Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En suppressor skjerm for karakterisering av genetiske koblinger regulere kronologisk levetid i saccharomyces cerevisiae

Published: September 17, 2020 doi: 10.3791/61506
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, William Paterson University

Summary

Her er en protokoll for å identifisere genetiske interaksjoner gjennom en økt kopi nummer suppressor skjerm i Saccharomyces cerevisiae. Denne metoden gjør det mulig for forskere å identifisere, klone og teste suppressors i kortvarige gjærmutanter. Vi tester effekten av kopinummerøkningen av SIR2 på levetid i en autofagi null mutant.

Abstract

Aldring er tidsavhengig forverring av kroppens normale biologiske prosesser som øker sannsynligheten for død. Mange genetiske faktorer bidrar til endringer i den normale aldringsprosessen. Disse faktorene krysser på komplekse måter, noe som fremgår av vell av dokumenterte koblinger identifisert og bevart i mange organismer. De fleste av disse studiene fokuserer på tap av funksjon, null mutanter som tillater rask screening av mange gener samtidig. Det er mye mindre arbeid som fokuserer på å karakterisere rollen som overuttrykk av et gen i denne prosessen. I det nåværende arbeidet presenterer vi en enkel metodikk for å identifisere og klone gener i den spirende gjæren, Saccharomyces cerevisiae, for studier i undertrykkelse av den kortvarige kronologiske levetiden fenotype sett i mange genetiske bakgrunner. Denne protokollen er utformet for å være tilgjengelig for forskere fra et bredt spekter av bakgrunner og på ulike akademiske stadier. SIR2-genet, som koder for en histondeacetylase, ble valgt for kloning i pRS315-vektoren, da det har vært motstridende rapporter om effekten på den kronologiske levetiden. SIR2 spiller også en rolle i autofagi, noe som resulterer når forstyrret via sletting av flere gener, inkludert transkripsjonsfaktoren ATG1. Som et bevis på prinsippet klone vi SIR2 genet for å utføre en suppressor skjerm på den forkortede levetid fenotype karakteristisk for autofagi mangelfull atg1Δ mutant og sammenligne den med en ellers isogenic, vill type genetisk bakgrunn.

Introduction

Aldring er det tidsavhengige tap av integritet i utallige biologiske prosesser som til slutt øker sannsynligheten for organismedød. Aldring er nesten uunngåelig for alle arter. På cellenivå er det flere godt karakteriserte kjennetegn som er forbundet med aldring, inkludert: genomisk ustabilitet, epigenetiske endringer, tap av proteostase, mitokondriedysfunksjon, deregulert næringsfølsomhet, cellulær senescence og telomere attrition1,2. I encellede organismer, som gjær, fører dette til en reduksjon i replikeringspotensial og kronologisk levetid3,4. Disse cellulære endringene manifesterer seg i mer komplekse organismer, som mennesker, som patologier som inkluderer kreft, hjertesvikt, nevrodegenerasjon, diabetes og osteoporose5,,6,,7. Til tross for de mange kompleksitetene som karakteriserer prosessen med aldring, er det bevaring av disse molekylære kjennetegnene som ligger til grunn for denne prosessen på tvers av vidt divergerendeorganismer 8,,9,,10. Identifisering av endringer i disse banene under aldring førte til erkjennelsen av at de kan manipuleres via livsstilsendringer - diettbegrensning er vist å forlenge levetiden betydelig i mangeorganismer 11. Disse veiene konvergerer og krysser hverandre og mange andre veier, på komplekse måter. Belysning og karakterisering av disse interaksjonene gir potensial for terapeutiske inngrep for å forlenge levetiden og helsen12,,13,,14.

Bevaring av molekylære underlag av aldring muliggjør funksjonell disseksjon av genetiske interaksjoner som ligger til grunn for prosessen gjennom bruk av enklere modellorganismer - inkludert i spirende gjær, Saccharomyces cerevisiae15,16. Det finnes to etablerte typer aldring modellert av spirende gjær: kronologisk aldring (kronologisk levetid, CLS) og replikerende aldring (replikerende levetid, RLS)17. Kronologisk aldring måler hvor lang tid en celle kan overleve i en ikke-skilletilstand. Dette er analogt med aldringen som ses i celler som tilbringer mesteparten av livet i G0, for eksempel nevroner4. Alternativt er replikeringslevetid antall ganger en celle kan dele seg før utmattelse og er en modell for mitotically aktive celletyper (f.eks. antall datterceller som en celle kan ha)18.

