Summary
Vi utvecklat en metod för att upptäcka Phytophthora capsici zoosporer i vattenkällor med hjälp av ett filter papper DNA extraktion metod tillsammans med en loop-medierad isotermisk förstärkning (LAMP) analys som kan analyseras i fält eller i labbet.
Abstract
Phytophthora capsici är en förödande oomycete patogen som påverkar många viktiga solanaceous och cucurbit grödor orsakar betydande ekonomiska förluster i vegetabilisk produktion årligen. Phytophthora capsici är jordburen och ett ihållande problem i vegetabiliska fält på grund av dess långlivade överlevnadsstrukturer (oosporer och chlamydospores) som motstår vittring och nedbrytning. Den huvudsakliga metoden för spridning är genom produktion av zoosporer, som är encelliga, flagellerade sporer som kan simma genom tunna filmer av vatten som finns på ytor eller i vattenfyllda jordpor och kan ackumuleras i pölar och dammar. Därför kan bevattningsdammar vara en källa till patogenen och initiala punkter av sjukdomsutbrott. Detektion av P. capsici i bevattningsvatten är svårt med traditionella odlingsbaserade metoder eftersom andra mikroorganismer som finns i miljön, såsom Pythium spp., vanligtvis överväxt P. capsici gör det omöjlig att upptäcka. För att bestämma förekomsten av P. capsici sporer i vattenkällor (bevattningsvatten, avrinning, etc.), utvecklade vi en handpump-baserade filterpapper (8-10 μm) metod som fångar patogenens sporer (zoosporer) och används senare för att förstärka patogenens DNA genom en roman loop-medierad isotermisk förstärkning (LAMP) analys som utformats för specifik förstärkning av Pici mössor. Denna metod kan förstärka och upptäcka DNA från en koncentration så låg som 1,2 x 102 zoospores/mL, vilket är 40 gånger känsligare än konventionella PCR. Ingen korsförstärkning erhölls vid testning av närbesläktade arter. LAMP utfördes också med hjälp av en kolorimetrisk LAMP master mix färgämne, visar resultat som kunde läsas med blotta ögat för på plats snabb upptäckt. Detta protokoll skulle kunna anpassas till andra patogener som finns, ackumuleras eller sprids via förorenade bevattningssystem.
Introduction
Återvinning av vatten i gårdar och plantskolor blir allt populärare på grund av de ökade vattenkostnaderna och miljöhänserna bakom vattenanvändningen. Många bevattningsmetoder har utvecklats för odlare för att minska spridningen och förekomsten av växtsjukdom. Oavsett källan till vattnet (bevattning eller nederbörd), avrinning genereras, och många vegetabiliska och plantskola odlare har en damm för att samla in och återvinna avrinning1. Detta skapar en reservoar för eventuella patogen ansamling gynnar spridningen av patogener när det återvunna vattnet används för att bevattna grödor2,3,4. Oomycete växt patogener särskilt dra nytta av denna praxis som zoosporer kommer att ackumuleras i vatten och den primära dispersiva sporen är självmotila men kräver ytvatten5,6,7. Phytophthora capsici är en oomycete patogen som påverkar ett betydande antal solanaceous och cucurbit grödor på olika sätt8. Ofta är symptomen dämpning-off av plantor, rot och krona röta; dock i grödor som gurka, squash, melon, pumpa, vattenmelon, aubergine och peppar, kan hela skördar gå förlorade på grund av fruktröta9. Även om det finns kända metoder för att upptäcka denna växt patogen, de flesta kräver en infektion har redan ägt rum som är för sent för någon förebyggande fungicider att ha en betydande effekt10.
Den traditionella metoden för att testa bevattningsvatten för detektion och diagnos av riktade mikroorganismer är en föråldrad strategi när hastighet och känslighet är avgörande för framgång och lönsam växtodling11,12. Växtvävnad som är mottagliga för den riktade patogenen (t.ex. aubergine för P. capsici) är fäst vid en modifierad fälla som är upphängd i en bevattningsdamm under längre tid innan den tas bort och inspekteras för infektion. Prover från växtvävnaden pläteras sedan på semiselektiva medier (PARPH) och inkuberas för odlingstillväxt, därefter utförs morfologisk identifiering med hjälp av ett sammansatt mikroskop13. Det finns andra liknande detektionsmetoder för andra växtpatogener som använder selektiva medier och plätering av små mängder förorenat vatten före sub-culturing14,15. Dessa metoder kräver allt från 2 till 6 veckor, flera omgångar av sub-culturing att isolera organismen, och erfarenhet på Phytophthora diagnostik för att kunna känna igen de viktigaste morfologiska tecken av varje art. Dessa traditionella metoder fungerar inte bra för detektion av bevattningsvatten förorenat av P. capsici på grund av faktorer som inblandning av andra mikroorganismer som också finns i vattenkällorna. Vissa snabbväxande mikroorganismer som Pythium spp. och vattenburna bakterier kan växa över på plattan vilket gör P. capsici omöjlig att upptäcka16,17.
