x 102,2.4 x 102,1.2 x 102 포자 / mL 및 7, 음수 물 제어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 다양한 위치에서 P. capsici DNA의 증폭. (A)1% 아가로즈 젤에 시각화된 램프 결과. 1, PC_TN1; 2, PC_TN2; 3, PC_FL1; 4,PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2; N, 네거티브 컨트롤. 샘플 1 과 2는 TN으로부터 분리되었다; 샘플 3 및 4 FL로부터 분리; 샘플 5 및 6은 GA로부터 분리되었다.(B)색염료를 사용하여 시각화된 결과. 1, PC_TN1; 2, PCTN2; 3, PC_FL1; 4,PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2. (C)증폭 그래프에 시각화된 결과. 빨간색, PC_TN1; 오렌지, PCTN2; 노란색, PC_FL1; 녹색, PC_FL2; 다크 블루, PC_GA1; 밝은 파란색, PC_GA2; 핑크, 네거티브 컨트롤. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 비표적 종 P. capsici에서 DNA를 사용하여 LAMP 분석의 특이성 결정. (A)아가로즈 젤에 관련 비표적 종과 램프 분석 반응1% 아가로즈 젤에 시각화. L, 사다리; 1, 피토프토라 산소마나; 2, 피토프토라 소재; 3, 피토프토라 계미노; 4, 피토프토라 팔미보라; 5, 피티움 울티멈 var. 6, 피토피티움 벡산; 7, 음의 제어; 8, 피토프토라 캡시카. (B)램프 결과는 색염료를 사용하여 시각화하였다. 1, 피토프토라 산소마나; 2, 피토프토라 소재; 3, 피토프토라 계미노; 4, 피토프토라 팔미보라; 5, 피티움 울티멈 var. 6, 피토피티움 벡산; 7, 음의 제어; 8, 피토프토라 캡시치 (C)증폭 그래프에 시각화 된 램프 결과. 빨강 = 피토프토라 캡시,다른 모든 비표적 종 샘플은 증폭되지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 현장에서 피토프토라 캡시치검출을 위해 재활용수의 샘플링 및 처리를 보여주는 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 관개 수원에서 피토프토라 캡시의 현장 검출 결과. (A)아가로즈 겔은 사우스 조지아의 7개 농장에서 테스트된 물의 램프 증폭의 결과를 보여줍니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 샘플 이름: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, 음수 대조군, N.(B)램프 결과 필드 샘플의 웜스타트 색염료를 사용하여 시각화: P1, P2, P3, P4, P4, P5, P5, P6, P6, P7, 네거티브 컨트롤, N.(C)샘플 의 램프 증폭에서 결과. 빨간색: P1, 녹색: P2, 퍼플: P3, 노란색: P4, 블루: P5, 오렌지: P6, 핑크: P7, 네거티브 컨트롤, N.(D)아가로즈 젤은 특정 프라이머 PC-1/PC-2를 사용하여 증폭의 기존 PCR 결과를 보여주는 (한 사이트보다 만 하나의 사이트에 비해 양수 테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 연못 이름 | 카운티 , 주 | 관개 에 대한 대상 작물 | PCR 감지 | 램프 감지 | 질병의 역사 (Y / N) |
| P1 | 티프트, 조지아 | 야채 | | + | N |
| P2 | 티프트, 조지아 | 야채 | - | - | N |
| P3 | 티프트, 조지아 | 야채 | - | - | N |
| P4 | 티프트, 조지아 | 야채 | + | + | N |
| P5 | 티프트, 조지아 | 야채 | - | - | N |
| P6 | 티프트, 조지아 | 야채 | - | + | N |
| P7 | 티프트, 조지아 | 야채 | - | - | N |
표 1: 남부 GA에서 관개 물 감지.
| 프라이머 유형 | 프라이머 이름 | 시퀀스 5'-3' | 소스 | ||
| 램프 | PCA3-F3 | 트GTGTGTGTTCGATCACA | 이 연구 | ||
| PCA3-B3 | TTTGCGTGTCCAGA | 이 연구 | |||
| PCA3-FIP | 가카카카아GCACTCGTACTOGTTTTACAATTGTGCAGAG가가 | 이 연구 | |||
| PCA3-BIP | 아가아가그타트CGGCGGCGTTGAAA아아아ACCCCCG | 이 연구 | |||
| PCA3-LF | TGTCGAATGGATTTGCGATCTT | 이 연구 | |||
| PCA3-LB | 아타카그카트택트가크 | 이 연구 | |||
| Pcr | PC-1 | GTCTTGTACCCTATCATGGCG | 장 외, 2006 | ||
| PC-2 | CGCCACAGCAGAAAgCATT | 장 외, 2006 | |||
표 2: 이 스터디에 사용된 프라이머.