Det overordnede målet med denne metoden er å presentere en protokoll som gjør det mulig for funksjonell disseksjon av genetikken til aldring ved hjelp av S. cerevisiae. Mens det har vært mange gode studier utført av mange forskere som har ført til vår nåværende forståelse, er det fortsatt mange muligheter tilgjengelig for spirende forskere å bidra til aldringsfeltet fra tidlig i sin akademiske karriere. Vi presenterer en klar metodikk som gjør det mulig for forskere å fremme aldringsfeltet ytterligere. Denne protokollen er utformet for å være tilgjengelig for alle forskere uavhengig av scenen i sin akademiske karriere ved å gi verktøyene som er nødvendige for å formulere og teste sine egne nye hypoteser. Fordelen med vår tilnærming er at dette er en kostnadseffektiv metode lett tilgjengelig for alle forskere uavhengig av institusjon - og krever ikke dyrt, spesialisert utstyr som er nødvendig for noenprotokoller 19. Det er flere forskjellige måter å designe denne typen skjerm, tilnærmingen skissert i dette arbeidet er spesielt mottagelig for screening null mutanter av ikke-essensielle gener som viser en alvorlig reduksjon i kronologisk levetid sammenlignet med en isogenic vill-type stamme av gjær.

Som vårt bevis på prinsippet klone vi SIR2, en lysin deacetylase rapportert som viser både en utvidet og en forkortet CLS når overuttrykt. SIR2 overexpression ble nylig funnet å øke CLS i vinproduksjon gjær; Imidlertid har flere grupper rapportert ingen sammenheng mellom SIR2 og CLS forlengelse, forlater sin rolle under karakterisert20,21,22. På grunn av disse motstridende rapportene i litteraturen valgte vi dette genet til å legge til uavhengig forskning for å bidra til å klargjøre SIR2s rolle i kronologisk aldring, hvis noen. I tillegg øker kopinummeret til en SIR2 homolog levetid i et nematode orm modellsystem23.

Autofagi er et intracellulært nedbrytningssystem for å levere cytosoliske produkter, som proteiner og organeller, til lysosom24. Autofagi er nært knyttet til lang levetid gjennom sin rolle i nedverdigende skadede proteiner og organeller for å opprettholde cellulær homeostase25. Induksjon av autofagi avhenger av å orkestrere uttrykket av mange gener, og sletting av ATG1-genet resulterer i en unormalt kort CLS i spirende gjær26. ATG1 koder for en protein serine / threonine kinase som er nødvendig for vesikkeldannelse i autofagi og cytoplasma-til-vacuole (sopp lysosomal ekvivalent) vei27,28. Her presenterer vi vår metode for en økt kopi nummerskjerm, teste effekten av økt SIR2 kopi på CLS i en vill type og en atg1-null bakgrunn. Denne metoden er spesielt mottagelig for juniorforskere og forskningsgrupper ved primært lavere institusjoner, hvorav mange tjener samfunn underrepresentert i vitenskapen og har begrensede ressurser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Identifisere potensielle genetiske interaksjoner for screening

  1. Identifiser den genetiske bakgrunnen(e) for karakterisering, som resulterer i en unormalt kortert kronologisk levetid (CLS) i Saccharomyces cerevisiae ved hjelp av Saccharomyces Genome Database (SGD, https://www.yeastgenome.org29,30), som kompilerer kjent fenotypisk informasjon for denne organismen.
    1. Velg Funksjon-fanen fra alternativene øverst på nettsiden.
    2. Velg Fenotype etterfulgt av å velge Bla gjennom alle fenotyper.
    3. Fra gjærfenotype ontologi alternativer bla til utvikling underoverskrift og velg Kronologisk levetid, funnet under Levetid underoverskrift.
    4. Velg kvalifikatorenfor redusert , noe som gjør det mulig å identifisere gener som viser en fenotype som resulterer i en redusert kronologisk levetid fenotype når den slettes. For denne proof-of-method atg1Δ ble valgt, noe som resulterer i en kortvarig CLS fenotype og er forstyrret for autofagi26.
  2. Identifiser målgen(e) for å screene for genetiske interaksjoner som kan undertrykke fenotypen, basert på rapporterte eller forventede ontologiattributter, av mutanten identifisert i del 1.2. Gjenta fenotypesøket som finnes i trinn 1.1.1-1.1.4 ovenfor, og spør etter gener som resulterer i en lengre CLS når de er overuttrykt i en villtypebakgrunn. SIR2 ble valgt basert på den rapporterte CLS fenotypen og rapporterte interaksjoner med autofagi31,,32.