Syftet med denna studie var att utveckla en känslig och specifik molekylär metod som kan användas i både fält- och laboratoriemiljöer för att upptäcka P. capsici zoospores i bevattningsvatten. Protokollet omfattar utvecklingen av en roman loop-medierad isotermisk förstärkning (LAMP) primer uppsättning kunna särskilt amplifiera P. capsici, baserat på en 1121-bas par (bp) fragment av P. capsici18,19. En tidigare utvecklad LAMP-primer från Dong et al. (2015) användes i jämförelse med den analys som utvecklades för denna studie20.
LAMP-analysen är en relativt ny form av molekylär detektion som har visat sig vara snabbare, känsligare och specifika än konventionell polymeraskedjereaktion (PCR)21. I allmänhet kan konventionella PCR-analyser inte upptäcka under 500 kopior (1,25 pg/μL); däremot har tidigare studier visat att LYKTS känslighet kan vara 10 till 1 000 gånger högre än konventionell PCR och lätt kan upptäcka även 1 fg/μL av genomiskt DNA22,23. Dessutom kan analysen utföras snabbt (ofta i 30 min) och på plats (i fält) genom att använda en bärbar värmeblock för förstärkning och ett kolorimetriskt färgämne som ändrar färg för ett positivt prov (ta bort behovet av elektrofores). I denna studie jämförde vi känsligheten hos PCR- och LAMP-analyser med hjälp av en filterutsugsmetod. Den föreslagna detektionsmetoden gör det möjligt för forskare och utvidgningsmedel att enkelt upptäcka förekomsten av P. capsici sporer från olika vattenkällor på mindre än två timmar. Analysen är bevisat att vara mer känslig än konventionella PCR och validerades in situ genom att upptäcka förekomsten av patogenen i bevattningsvattnet som används av en odlare. Denna detektionsmetod kommer att göra det möjligt för odlarna att uppskatta patogenens förekomst och populationstäthet i olika vattenkällor som används för bevattning, vilket förhindrar förödande utbrott och ekonomiska förluster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. På plats upptäckt av Phytophthora capsici från bevattningsvatten med hjälp av bärbara loop-medierad isotermisk förstärkning
- Ställa in pumpen och filtret
- Sätt fast en filtreringskolv på ett rör som är anslutet till en handpump så att när pumpen är aktiverad kommer luft att dras in genom mynningen på filtreringskolven.
- Montera Buchnertratten i gummiproppen på filtreringskolvens mynning och passa in den lämpligt stora filterpappret i Buchnertratten så att luft dras genom filterpapperet. Filterpapperet ska ha en kvarhållningsstorlek på 15 μm.
OBS: Filtrerpapperet måste passa till Buchnertrattens kanter så att minimalt vatten kommer att rinna runt filterpapperet.
- Vattenprovtagning och filterering
- Ta vattenprover från den riktade källan. Vatten kan ha små mängder skräp men inte betydande sediment eller jord.
- Häll upp till 1 000 mL (1 Liter) testvatten över filterpapperet som placeras inuti Buchnertratten långsamt nog för att förhindra överströmning, medan handpumpen (eller vakuumet) används för att skapa ett sug för att dra vattnet igenom.
OBS: Det finns ingen minsta mängd vatten som kan testas med denna metod, och även om det minst 50 mL föreslås, 1000 mL är den maximala för denna metod. - Ta bort filterpapperet från Buchnertratten med hjälp av tryningar och skär det i små bitar med steril sax. Tillsätt så många bitar (8-12) som kan vara nedsänkt i den mängd extraktionsbuffert (400 μL för magnetisk pärlbaserad extraktion) som krävs av protokollet till ett 1,5 mL-rör. Spara återstående bitar av filterpapper för bearbetning efter att den första uppsättningen har extraherats.
- Vortex eller på annat sätt agitera bitar av filterpapper och utvinningsbuffert för 10 s varje minut i 5 min. Sedan, med hjälp av tpålar, ta bort filterpapper förlora så lite av extraktionsbuffert som möjligt. Upprepa detta steg med de återstående pappersbitarna av filterpapper tills alla bitar har virvelats/upprörts och blötts i utsugningsbufferten.
- Magnetisk pärlbaserad extraktion av DNA från filterpapper
- Till 1,5 mL-röret (som nu innehåller cirka 200-300 μL extraktionsbuffert), tillsätt 20 μL proteinas K och 10 μL av 10 ng/μL RNase.
- Inkubera i rumstemperatur i 15 min, virvel eller skaka röret var 3 min.
- Tillsätt 500 μL av magnetiska pärlor med bindningsbufferten till provet och blanda väl genom skakning. Därefter inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Placera röret i magnetseparatorställningen i 2 min tills alla pärlor har dragits till magneten. Ta bort och kasta supernatanten.
- Ta bort röret från magnetavskiljaren. Tillsätt 500 μL AvTvätt Buffert 1 och åter upphäva pärlor genom att skaka röret kraftigt. Vänta i 30 s och sedan placera röret tillbaka i den magnetiska separatorn. Vänta i 2 min tills alla pärlor har dragits mot magneten innan du tar bort och kasserar supernatanten.