| 매개 변수 | 전통적인 | 기존 PCR | 램프 |
| 감도 | Na | 4.8 X 102 포자/ml | 1.2 X 102 포자/ml |
| 시간 | 2주 이상 | 2-3시간(DNA 추출 제외) | 30분 - 1시간(DNA 추출 제외) |
| 준비 | • 미디어 제작 • 도금 및 격리 및 • 트랩 설계 |
• 필터 용지를 사용하여 포자 수집 • DNA 추출 및 • PCR 분석 |
• 필터 용지를 사용하여 포자 수집 • DNA 추출 및 • 램프 분석 |
| 자료 | • 오토클레이브 • 미디어 및 플레이트 • 인큐베이션 룸 • 플로우 후드 • 가지 • 우유 상자 |
• 열 사이클러 • 아가 젤 • 젤 닥 |
• 열 블록 또는 • 지니 III |
| 비용 | 트랩당 $5.00 | 반응당 $0.60 | 반응당 $0.75 |
표 3: P. capsici 검출을 위한 방법의 비교.
보충 도 1: 주 내에서 다양한 위치에서 가져온 티프 카운티, GA 및 관개 물의 샘플의 위치. 양수 샘플은 빨간색 점으로 표시되었습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 2 : 램프 프라이머 세트의 디자인. 화살표는 프라이머를 읽는 방법의 방향을 보여줍니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
식물병원균에 대한 관개물의 시험은 관개 연못과 재활용 된 물(27)을사용하는 재배자에게 중요한 단계입니다. 관개 연못은 과잉 관개물이16,,27로존재했을 수 있는 병원균을 운반하는 연못으로 전달되기 때문에 다수의 식물병원균에 대한 저수지 및 번식지를 제공한다. 큰 수원에서 식물 병원균의 검출을 위한 전통적인 방법은 연못에 매달린 취약한 숙주 조직(예를 들어, 과일, 잎)을 사용하여 병원체에 대한 미끼를 설정하고 감염이 일어날 때까지 기다린 다음 과일/잎을 제거하고 현미경 검사법 또는 분자 방법으로 진단을 확인하는 것이다13,,14. 이러한 방법은 검출 테스트(2주 이상)를 실행하는 데 필요한 시간 및 필요한 인건비 및 장비로 인해 제한됩니다. 또한 정확한 결과를 위해서는 시각 진단, 병원체 형태 및 분류에 대한 광범위한 경험과 지식이 필요합니다. PCR, qPCR 및 DNA 혼성화와 같은 분자 기술은 기존의 검출 방법보다 훨씬 적은 시간(3-4h)을 필요로 합니다. 그러나, 그들은 비싼 장비와 실험실 설정이 필요합니다. 또한 이러한 기술은 대량의 물을 가공하는 것을 허용하지 않습니다. 세로지학적 분석도 비표적 양성 반응으로 인한 검출 능력이 부족하며, 피토프토라 종에 대한 종별 분석이 개발되지 않았습니다. 루프 매개 이더스말 증폭(LAMP)은 최근 분석이 열사이클러(28),,29가아닌 단일 온도만 요구하므로 다중 병원균의 신속하고 민감한 검출을 위한 현장 진단 기술로 사용되고 있다. LAMP는 시각적 확인을 위해 색염료를 사용하거나 실시간 증폭 기를 사용하여 현장에서 실행하여1시간 30미만의결과를 볼 수 있다.
이 실험의 목적은 현장 또는 실험실에서 수원에서 Phytophthora capsici의 존재를 감지하는 신속하고 민감한 방법을 개발하는 것이었습니다. 검출 속도를 높이고 관개물에서 P. capsici를 검출하기 위한 이전에 언급된 방법의 한계에 대처하기 위해 필터 용지를 사용하여 포자를 포자를 포획하고 더 많은 양의 물에서 DNA를 추출하는 방법을 설계했습니다. 포자가 필터 용지 기술을 사용하여 포자를 포획한 후 DNA를 추출한 후, P. capsici에특이적으로 새로 설계된 LAMP 프라이머 세트를 기반으로 병원균의 존재가 확인되었다. 검출 감도 및 특이성은 LAMP 및 PCR을 사용하여 비교되었다. 모든 3 복제및 모든 동물원 의 농도와 함께, LAMP는 빠르고 더 민감한 검출 방법이었다(표 3). 이 방법은 전통적인 방법으로 작은 샘플 부피를 갖는 것에 의해 제한되지 않으며, 이 방법은 한 번에 최대 1 L의 물을 테스트할 수 있기 때문에 병원체 검출의 가능성을 증가시다. 초당 40mL 이하의 속도로 부흐너 깔때기를 통해 관개 물을 천천히 붓는 것이 필터 용지의 포자 포집 능력을 증가시키는 것으로 입증되었습니다.