2. Klargjør reagenser

MERK: Med mindre annet er spesifisert autoklav hver oppløsning ved 121 °C i 20 min for å steriliseres før bruk.

  1. YPAD flytende media: Tilsett 1% gjær ekstrakt, 2% pepton, 2% dextrose (glukose), og 40 mg adenin (som adenin sulfat dehydrere) per liter dobbelt destillert vann. Bland godt med en magnetisk rører.
  2. LB flytende media: Tilsett Tryptone (10 g), Gjær ekstrakt (5 g), og natriumklorid (10 g) per liter dobbelt destillert vann. Bland godt med en magnetisk rører.
  3. Forbered 1000x (100 mg/ ml) ampicillin lager, i dobbelt destillert vann. Bland godt og filter steriliser.
  4. Syntetisk komplett – Leucin (SC-LEU) flytende medier: Tilsett 1,7 g gjær nitrogenbase m / o aminosyrer, 2% glukose, 1,92 g SC-LEU Dropout blanding, 5 g Ammoniumsulfat per liter dobbelt destillert vann. Bland godt med en magnetisk rører.
  5. TE-buffer: Bland Tris (10 mM endelig konsentrasjon), EDTA (1 mM endelig konsentrasjon) i løsningen med dobbelt destillert vann. Bland godt med en magnetisk rører.
  6. Forbered 50 % PEG 3350 i oppløsning med dobbelt destillert vann. Bland godt med en magnetisk rører.
  7. Forbered 1 M og 100 mM Lithium Acetate løsning med dobbelt destillert vann. Bland godt med en magnetisk rører.
    MERK: For å lage faste agarplater tilsett 20 g agar (per liter med dobbelt destillert vann) til mediet som er tilberedt i 2,1 og 2,2 over før autoklavering. Hvis du forbereder ampicillinplater, tilsett 1 ml av ampicillin til media i 2,2 ovenfor etter at den er avkjølt til omtrent 60 °C. Hell i sterile plater og la det stilles inn i 48–72 timer før bruk. Oppbevar platene ved 4 °C for lengre oppbevaring.