OBS: När man väntar på att de magnetiska pärlorna ska magnetisera till separatorn rekommenderar vi att du inverterar röret, som kan rubba magnetiska pärlor som fastnat på locket och rörens sidor och resulterar i att ett större antal pärlor sätts fast. - Upprepa steg 1.3.5 med 500 μL av Tvättbuffert 2.
- Upprepa steg 1.3.5 med 500 μL av 80% etanol.
- Airdry den magnetiska pärla pelleten i 15 min vid rumstemperatur (18-27 °C) med locket öppet. Om temperaturer inte tillåter, inkubera i en handske med locket öppet i 15 min.
- Ta bort röret från magnetavskiljaren. Tillsätt 50 μL elueringsbuffert och åter upphäva pärlorna genom pipettering upp och ner i 1 min.
- Placera tillbaka tuben i en magnetisk separator. Vänta 2 min innan du överför supernatanten utan att störa pärlorna till ett separat rör för DNA-lagring.
OBS: Här kan experimentet pausas innan du går vidare. Extraherat DNA ska förvaras på is eller i en -20 °C frys.
- Tillämpning av nyutvecklad LAMP-analys
- Förbered LAMP primer mix med hjälp av 0,2 μM av varje F3 och B3 primer, 0,8 μM av varje Loop-F och Loop-B primer, och 1,6 μM av varje FIP och BIP primer (Tabell 2).
- Tillsätt följande LAMPlösning till ett enda PCR-rör, eller till varje enskilt rör i 8 rörremsan: 2,5 μL primermix (steg 1.4.1), 12,5 μL av LAVA LAMP master mix, 1 μL extraherat DNA, och 9 μL ddH2O. Den totala volymen är 25 μL.
OBS: Om du använder det bärbara amplifieringsinstrumentet (t.ex. Genie III) med kolorimetriskt färgämne (t.ex. Warmstart), hänvisas till avsnitt 2.4.2- 2.4.3. - Utse två rör som positiva och negativa kontroller. För den positiva kontrollen, använd antingen en kontroll som tillhandahålls av KITET LAVA LAMP, eller ett känt positivt DNA-prov. För den negativa kontrollen, använd ddH2O. För båda, ersätt 1 μL av extraherat DNA med 1 μL av den positiva kontrollen eller ddH2O.
- Ställ in proverna i ett värmeblock (eller portabelt förstärkningsinstrument) inställt på 64 °C i 45 min.
OBS: Andra extraktionsmetoder kan användas här i stället för magnetisk pärla baserad extraktion. CTAB och en kommersiell DNA-extraktionssats testades båda framgångsrikt med hjälp av standardprotokollen och ersatte filterpappersstyckena förväxtprovet 24,25. Resultaten jämfördes i tabell 2. Om koncentrationen av DNA kan kvantifieras, använd mellan 1-10 ng genomiskt DNA.
- Visualisering av resultat
- Om de utförs i en laboratorieinställning, visa förstärkningsprodukterna genom att lasta 5 μL av varje prov i en 1% agarosgel, köra dem i en gelelektroforesmaskin och avbilda dem i en UV-avbildningsmaskin.
- Om ett färgämne (t.ex. Varmstart) användes, visa färgändringen för att bestämma resultat som positiva eller negativa.
- Om ett portabelt förstärkningsinstrument (t.ex. Genie III) användes, visa förstärkningsgrafen på skärmen för att bestämma resultaten.
- Tillämpning av tidigare utvecklad PCR-analys
OBS: Om du använder en konventionell PCR-analys förblir steg 1-3 densamma, och följande steg bör tillämpas i stället för steg 1.4 och 1.5.- Tillsätt 1 μL av varje DNA-extraktion till enskilda rör som innehåller följande komponenter: 12,5 μL grön PCR-mastermix, 9,5 μL av ddH2O, och 1 μL av framåt- och omvänt grundställe (Tabell 2).
- Snurra ner varje prov med hjälp av en mikrocentrifug och placera rör i en termisk cycler.
- Använd följande termiska cyclerinställningar i enlighet med de tidigare publikationerna: 94 °C i 5 min, 30 cykler av denaturering vid 94 °C i 30 s, glödgning vid 54 °C i 30 s, förlängning vid 72 °C i 1 min och slutlig förlängning vid 72 °C i 10 min.
- Kör produkten i en 1% agarosgel. Observera förekomsten av band under UV-ljus där positiva reaktioner kommer att ha en bandstorlek på ~ 508 bp.
- Traditionell metod för detektion
OBS: Det finns flera metoder för selektiv plätering för patogendetektering, och följande är ett allmänt protokoll för P. capsici.- Först, skaffa en frisk aubergine frukt (en mottaglig värd för P. capsici) och yta sterilisera genom att tvätta fruktytan med 70% isopropylalkohol.
- Placera auberginefrukten i mjölkbackar med flytanordning (polyetylenskum eller annat) och sätt ut i bevattningsdammar. Säkra varje betesfälla till en enda punkt och lämna fällorna i vattenreservoaren (återvunnet bevattningsvatten) i minst 7 dagar eller tills fruktrötasymtom observeras. Samla upp frukten och transportera den till laboratoriet.
