使用环介导等温扩增法检测灌溉水中的Phytophthora capsici

摘要

我们开发了一种利用滤纸DNA提取法结合环介导等温扩增（LAMP）检测技术来检测水源中Phytophthora capsici游动孢子的方法，该方法可在野外或实验室中进行分析。

摘要

Phytophthora capsici 是一种破坏性极强的卵菌病原体，可侵染多种重要的茄科和葫芦科作物，每年在蔬菜生产中造成严重的经济损失。Phytophthora capsici 通过土壤传播，因其具有长期存活的休眠结构（卵孢子和厚垣孢子），能够抵抗环境风化和降解，因此在蔬菜田中成为持续性问题。该病原菌主要通过产生游动孢子进行传播，游动孢子为单细胞、具鞭毛的孢子，可在地表或土壤孔隙积水形成的水膜中游动，并在水坑和池塘中聚集。因此，灌溉池塘可能成为病原菌的来源以及病害暴发的初始点。使用传统的基于培养的方法检测灌溉水中的 P. capsici 十分困难，因为环境中存在的其他微生物（如 Pythium 属物种）通常会过度生长并掩盖 P. capsici，导致其无法被检测。为了确定水源（灌溉水、径流水等）中是否存在 P. capsici 孢子，我们开发了一种基于手动泵的滤纸（8–10 µm）过滤方法，可有效捕获病原菌的孢子（游动孢子），随后利用一种新型环介导等温扩增（LAMP）检测技术对病原菌 DNA 进行扩增，该 LAMP 方法专为特异性扩增 P. capsici 而设计。该方法可检测低至 1.2 × 10² 个游动孢子/毫升浓度的 DNA，灵敏度是传统 PCR 的 40 倍。在检测近缘物种时未出现交叉扩增。此外，LAMP 检测使用了比色型 LAMP 预混染料，结果可通过肉眼直接观察，适用于现场快速检测。本方案可进一步调整，用于检测其他通过受污染灌溉系统生存、聚集或传播的病原体。

引言

由于用水成本上升以及对水资源使用的环境问题日益关注，农场和苗圃中循环利用水的做法正变得越来越普遍。为减少植物病害的传播和发生，种植者已开发出多种灌溉方法。无论水源来自灌溉还是降水，都会产生径流，许多蔬菜和苗木种植者设有池塘来收集并循环利用这些径流¹。然而，这会形成潜在病原物的蓄积库，当回收水用于作物灌溉时，反而有利于病原物的传播^2,3,4。卵菌类植物病原物尤其能从这种做法中获益，因为其游动孢子会在水中聚集，而其主要的传播孢子虽具有自主运动能力，但需要依赖地表水进行扩散^5,6,7。Phytophthora capsici 是一种卵菌病原物，以多种不同方式侵染多种茄科和葫芦科作物⁸。常见症状包括幼苗猝倒、根部和茎基腐烂；但在黄瓜、西葫芦、甜瓜、南瓜、西瓜、茄子和辣椒等作物上，果实腐烂可导致整季收成完全丧失⁹。尽管目前已有一些检测该植物病原物的方法，但大多数方法需在感染已发生后才能检测，此时再使用预防性杀菌剂....

方案

1. 利用便携式环介导等温扩增技术对灌溉水中的Phytophthora capsici进行现场检测

1. 安装泵和过滤器
   1. 将抽滤瓶连接到与手动泵相连的管路上，使得启动泵时空气能从抽滤瓶口被吸入。
   2. 将布氏漏斗插入抽滤瓶口的橡胶塞中，并将适当大小的滤纸放入布氏漏斗内，确保空气能通过滤纸。滤纸的截留粒径应为 15 µm。
      注意：滤纸必须紧贴布氏漏斗边缘，以尽量减少水从滤纸周围流过。
2. 水样采集与过滤
   1. 从目标水源采集水样。水样中可含有少量碎屑，但不应含有大量沉积物或土壤。
   2. 在使用手动泵（或真空泵）产生负压抽吸的同时，将最多 1,000 mL（1 升） 测试水样缓慢倒入布氏漏斗中的滤纸上，速度应足够慢以防止溢出。
      注意：本方法对检测水样的最小体积无严格要求，建议至少使用 50 mL，最大体积为 1000 mL。
   3. 使用镊子将滤纸从布氏漏斗中取出，并用无菌剪刀剪成小片。将尽可能多的滤纸片（8–12 片）加入 1.5 mL 离心管中，使其完全浸没于提取缓冲液（磁珠法提取时为 400 µL）中。剩余滤纸片保留，待第一批次提取完成后继续处理。
   4. 将滤纸片与提取缓冲液在涡旋振荡器上或通过其他方式每分钟振荡 10 秒，持续 5 分钟。然后用镊子取出滤纸片，尽可能减少提取 缓冲液的损失。对剩余....