3. Design kloningsstrategien for å klone SIR2 inn i pRS315-vektoren

  1. Design PCR-primere for å forsterke SIR2-genet for kloning i pRS315-vektoren.
    1. Design primere manuelt for å ha 21-22 nukleotid komplementaritet til de intergene regionene oppstrøms og nedstrøms av SIR2. Sørg for at hele genet, sammen med de uoversettede områdene i mRNA, klones ved å kartlegge disse funksjonene fra de tilgjengeligedatasettene 33,34.
    2. Kontroller at PCR-primeren resulterer i fremre og motsatte primere som har en smeltetemperatur (Tm) over 53 °C og under 60 °C.
      MERK: Ideelt sett bør begge primere ha en Tm så nær hverandre som sekvens vil tillate, med et omtrentlig GC-innhold på mellom 40-50%, og sørg for å unngå dinucleotide repetisjoner og balansering av GC og AT-distribusjon gjennom hele sekvensen.
    3. Etter utformingen av PCR primere som vil tillate generering av amplicon for kloning, legge begrensning enzym fordøyelse (R.E.D.) mål områder til 5 'slutten av hver primer som er kompatible med plasmid-kloning vektor. I denne metoden, en HindIII begrensning enzym fordøyelsessted (5'-AAGCTT-3') legges til oppstrøms, fremover primer og en SacII begrensning enzym fordøyelsessted (5'-CCGCGG-3') legges til nedstrøms, omvendt primer.
      MERK: Bruken av stedene SacII og HindIII krever at konsensuskuttstedet for hver endonukleær ikke finnes i målgenet. Hvis et av enzymmålene i målgenet, bør alternative begrensningsenzymer velges. Det er mange som er kompatible med polylinkerområdet på pRS315-vektoren.
    4. Til slutt legger du til et fire nukleotid (5'-NNNN-3') sekvensoverheng til 5' enden av hver primer for å tillate restriksjonen enzymet å binde og fordøye amplicon. Når primerne er designet, har oligonucleotides kommersielt syntetisert for bruk kloning av SIR2 genet.
    5. Resuspensjon av PCR primere: Sentrifuge PCR primere ved hjelp av en bordplate mikrofuge ved maksimal hastighet i 4 min. Tilsett TE-oppløsning for å lage en lagerkonsentrasjon på 100 μM. Oppbevar lagerkonsentrasjonen ved -20 °C og fortynne 1/10 for bruk i PCR-applikasjoner.
      MERK: For å lage en 100 μM-lager, oppløs primerne i et volum steril TE-buffer som er 10x mengden nmoles i primerrøret, ved hjelp av mikroliter te. Hvis røret for eksempel inneholder 15,6 nmoles primer, legger du til 156 μL TE-buffer.
  2. Isoler villtype gjær gDNA for PCR forsterkning av SIR2 kloning konstruksjon.
    MERK: Flere alternativer av høy kvalitet er kommersielt tilgjengelige for å isolere gjærgDNA. Utnyttelse av et sett som inkluderer fordøyelsen av soppcelleveggen med zymolyase resulterer i bedre kvalitet gDNA (høyere utbytte, mindre urenheter). Protokollen nedenfor returnerer konsekvent høy konsentrasjon og renhet. Detaljer om et sett vi anbefaler finner du i Materials tabell.
    1. Vokse 5 ml kultur av vill-type gjær for 48-72 h til post-log fase i beriket media, for eksempel YPAD. Pellet gjærcellene på > 800 x g i 3 min ved romtemperatur, fjern vekstmediet og resuspend i 120 μL zymolyase fordøyelsesbuffer supplert med 5 μL zymolyase (2 enheter enzym / μL). Bland prøven ved å vortexing og inkubere ved 37 °C i 40 min.
    2. Tilsett 120 μL av en chaotropisk lysisbuffer (f.eks. guanidiniumklorid), 250 μL kloroform og vortex prøven for 60 s.
    3. Sentrifuge på > 8000 x g i 2 min og overføre supernatanten til en rensekolonne i et sterilt oppsamlingsrør.
    4. Sentrifuge på > 8000 x g for 60 s og kast strømmen gjennom. GDNA vil være bundet til kolonnematrisen.
    5. Vask kolonnen to ganger med 300 μL av en etanolbasert vaskebuffer, og gjenta sentrifugeringstrinnet ovenfra (3.2.4). Kast strømmen gjennom etter hvert spinn. Overfør kolonnen til et 1,5 ml mikrodrivstoffrør, tilsett 60 μL TE-buffer og inkuber ved romtemperatur i 60 s. Flash spinner prøven i 30 s for å elute DNA.
      MERK: Bestem konsentrasjonen av DNA i prøven (Absorbans ved 260nm) og kvaliteten (Absorbans 260nm/280nm). Et typisk utbytte vil være 100–200 ng/ μL gDNA med absorbansforhold ved 260nm/280nm så nær 1,8 som mulig.
  3. Forsterk og isolere pRS315 plasmid vektor for kloning.
    MERK: Flere alternativer av høy kvalitet er kommersielt tilgjengelige for rensing av plasmidvektorer. En silikabasert kolonnekjemi anbefales for dette trinnet. Endringene som er nevnt nedenfor har ført til den høyeste konsentrasjonen og renheten. Detaljer finnes i Materials tabell.
    1. Vokse en 5 ml kultur av E. coli som inneholder pRS315 vektor over natten i LB + ampicillin (80 μg / ml) media. Pellet kulturen ved sentrifugering på > 8000 x g for 2 min ved RT (15-25 °C).
    2. Re-suspendere pelleted bakterielle celler i 250 μL TE buffer med RNase A (100 μg / ml) og overføre til en mikrocentrifuge tube. Sørg for at ingen klumper av celler forblir.
    3. Tilsett 250 μL lysisbuffer og bland ved å snu røret 6–8 ganger. Inkuber i 5 min ved romtemperatur. Ikke la lysis fortsette i mer enn 5 min – litt mindre er å foretrekke.