- Skölj och torka frukten i en steril huva innan du tar bort små bitar av infekterade vävnader och placera dem på en platta av PARPH medium ändrats med 25 mg/L pentachloronitrobensen, 0,0005% pimaricin, 250 mg/L ampicillin, 10 mg/L rifampicin och 50 mg/L hymexazol. Inkubera plattor vid 25 °C i 5 dagar.
- Visa plattor under en sammansatt mikroskop för traditionella morfologiska identifiering på 4 dagar efter isolering.
2. Fastställande av detektionsgränsen för zoosporekoncentration
- Att göra zoospore suspension
- Inkubera P. capsici på V8-agar (100 mL av V8 juice, 900 mL av ddH2O, 1 g av CaCO3) plattor för 1 vecka vid 26 °C. Flera plattor kan användas för att få en större mängd zoospore suspension.
- Inkubera plattorna under kontinuerligt ljus i rumstemperatur i 3 dagar för att stimulera sporulation.
- Översvämma plattorna genom att lägga till 15 mL ddH2O till varje platta och placera dem i en 4 ° C kylskåp för 25 min. Återgå sedan till rumstemperatur i 30 min.
- Agitera plattor för att rubba zoosporer och pipettera lösningen till ett enda 50 mL-rör från alla plattorna.
- För att få en exakt uppskattning av zoosporekoncentrationen, tillsätt 10 μL av sporsuspensionen på en hemocytometer och observera under mikroskop för att räkna djurparker och uppskatta den genomsnittliga koncentrationen.
- Seriell utspädning
- Tillsätt 1 mL av sporupphängningen och 9 mL av ddH2O till ett separat rör. Upprepa detta steg för så många 10-faldiga utspädningar som önskas.
- Spore lösningar lämnas sedan för DNA-extraktion baserat på det tidigare protokollet med hjälp av filtreringsmetoden.
OBS: Om en större volym suspension önskas, dubbla volymen: 2 mL sporfjädring och 18 mL ddH2O.
- Påvisande av koncentrationsgräns för zoospore
- Utvärdera spordeteteringsgränsen genom att köra varje serieutspädning individuellt genom analysen tills klart positiva resultat inte längre observeras. När den slutliga utspädningen har erhållits späds du ut med faktorn 2 (4,8 till 2,4 i detta exempel) och kör analysen igen för att få en mer exakt detektionsgräns.
- Utveckling och optimering av LAMP-metoden
OBS: LAMP-primers konstruerades baserat på ett 1121-baspar (bp) fragment av P. capsici (Li et al.19) som visas i Tilläggsfigur 2.- Om kolorimetriskt färgämne (t.ex. Warmstart) används, använd följande lösning: 2,5 μL primermix, 12,5 μL koloretriskt färgämne, 0,5 μL av Grönt fluorescerande färgämne, 1 μL extraherat DNA och 8,5 μL av ddH2O. Den totala volymen är 25 μL.
- Vid användning av det portabla amplifieringsinstrumentet med LAVALAMP mastermix, ha ett inledande steg på 95 °C i 3 min enligt tillverkarens rekommendation, men detta krävs inte. Ett sista glödgningssteg krävs inte för att observera färgförändrings- eller amplifieringsgrafen. Kör inte ett warmstart-steg om det kommersiella kolorometerämnet ska användas.
- View LAMP-analys resulterar i en av följande metoder: kör prover på en 1% agarosgel eller vy med hjälp av en UV-avbildningsmaskin med blotta ögat eller utsikten vid Genie III-realtidsförstärkningsskärmen.
- Optimera temperaturen på LAMP-analysen genom att använda det bärbara förstärkningsinstrumentet och analyseras med hjälp av grafin för förstärkning i realtid för hastighet och känslighetsnivå. Kör prover med unika temperaturer för att bestämma den snabbaste förstärkningen med den högsta känslighetsnivån.
- Bestäm detektionsgränsen för den lyktlampa som utvecklats analys genom att göra en serieutspädning av extraherat DNA (som med sporfjädring i steg 2.2.1) och bibehålla reaktionsförhållanden enligt tidigare beskrivning för LAMPreaktionen för varje spädning.
- Detektionsgränsbestämning och jämförelse med konventionell PCR-metod
- Använd DNA som extraherats i steg i avsnitt 1.3 för att jämföra detektionsnivån för konventionell PCR med lampanalysens.
- Tillsätt 1 μL DNA till ett PCR-rör som innehöll 1 μL av både framåt- och bakåtvända PCR-primers (tabell 2), 12,5 μL av Green PCR Mastermix, och 9,5 μL av ddH2O för totalt 25 μL.
- Förstärka prover i en termisk cycler med hjälp av följande förhållanden: 94 °C i 5 min, 30 cykler av denaturering vid 94 °C i 30 s, glödgning vid 54 °C i 30 s, förlängning vid 72 °C i 1 min, och slutlig förlängning vid 72 °C i 10 min.