结果

LAMP 方法的优化
本研究采用便携式环介导等温扩增（LAMP）检测方法，检测灌溉水中是否存在Phytophthora capsici。首先，通过测试不同的 LAMP 引物浓度 [F3、B3（各 0.1–0.5 µM）；LF、LB（各 0.5–1.0 µM）和 FIP、BIP（各 0.8–2.4 µM）]、反应时间（30–70 分钟）以及反应温度（55–70 °C），对所建立的 LAMP 检测方法进行优化。本研究最终采用的 LAMP 引物混合物组成为：F3 和 B3 引物各 0.2 µM，Loop-F 和 Loop-B 引物各 0.8 µM，FIP 和 BIP 引物各 1.6 µM。通过便携式扩增仪（例如 Genie III）确定在无非特异性扩增的前提下反应速度最快的温度，以优化反应温度。最终确认最佳反应温度为 64 °C（数据未显示）。在 64 °C 下运行检测的最佳时间为 45 分钟，因为最低检出浓度（1.2 × 10² 孢子/mL）在 40 分钟时已可扩增，而较高浓度样本在 20 分钟时即可完成扩增（图 2D.......

讨论

对灌溉水中的植物病原体进行检测，是使用灌溉池塘和循环用水的种植者至关重要的一步²⁷。灌溉池塘为多种植物病原体提供了储水和繁殖的场所，因为过量的灌溉水会从田间流入池塘，并携带可能存在的任何病原体^16,27。传统上，在大型水源中检测植物病原体的方法是使用易感寄主组织（例如果实、叶片）作为诱饵，将其悬挂在池塘中，等待感染发生后取出果实或叶片，并通过显微镜观察或分子方法确认诊断结果^13,14。这些方法存在局限性，主要体现在检测所需时间较长（2周或更久），以及对人力和设备的高需求。此外，准确的检测结果依赖于操作人员在肉眼诊断、病原体形态学和分类学方面具备丰富的经验与知识。相比之下，PCR、qPCR和DNA杂交等分子技术所需的检测时间显著缩短（3–4小时），但需要昂贵的仪器和实验室环境。此外，这些技术无法处理大量体积的水样。血清学检测方法在检测能力方面也存在不足，因其易.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖凝胶粉末	Thomas Scientific	C997J85
布氏漏斗	Southern Labware	JBF003
子弹式混匀仪	Next Advance	BBX24
离心机 5430	Eppendorf	22620509
氯仿	Fischer Scientific	C298-500
CTAB 溶液	Biosciences	786-565
Dneasy 提取试剂盒	Qiagen	69104
抽滤瓶	United	FHFL1000
滤纸	United Scientific Supplies	FPR009
核酸染料 Gel Green 10000X	Thomas Scientific	B003B68 (1/EA)
Genie III	OptiGene
手动泵	Thomas Scientific	1163B06
异戊醇	Fischer Scientific	BP1150-500
LAVA LAMP 预混液	Lucigen	30086-1
磁珠 DNA 提取试剂	Genesig	genesigEASY-EK
磁力分离架	Genesig	genesigEASY-MR
聚乙烯吡咯烷酮	Sigma Aldrich	PVP40-500G
引物	Sigma Aldrich
Prism 小型离心机	Labnet	C1801
热循环仪 T100	Bio-Rad	1861096
紫外凝胶成像系统	Analytik Jena	849-00502-2
Warmstart 显色染料	Lucigen	E1800m
宽型小型 ReadySub-Cell GT 电泳槽	Bio-Rad	1704489EDU
70% 异丙醇	Fischer Scientific	A451-1