    4. Tilsett 350 μL nøytraliseringsbuffer og bland umiddelbart og grundig ved å snu røret 10 ganger. Sentrifuge i 10 min ved >8000 x g.
    5. Overfør forsiktig det overnaturante ovenfra til en silikaspintkolonne ved å pipettering. Sentrifuge i 30 s og kast gjennomstrømningen.
    6. Tilsett 500 μL av en høy saltvaskbuffer og sentrifuge som i trinn 3.3.5. Kast gjennomstrømningen. Vask DNA-bindingsspintkolonnen ved å tilsette 750 μL av en etanolbasert vaskebuffer, for å fjerne restsalter og sentrifuge som i trinn 3.3.5.
    7. Kast strømmen gjennom og sentrifuge i ytterligere 2 min ved > 8000 x g for å fjerne rester vaskebuffer. Plasser spin-kolonnen i et rent, merket 1,5 ml mikrocentrifugerør. For å elute DNA, tilsett 20 μL TE-buffer til midten av spin-kolonnen, inkuber i 1 min ved romtemperatur og sentrifuge i 1 min ved > 8000 x g.
    8. Bruk et spektrofotometer for å bestemme mengden (Absorbans ved 260nm) og kvaliteten (Absorbans 260 nm/280 nm) av DNA. Et typisk utbytte vil være 1–2 μg/μL.
  4. PCR-forsterkning av kandidatgenet, SIR2, fra vilt-type genomisk DNA
    1. For å produsere en amplicon som er egnet for kloning, bruk en high-fidelity (HF) PCR polymerase for å unngå utilsiktet generering av mutasjoner i sekvensen som forsterkes.
      MERK: Mange forskjellige PCR-alternativer med høy kvalitet er kommersielt tilgjengelige. For å lette optimaliseringen av PCR-reaksjonsforholdene, bruk tobufferkombinasjon: en som er en standard HF-buffer og en optimalisert for høy GC og komplekse amplicons. Detaljer finner du i Materialse tabellen.
    2. PCR forsterker SIR2-konstruksjonen for kloning som beskrevet i tabell 1.
      MERK: For å maksimere suksessen i kloningstrinnene, kan flere identiske 50 μL settes opp og konsentreres av et PCR-kolonneoppryddingstrinn. Pass på å sette opp en ingen gDNA mal kontrollreaksjon (negativ kontroll).
    3. Definer PCR-sykkelforholdene som beskrevet i tabell 2.
      MERK: Ulike primerpar varierer på glødetemperaturen og forskjellige polymeraser fungerer ved forskjellige hastigheter. Sørg for å optimalisere forsterkningsforholdene basert på enzymet som er valgt og spesifikasjonene til primerkombinasjonen som utformet.
    4. Kontroller suksessen til PCR-reaksjonen ved å visualisere PCR-reaksjonen, som ville produsere et ca. 2,5 kb DNA-fragment, på en 1,0% TAE-agarose gel (med 0,5 μg / ml ethidiumbromid for visualisering).
  5. Fordøyelse og ligation av kandidatgenet, SIR2,inn i pRS315 plasmid vektor.
    1. Utfør begrensningsfordøyelsen av vektoren og innsatsen: 625 ng DNA (enten vektoren eller innsatsen), q.s. vann for å bringe det endelige reaksjonsvolumet til 50 μL, 5 μL buffer, 1 μL SacII og 1 μL HindIII. Inkuber restriksjonen fordøyelser ved 37 °C i 3 timer, etterfulgt av 80 °C i 20 min for å varme inaktivere enzymene. Digests kan lagres ved 4 °C før du går videre til neste trinn.
    2. Sett opp en 15 μL ligation reaksjon for å skape ønsket plasmid: 6 μL sterilt vann, 2 μL fordøyd vektor (50 ng DNA), 4 μL fordøyd innsats (100 ng DNA), 2 μL T4 reaksjonsbuffer, og 1 μL T4 DNA Ligase. Inkuber ligasjonsreaksjonene over natten ved 16 °C, etterfulgt av 80 °C i 20 min for å varme inaktivere enzymet.
      MERK: Sett opp en no insert-kontroll, og sett inn ytterligere 4 μL sterilt vann (10 μL totalt) i stedet for innsatsen.
    3. Forvandle ligation reaksjonene til E. coli.
      MERK: Det er mange alternativer tilgjengelig for kompetente celler som er tilgjengelige. Denne protokollen bruker kjemisk kompetente celler som oppbevares ved -80 °C før bruk.
      1. Tin et 50 μL rør med frosne, kompetente E. coli-celler på is til de bare tines og tilsett umiddelbart 15 μL av ligasjonsreaksjonen. Knips røret flere ganger. Umiddelbart returnere rørene til is og inkubere i 30 min.
      2. Varmstøt cellene i 20 s i et vannbad ved nøyaktig 42 °C, og returner umiddelbart rørene til is i en 2 min inkubasjon. Tilsett 450 μL romtemperaturgjenvinningsmedier (f.eks. SOC eller LB) i hver transformasjonsreaksjon og inkuber i 60 min ved 37 °C med risting.
      3. For hver transformasjonsreaksjon, gjør en 1:10 fortynning av celler. Ved hjelp av steril teknikk, plate 150 μL av de ufortynnede cellene og 1:10 fortynninger på LB + (80 μg / ml) ampicillin plater35. Inkuber platene ved 37 °C over natten.
  6. Screen potensielle transformanter for overuttrykk vektor.
    1. Ved hjelp av steril teknikk, inokulere potensielle transformanter som vokste til 5 ml LB + (80 μg / ml) ampicillin og vokse over natten. Etter prosedyren som er beskrevet i avsnitt 3.3.1–3.3.7 ovenfor, isolere plasmidene fra alle potensielle transformerende og skjerm for vellykket integrering av innsatsen ved begrensning fordøyelse etterfulgt av gel elektroforese på en 1,0% TAE-agarose gel (med 0,5 μg / ml ethidiumbromid for visualisering).