- Kör prover i en elektroforesmaskin på en 1% agarosgel och visa på en UV-bildmaskin. Den undantagna bandstorleken var 508 bp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optimering av LAMP-metoden
I denna studie upptäckte vi förekomsten av Phytophthora capsici i bevattningsvatten med hjälp av en bärbar loop-medierad isotermisk förstärkning (LAMP) analys. Först optimerades den föreslagna LAMP-analysen genom att testa olika LAMP primer-koncentrationer [F3, B3 (0.1–0.5 μM vardera); LF, LB (0,5–1,0 μM vardera) och FIP, BIP (0,8–2,4 μM vardera)], varaktigheter (30–70 min), och temperaturer (55–70 °C). Den slutliga LAMP primermixen som användes i denna studie var: 0,2 μM av varje F3- och B3-primer, 0,8 μM av varje Loop-F och Loop-B primer, 1,6 μM av varje FIP- och BIP-primer. Optimering av reaktionstemperatur utfördes i det portabla amplifieringsinstrumentet (t.ex., Genie III) genom att bestämma vilken temperatur som utförde den snabbaste reaktionen med ingen ytterligare negativ förstärkning. Den optimala temperaturen bekräftades vara 64 °C (data visas inte). Den optimala tiden för att köra analysen vid 64 °C var 45 min, då de lägsta koncentrationerna som var positiva för detektion (1,2 x 102 sporer/mL) fortfarande förstärkt med 40 min, medan högre koncentrationer förstärktes vid 20 min (Figur 2D). De amplifierade LAMP-produkterna observerades ytterligare på 1% agarosgel fläckas med en nukleinsyra fläck för att bekräfta förstärkning. Alla reaktioner upprepades minst tre gånger.
Isolat av P. capsici togs från Tennessee, Florida och Georgien och lämnades in till samma protokoll som beskrivs i metoderna. Alla prover av P. capsici isolates förstärktes framgångsrikt i alla körningar av analysen (Figur 3).
Detektion och känslighetsprovning av Phytophthora capsici i bevattningsvatten med hjälp av portabel LAMP-analys
Vi standardiserade denna filterpappersbaserade LAMPmetod under laboratorieförhållanden med hjälp av en serieutspädning av P. capsicispor suspensioner (figur 1). Serieutspädningar gjordes från en P. capsici sporfjädring med början vid 4,8 x 104 zoosporer/mL och kördes med LAMP-analysen i tre exemplar. Sporkoncentrationer visas snarare än DNA-koncentration på grund av den metod som är involverad för DNA-extraktion. CTAB DNA-extraktion av den högsta sporkoncentrationen var 4,5 ng/μL mätt med Nanodrop, och det magnetiska pärl-DNA extraktionsprotokollet gav 3,8 ng/μL26. Den nydesignade LAMP primer setet kunde upptäcka en koncentration så låg som 1,2 x 102 sporer/mL (Figur 2B, 2C, & 2D) med alla metoder för extraktion. Känsligheten som visades i grafen av förstärkning på det bärbara förstärkningsinstrumentet var identisk med den som visades i UV-bilden utan ytterligare känslighet. Samma serieutspädning var köras i en LAMP reaktion med hjälp av det kolorimetrisk färgämnet att bestämma nivån av känslighet för blotta ögat för fältdetektering. Den lägsta observerbara koncentrationen var 4,8 x 103 sporer/mL (figur 2C).
För att utvärdera förmågan hos denna analys med hjälp av verkliga prover, vattenprover samlades in från sju dammar som används för kommersiell grönsaksproduktion i Tift County, Georgia (Tabell 1, Figur 5, och Kompletterande Figur 1). Av de 7 dammarna visade 3 positiva LAMPresultat (P1, P4 och P6) (Figur 6A, 6B, & 6C). Dessa resultat tyder på att den bärbara filtrerpapper-baserade LAMP metoden skulle kunna vara mycket användbart för detektering av patogenen även med en låg zoospore koncentration. Detta visar tillämpligheten av LAMP som en mer känslig detektionsanalys än PCR för screening bevattning vatten förorening av P. capsici.
Jämförande analys av olika metoder: Traditionell bete, konventionell PCR, och den bärbara LAMP-baserade analysen
För att kunna jämföra lampans detektionskänslighet med konventionell PCR kördes det DNA som extraherades från den seriella utspädningen av sporupphängningar i en PCR-reaktion. Resultaten visade att konventionell PCR var 40x mindre känslig än LAMP, bara kunna upptäcka en zoospore koncentration så låg som 4,8 x 103 sporer/ mL (Figur 2A). Dessutom testades DNA-proverna som erhållits från filtrerat bevattningsdammvatten med konventionell PCR, och endast ett av de tre positiva proverna (P4) förstärktes framgångsrikt som förväntat bandstorlek plus betydande kontaminering som resulterade i vissa utsmetnings- och ospecifika band (Figur 6D). I tabell 3 visas skillnaderna mellan detektionsmetoder med hjälp av sådana variabler som tid, kostnad, känslighet och förberedelser som krävs. LAMP var den minst dyra metoden bland dessa tre metoder och det var också den snabbaste, allt från 30-60 min för förstärkning (DNA-extraktion undantagen). Konventionell PCR varierade från 120-180 min för förstärkning (DNA extraktion undantagna).