검출 프로토콜의 유효성을 검사하기 위해 P. capsici가 존재하는 것으로 의심되는 현장의 물 샘플도 취해졌습니다(보충도 1)실용적인 시나리오로 설계된 방법을 테스트하였다. 시험된 7개 농장 중 3개는 LAMP 분석(도 6A-6C)을이용하여 P. capsici의 존재에 대해 양성이었고, 기존의 PCR 분석(도6D)을사용할 때 단 하나의 농장만이 양성반응을 보였으며, 관개수를 테스트하는 방법에 대한 램프를 보다 민감한 분석으로 보여 주면서 양호했다.Figure 6 비록, 이 필터 기반 LAMP 분석은 여과되지 않은 zoospore 현탁액을 가진 이 분석의 본래 감도(0.01 ng -5 포자)의 원래 감도보다 현저히 적은1.2 x 10 2 zoospores/mL의 농도에서 DNA를 검출할 수 있었습니다. 이전 램프 분석: 동 등. al. (2015)20은 동일한 직렬 희석에서 실행되었고 감도 수준이 동일하였다(도2F). 필터링되지 않은 포자 용액을 갖는 PCR 분석법에 대한 검출 수준은 또한 이전 PCR 기반결과(10)와매우 유사한 더 높은 수준의 검출(동등한 ~10 포자)을 보였다. 기존의 미끼 검출 방법의 포자 검출 한계는 단일 포자로 확인되지 않았으며 개별 적인 능력에 따라 감염을 일으킬 수 있다. LAMP 및 PCR 분석에서 발견되는 감도감소는 필터 용지를 통과하거나 주위를 흐르는 일부 포자 또는 필터 용지에 부착된 후 100% 효율로 추출할 수 없기 때문일 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이 새로운 LAMP 및 필터 시스템은 이전 방법보다 훨씬 높은 양의 물을 처리하고 분석할 수 있으며 현장 감지를 위한 더 높은 수준의 특이성과 속도를 부여합니다.
사용된 추출 방법 중, 자기 비드 기반 추출이 가장 빠르며 비드 비터 나 원심분리기와 같은 외부 기계의 사용을 필요로하지 않아 현장 추출에 유용하고 LAMP 분석의 휴대용 기능을 칭찬합니다. CTAB 기반 방법은 DNA의 가장 높은 농도를 산출하지만 가장 긴 시간이 걸렸으며, 상용 식물 DNA 추출 키트(예를 들어, DNeasy)는 필요한 시간과 DNA 농도 모두에서 두 번째로 획득되었다.
CTAB 및 상용 식물 DNA 추출 키트를 통해 필터 용지의 균질화 중에 균질화가 더 성공적이고 CTAB 용액(또는 추출 버퍼)이 비드 구타 또는 손 균질화전에 필터 종이 조각으로 튜브에 첨가되면 더 높은 농도를 산출했다. 비드 구타는 각각 1분 동안 3회 수행되었지만, 모든 추출 방법에서 완전한 균질화를 위해 각 라운드 사이에 튜브를 소용돌이치고 교반하는 것이 필요했습니다. 중요한 것은 필터 용지가 튜브의 측면이나 바닥에 붙어 있는 영향을 받기 때문에 필터 용지가 벽에서 떨어져 균일화되도록 하는 것이 중요합니다.
증폭에 필요한 총 시간은 90-120 분이며 현장 진단을 위해 현장에서 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이 필터 방법은 또한 병원체의 검출을 위한 가능한 기회를 증가시키기 위하여 물의 상당한 양을 필터링하도록 디자인되었습니다. 이 방법은 또한 수원으로 축적 될 수있는 많은 병원체, 특히 제네라와 같은 피토늄, 피토프토라, 푸사리움및 박테리아에 적용 할 수 있습니다. 필요한 유일한 변화는 표적병원체(30)에대해 동일하게 특정 된 LAMP 프라이머 세트의 개발이다.
이 작업의 중요한 출력은 관개 수원에서 P. capsici의 검출을 위한 매우 민감하고 빠른 필터 종이 기반 LAMP 분석의 개발입니다. 우리는 이 연구가 재활용 관개물의 오염에 대한 인식의 증가로 이어질 것으로 예상하고, 결국 Phytophthora 관련 질병의 관리를 개선하고, 결과적으로 생산 비용을 절감하고 작물 수율을 증가시킬 것으로 예상됩니다. 이러한 정보는 채소 생산 지속 가능성을 개선하고 채소 생산의 수익성을 향상시키기 위해 매우 필요합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없거나 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 야채 프로젝트 ID # FP000016659에 대한 조지아 상품위원회의 재정 지원을 받았다. 저자는 피토프토라 spp의순수한 문화를 제공하는 조지아 대학 핑성 지 박사와 박사 앤 도랜스, 오하이오 주립 대학 감사합니다. 우리는 또한 연구 기간 내내 그들의 기술 지원에 대한 리 왕과 델로리스 베니에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
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