4. Forvandle vektoren til atg1Δ og vill type gjær stammer

MERK: Dette utføres ved hjelp av en modifisert litiumacetattransformasjonsprotokoll36.

  1. Pellet 15 ml vill type og atg1-null gjær celler dyrket over natten i YPAD media til tidlig til midten av log fase (O.D. 600nm = 0,4-0,9) av vekst i 3 min på > 800 x g ved romtemperatur.
  2. Dekanter det overnaturante, re-suspendere cellepellet i 1 ml steril ddH2O og overføre innholdet til en 1,7 ml mikrofuge rør. Pellet cellene i 3 min ved > 800 x g ved romtemperatur.
  3. Fjern supernatant og re-suspendere cellene i 250 μL av 100 mM litiumacetat med mild pipettering. Del cellene i separate mikrofuge rør for hver av transformasjonene du vil utføre. Bruk 50 μL av celle-litiumacetatblandingen per transformasjon.
  4. Konfigurer en transformasjonsblanding. Til hver av transformasjonene legger du til: 240 μL på 50% PEG3350, 36 μL på 1,0 M litiumacetat og 5 μL laksesperm (eller annen bærer) DNA, kokt i 5 min og på is.
    MERK: PEG er veldig viskøs. Pipette og mål forsiktig. Bland ved pipettering etter tilsetning av hver komponent før du går videre.
  5. Tilsett 5 μL av riktig plasmid for hver transformasjon utført. Vortex hvert rør for å blande grundig. Inkuber prøvene ved 30 °C i 45 min. Varmesjokkprøver ved 42 °C i 10 min.
  6. Pelletceller i 3 min ved > 800 x g ved romtemperatur, fjern forsiktig transformasjonsblandingen og re-suspendere prøver i 300 μL sterile ddH2O. Pellet celler ved å gjenta spinn ovenfor, forsiktig fjerne vann, og re-suspendere prøvene i 200 μL av sterile ddH2O.
  7. Sett opp 1/10 og 1/100 fortynninger for hver forvandlet stamme av gjær.
  8. Bruk steril teknikk plate 150 μL fra hver prøve på SC-leucin plater for å velge for plasmids. Spre cellene jevnt og jevnt og la platen tørke før invertering og inkubering ved 30 °C vokser i 48–72 timer.
    MERK: Når den aktuelle belastningen er generert, kan den oppbevares på lang sikt i 25 % glyserol ved -80 °C. Kvantifiseringen av kopinummer til stede kan bestemmes av flere metoder, inkludert qPCR, RNA-FISH eller et annet passende tiltak37,38.