Slutligen, för att bestämma specificiteten hos de primers, prover av närliggande oomycete patogener (Phytophthora sansomeana, Phytophthora sojae, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora palmivora, Pythium ultimum var. ultimum, Phytopythium vexans, Phytopythium helicoides, och Pythium aphanidermatum) erhölls, DNA extraherades med hjälp av samma protokoll för konsistens och utvärderas av den nya LAMP assay med en positiv och negativ kontroll (Figur 4) för att bestämma specificitet av primers. Alla icke-målprover var negativa med hjälp av den optimerade 64 °C i 45 min. Detta observerades på realtidsförstärkning graf och avbildas på en 1% agaros gel i UV-ljus.
Figur 1: Diagram som visar de olika stegen som är involverade i Phytophthora capsici från en serieutspädning av en koncentrerad sporfjädring under laboratorieförhållanden. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Laboratorieoptimering av gränsen för detektion av Phytophthora capsici. (A) Konventionell PCR-analys utfördes med hjälp av specifika P. capsici primers på seriell spädning faktorer och visualiseras på 1% agaros gel. 1, Stege; 2-7, 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 sporer/mL, respektive och 7, negativ vattenkontroll. (B) LAMP assay seriell utspädningsfaktorer visualiseras på 1% agarosgel. 1-6, en minskande sporkoncentration: 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 sporer/mL och 7, negativ vattenkontroll. (C) LAMP resultat visualiseras med hjälp av det kolorimetrisk färgämne. 1-6, en minskande sporkoncentration: 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 sporer/mL och 7, negativ vattenkontroll. (D) LAMPresultat visualiserade på amplifieringsgrafen. Röd = 4,8 x 104, Mörkblå = 4,8 x 103, Orange = 4,8 x 102, Ljusblå = 2,4 x 102, Grön = 1,2 x 102 sporer/mL, Rosa = Negativ kontroll (andra Phytophthora arter), Gul = ddH2O. (E) En standardkurva som visar kvantifiering av de värden som visas i realtidsresultaten. Ln (Spore count) visas på X-axeln, och minuter till förstärkning på Y-axeln. (F) LAMP-analys med publicerad primer (Dong et al. 2015) om serieutspädningsfaktorer visualiserade på 1% agarosgel. 1-6, en minskande sporkoncentration: 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 sporer/mL och 7, negativ vattenkontroll. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Förstärkning av P. capsici DNA från olika platser. (A) LAMP resultat visualiseras på 1% agarosgel. 1, PC_TN1; 2, PC_TN2; 3, PC_FL1; 4,PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2; N, Negativ kontroll. Prov 1 och 2 isolerades från TN; prov 3 och 4 som isolerats från FL, prover 5 och 6 var isolerade från GA. ( B )Resultatvisualiseras med hjälp av det koloritiska färgämnet. 1, PC_TN1; 2, PCTN2; 3, PC_FL1; 4,PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2. (C) Resultat visualiserade på förstärkningsgrafen. Röd, PC_TN1; Orange, PCTN2; Gul, PC_FL1; Grön, PC_FL2; Mörkblå, PC_GA1; Ljusblå, PC_GA2; Rosa, negativ kontroll. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Specificitetsbestämning av LAMP-analys med hjälp av DNA från icke-målarter P. capsici. (A) LAMP-analysreaktion med besläktade icke-målarter på agarosgel och visualiserad på 1% agarosgel. L, Stege; 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Phytopythium vexans; 7, Negativ kontroll; 8, Phytophthora capsica. (B) LAMP resultat visualiseras med hjälp av det kolometriska färgämnet. 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Phytopythium vexans; 7, Negativ kontroll; 8, Phytophthora kapsici (C) LAMP resultat visualiseras på förstärkning graf. Röd = Phytophthora capcisi, alla andra icke-målarter prover var inte förstärks. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Bilder som visar provtagning och bearbetning av återvunnet vatten för detektering av Phytophthora capsici i fält. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 6: Resultat från på plats upptäckt av Phytophthora kapsici i bevattningsvattenkällor. (A) Agarose gel som visar resultat från LAMPförstärkningen av testat vatten från sju gård i Sydgeorgien. Provnamn från vänster till höger: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Negativ kontroll, N. (B) LAMPresultat visualiserade med hjälp av warmstart kolometrisk färgämne av fältprover: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Negativ kontroll, N. (C) Resultat från LAMP-amplifiering av fältprover med hjälp av graf. Röd: P1, Grön: P2, Lila: P3, Gul: P4, Blå: P5, Orange: P6, Rosa: P7, Negativ kontroll, N. (D) Agarose gel visar konventionella PCR resultat av förstärkningen med hjälp av specifika primers PC-1/PC-2 (notera än endast en plats testats positivt i jämförelse med tre i LAMP). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Pond namn | Län, delstat | Målgrödor för bevattning | IDENTIFIERING AV PCR | LAMP Upptäckt | Sjukdomshistoria (Y/N) |
| P1 | Tift, GA | Grönsaker | | + | N |
| P2 | Tift, GA | Grönsaker | - | - | N |
| P3 | Tift, GA | Grönsaker | - | - | N |
| P4 | Tift, GA | Grönsaker | + | + | N |
| P5 | Tift, GA | Grönsaker | - | - | N |
| P6 | Tift, GA | Grönsaker | - | + | N |
| P7 | Tift, GA | Grönsaker | - | - | N |
Tabell 1: Påvisande av bevattningsvatten från södra GA.