5. Bestem den kronologiske levetiden som skal testes for forkortet CLS fenotypeundertrykkelse

  1. Test effekten av overuttrykk av putativ suppressor på CLS i kortvarig gjær, atg1Δ mutant, ved å bestemme antall kolonidannende enheter (CfUer) som forblir som en funksjon av tid39.
    MERK: Det er nødvendig å sette opp denne delen av eksperimentet med de riktige kontrollene. Et typisk eksperiment vil sammenligne en vill type (WT) stamme av gjær med den tomme vektoren, WT med suppressorvektoren, slettingmutanten med den tomme vektoren og slettingmutanten med suppressorvektoren.
    1. Ta en enkelt koloni av belastningen for å studere og inokulere den i SC-LEU media. Øk kulturen ved 30 °C i 72 timer, med risting.
    2. Ved hjelp av et hemocytometer, bestemme konsentrasjonen av celler som er tilstede i kulturen40.
    3. Fortynn et aliquot av kulturen, slik at resultatet er et jevnt antall celler i et 150 μL volum sterilt vann. Plate kulturen ved hjelp av steril teknikk på SC-LEU plater og vokse ved 30 ° C for 72 h. Disse platene er dagen tre tidspunkt og eksperimentet vil bli normalisert til dette tidspunktet som 100% levedyktighet39.
      MERK: Antall celler skal være 200–500, tilstrekkelig stort for analysen og et håndterbart tall for telling. I denne studien brukte vi 200 celler for vår plating mengde.
    4. Fortsett å inkubere gjærkulturene ved 30 °C, ta vanlige aliquots og plating som skissert i 5.1.3. Fortsett denne prosessen til stammene ikke lenger er levedyktige, og kompiler deretter og analyser resultatene.
      MERK: Den fullstendige listen over stammer som brukes i denne studien finnes i tabell 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som det er motstridende rapporter om rollen som SIR2 under aldring, valgte vi dette genet for studier som en potensiell suppressor av atg1Δ mutant forkorte CLS fenotype26. Rollen som SIR2 er noe kontroversiell, med motstridende rapporter om sin rolle i å utvide CLS, men det har vært klart knyttet til økt CLS i minst en gjær bakgrunn, med en rolle i både autofagi og mitophagy22,31,32,41.

Vårt valg av plasmid vektor er pRS315 shuttle vektor, som ble konstruert for enkel genetisk manipulasjon, forplantning, og vedlikehold i både spirende gjær og bakterier42. Denne vektoren inneholder LEU2 ernæringsmarkør, T7 og T3 arrangører, og er en centromeric(CEN) vektor for stabil passasje undercelledeling 42. Stabiliteten til denne vektoren på tvers av mititotiske celledelinger var mer ønskelig sammenlignet med isogene vektorer som var forskjellige med ernæringsmessigmarkør 42. PRS315-vektoren inneholder også en autonomt replikeringssekvens, som kombinert med CEN opprettholder lave, konsekvente plasmidnivåer innenfor (og på tvers) encellepopulasjon 43.

SIR2-genet og tilsvarende oppstrøms (5' UTR) og nedstrøms (3' UTR) genomiske regionens DNA-sekvens ble oppnådd33. For å sikre at det transkriberte genet inneholdt de nødvendige komponentene UTRs for stabilitet og oversettelse av proteinproduktet, var vårt første vindu +/- 400 bp. Dette vinduet utvidet til +/- 500bp basert på nukleotidsammensetningen i denne regionen, da vårt første vindu ikke resulterte i en region som bidrar til kloning. Vi designet PCR-primere som tillater forsterkning av genet og tilsvarende regulatoriske regioner, som omfatter restriksjonsfordøyelsessteder og et firekjerners overheng lagt til 5'slutten av hver primer (figur 1A). Vellykket forsterkning av denne regionen av PCR resulterer i et DNA-fragment 2.469 kb i lengde (figur 1B).