| Primer typ | Primer namn | Sekvens 5'-3' | Källkod | ||
| Lampa | PCA3-F3 | TGTGTGTGTGTKTTCGATCACACA | Denna studie | ||
| PCA3-B3 | TTTTTGCGTGCGTCCAGA | Denna studie | |||
| PCA3-FIP | GACACCAAGCACTCGTACTOGTTTTTAKAATTGTGCAGAGGGAGGA | Denna studie | |||
| PCA3-BIP | AGAACGAGTATTKÄGGCGGKKTTKTTAAAAAAAACCACCCG | Denna studie | |||
| PCA3-LF | TGTCGAATGGATTTGCGATCTT | Denna studie | |||
| PCA3-LB | ATACGCAGGTCATTTGACTGAC | Denna studie | |||
| Pcr | PC-1 | GTCTTGTACCCTATCATGGCG | Zhang m.fl., 2006 | ||
| PC-2 | CGCCACAGCAGGAAAAGCATT | Zhang m.fl., 2006 | |||
Tabell 2: Grundtagare som används i denna studie.
| Parametrar | Traditionella | Konventionell PCR | Lampa |
| Känslighet | Na | 4,8 X 102 sporer/ml | 1,2 X 102 sporer/ml |
| Tid | 2 veckor eller längre | 2-3 timmar (ej inklusive DNA-extraktion) | 30 min - 1 timme (ej inklusive DNA-extraktion) |
| Förberedelser | • Skapande av media • Bordläggning och isolering och • Att utforma en fälla |
• Spore-kollektion med hjälp av Filterpapper • DNA-extraktion och • PCR-analys |
• Spore-kollektion med hjälp av Filterpapper • DNA-extraktion och • LAMP-analys |
| Material | • Autoklav • Media och plattor • Inkubationsrum • Flöde huva • Aubergine • Mjölk låda |
• Termisk cycler • Agar gel • Gel Doc |
• Värmeblock eller • Genie III |
| Kostnad | $5.00 per fälla | $0.60 per reaktion | $0.75 per reaktion |
Tabell 3: Jämförelse av metoder för detektion av P. capsici.
Kompletterande Figur 1: Placering av Tift County, GA och prover av bevattningsvatten tas från olika platser inifrån staten. Positiva prover visades som röda prickar. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: Utformning av LAMP primer set. Pilar visar riktning på hur primers läses. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Testningen av bevattningsvatten för fytopatogener är ett avgörande steg för odlare som använder bevattningsdammar och återvunnet vatten27. Bevattning dammar ger en reservoar och grogrund för ett antal fytopatogener som överskott bevattningsvatten riktas från fältet till dammen som bär med sig några patogener som kan ha varitnärvarande 16,27. Den traditionella metoden för detektering av en växt patogener i en stor vattenkälla är att ställa in en bete för patogenen genom att använda mottagliga värdvävnad (t.ex. frukt, löv) upphängd i dammen och vänta på en infektion att äga rum, sedan ta bort frukt / blad och bekräfta diagnosen med mikroskopi eller molekylära metoder13,14. Dessa metoder är begränsande på grund av den tid som krävs för att köra detektionstestet (2 veckor eller längre), och den arbets- och utrustning som krävs. Dessutom krävs omfattande erfarenhet och kunskap inom visuell diagnos, patogen morfologi och taxonomi för korrekta resultat. Molekylära tekniker som PCR, qPCR, och DNA-hybridisering kräver betydligt kortare tid (3-4 h) än de traditionella metoderna för detektion; de kräver dock dyr utrustning och en laboratorieinställning. Dessutom tillåter dessa tekniker inte för bearbetning av stora volymer vatten. Serologiska analyser också, misslyckas i deras detektionsförmåga på grund av icke-mål positiva reaktioner, och inga artspecifika analyser för Phytophthora arter har utvecklats. Loop-medierad isotermisk förstärkning (LAMP) har nyligen använts som en på plats diagnos teknik för snabb och känslig detektering av flera patogener som analysen endast kräver en enda temperatur snarare än en termisk cycler28,29. LAMP kan köras i fält med hjälp av ett kolorimetriskt färgämne för visuell bekräftelse eller med hjälp av en realtidsförstärkningsmaskin för resultat på mindre än entimme 30.
Målet med detta experiment var att utveckla en snabb och känslig metod för att upptäcka förekomsten av Phytophthora capsici i vattenkällor antingen på plats eller i ett laboratorium. För att öka hastigheten på detektionen och för att bekämpa begränsningarna i de tidigare nämnda metoderna för att upptäcka P. capsici i bevattningsvatten, konstruerade vi en metod med hjälp av filterpapper för att fånga upp sporerna och extrahera deras DNA från en större volym vatten. Efter sporer fångades med hjälp av tekniken filtrerpapper och DNA extraherades, bekräftades förekomsten av patogenen baserat på en nydesignad LAMP primer som är specifika för P. capsici. Detektionskänslighet och specificitet jämfördes med hjälp av LAMP och PCR. I alla 3 replikationer och med alla de zoospore koncentrationer, LAMP var en snabbare och mer känslig detektionsmetod (Tabell 3). Denna metod begränsas inte genom att ha en liten provvolym som traditionella metoder, eftersom denna metod kan testas upp till 1 L vatten vid en enda tidpunkt, vilket ökar chanserna för patogendetektering. Det noterades vid testning att hälla bevattningsvatten långsamt genom Buchner tratten med en hastighet av högst 40 mL per sekund ökade sporfångst förmåga av filterpapper.
För att validera detektionsprotokollet togs även vattenprover från fältet där P. capsici misstänktes finnas förekommande (Tilläggssiffra 1) för att testa den utformade metoden med ett praktiskt scenario. Av de 7 lantbruk som testades var 3 positiva för förekomsten av P. capsici med hjälp av LAMP-analysen (Figur 6A-6C) medan endast en gård var positiv när man använde den konventionella PCR-analysen (Figur 6D), som visar LAMP som en känsligare analys för denna metod för att testa bevattningsvatten. Även om detta filter baserad LAMP assay kunde upptäcka DNA från en koncentration så låg som 1,2 x 102 zoospores/mL som var betydligt mindre än den ursprungliga känsligheten för denna analys (0,01 ng genomiskt DNA motsvarar ~ 5 sporer) med ofiltrerad zoospore suspension. Den tidigare LAMP-analysen av Dong et. al. (2015)20 var kört på samma serieutspädning och nivån på känsligheten var densamma (Bild 2F). Detekteringsnivån för en PCR-analys med ofiltrerad sporlösning har också visat en högre detektionsnivå (motsvarande ~10 sporer) som var mycket lik de tidigare PCR-baserade resultaten10. Spordetektionsgränsen för den traditionella betesmetoden för detektion kontrollerades inte eftersom en enda spor kunde orsaka infektion beroende på dess individuella förmåga. Den minskade känsligheten som finns i både LAMP- och PCR-analyser beror sannolikt på att vissa sporer som flyter genom eller runt filterpapperet, eller en gång fäst på filterpapperet, inte kan extraheras med 100% effektivitet. Trots detta nya LAMP och filtersystem kan bearbeta och analysera en mycket högre volym vatten än tidigare metoder och ger en högre nivå av specificitet och hastighet för in-field upptäckt.
Av de extraktionsmetoder som användes var magnetisk pärlbaserad extraktion den mest snabba och krävde inte användning av externa maskiner som en pärlvisp eller centrifug vilket gör den användbar för in-field extraktioner och komplimanger den bärbara funktionen av LAMP analysen. CTAB-baserade metoden gav den högsta koncentrationen av DNA men tog längsta tid, medan den kommersiella anläggningen DNA extraktionssats (t.ex. DNeasy) var andra i både tid krävs och DNA-koncentration förvärvas.
Med både CTAB och den kommersiella anläggningen DNA extraktionssats, under homogeniseringen av filtrerpapper noterades att homogenisering var mer framgångsrik och gav en högre koncentration om CTAB lösningen (eller extraktion buffert) lades till röret med de bitar av filterpapper innan pärla slå eller hand homogenisering påbörjas. Bead slå gjordes 3 gånger för en minut vardera, men vortexing och agitera röret i mellan varje runda var nödvändigt för fullständig homogenisering i alla extraktionsmetoder. Viktigt är att filterpapper är föremål för att fastna på sidorna eller botten av röret, så det är viktigt att se till att filterpapper är utanför väggarna så att det blir homogeniserad.
Den totala tiden som krävs för förstärkning är 90-120 min och kan enkelt göras i fältet för diagnos på plats. Denna filtermetod är också utformad för att filtrera betydande mängder vatten för att öka de möjliga chanserna för detektering av patogenen. Denna metod är också tillämplig på många patogener som kan ackumuleras i en vattenkälla, särskilt släkten som: Pythium, Phytophthora, Fusarium, och bakterier; den enda förändring som krävs kommer att vara utvecklingen av en lika specifik LAMP primer som fastställts för den riktadepatogenen 30.
En betydande produktion av detta arbete är utvecklingen av en mycket känslig och snabb filterpappersbaserad LAMP-analys för detektion av P. capsici i bevattningsvattenkällor. Vi förväntar oss att denna studie kommer att leda till en ökad medvetenhet om kontaminering av återvunnet bevattningsvatten, så småningom förbättra förvaltningen av Phytophthora associerade sjukdomar, och följaktligen minska produktionskostnaderna och öka skörden. Sådan information behövs i hög grad för att förbättra hållbarheten inom grönsaksproduktionen och öka lönsamheten för grönsaksproduktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja eller några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete fick ekonomiskt stöd från Georgia Commodity Commission for Vegetables projekt-ID# FP00016659. Författarna tackar Dr Pingsheng Ji, University of Georgia och Dr Anne Dorrance, Ohio State University för att ge rena kulturer av Phytophthora spp. Vi tackar också Li Wang och Deloris Veney för deras tekniska hjälp under hela studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