SIR2 ble forsterket av PCR, og produktene av denne reaksjonen ble visualisert ved agarose gel elektroforese og sammenlignet med en ingen mal kontrollreaksjon (figur 2). SIR2 forsterkning ble sett i begge kjørefelt med genomisk DNA-mal; de to reaksjonene ble samlet og konsentrert. Plasmid rensing av pRS315 fra E. coli ble utført, som ble visualisert ved agarose gel elektroforese (figur 3). Prøvene ble kvantifisert av spektrometri, og plasmid prep fra transformant #2 ble valgt for kloning, som hadde en konsentrasjon på 256 ng / μL (OD260/280 = 1,87).

Plasmid og innsatsen ble fordøyd med HindIII og SacII, ligated sammen, og forvandlet til E. coli for forsterkning og screening. Valget av disse restriksjonsfordøyelsesstedene krevde verifisering av at ingen av nettstedene er tilstede i regionen for å bli klonet. Tilstedeværelsen av ett (eller begge) steder ville kreve bruk av alternative begrensningsenzymer for å klone SIR2-genet, og det er flere å velge mellom i pRS315 polylinkerregionen42.

Vi screenet transformanter for vellykket etablering av pRS315-SIR2 vektor ved eksisjon av innsatsen ved dobbel fordøyelse med HindIII og SacII etterfulgt av visualiseringen på agarose gel (Figur 4). pRS315-SIR2 vektor ble forvandlet til både villtype og atg1Δ mutant for å generere stammene som brukes for CLS-karakterisering. PRS315 vektoren er en klassisk vektor som har blitt mye brukt og karakterisert, noe som er en av fordelene med dette systemet. Det relative kopinummeret ble bestemt av qPCR (figur 5) som tidligere beskrevet37. Dette resulterte i en beskjeden økning i kopinummer fra et gjennomsnitt på én kopi per celle til et gjennomsnitt på 2,5 eksemplarer per celle, i samsvar med tidligere rapporter42.

Den kronologiske levetiden til atg1Δ+pRS315-SIR2 ble sammenlignet med en isogen stamme av gjær som inneholder en tom vektor i stedet for en innsats (atg1Δ+pRS315). De aldrende kulturene ble belagt ved konsistente, tilsvarende fortynninger og ble dyrket i 72 timer ved 30 °C før bildebehandling og kvantifisering (figur 6A). Antall kolonier som danner enheter som vokste ble bestemt og normalisert til dag 3 tidspunkt (den første tatt) og plottet (Figur 6B). Vi rapporterer at det ikke er noen statistisk signifikant effekt av vår SIR2-konstruksjon på CLS i atg1Δ-bakgrunnen. I tillegg så vi ingen forlengelse av CLS i villtypebakgrunnen - hvor vår beskjedne SIR2-overuttrykk faktisk produserte en reduksjon i CLS sammenlignet med den tomme vektorkontrollen ( figur6B).

Figure 1
Figur 1: Konstruksjonens design for å klone SIR2. Den genomiske regionen flankert SIR2 genet ble brukt til å designe PCR primere for forsterkning og kloning av genet. Primere inneholder 21nt av komplementaritet til regionen 419 basepar oppstrøms av genet (FP) og 351 basepar nedstrøms av genet (RP), enten HindIII eller SacII begrensning fordøyelsesstedet, og en fire-nukleotid overheng (A). Skjematisk av amplicon skapt av PCR ved hjelp av primere designet for kloning av SIR2 genic regionen, sammen med tilsvarende størrelser (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: PCR-forsterkning av SIR2-genet visualisert ved gelelektroforese. Produktene av en high-fidelity PCR reaksjon for å forsterke SIR2 genet ble visualisert på en 1% agarose gel (med ethidiumbromid). Dupliserte reaksjoner ble utført ved hjelp av gjær gDNA som mal (+) og sammenlignet med en ingen malkontroll (-). Den forventede ampliconstørrelsen er 2,469 kb. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Visualisering av pRS315 vektor ved gelelektroforese. Dupliserte rensede plasmidreaksjoner ble utført og visualisert på en 1% agarose gel (med ethidiumbromid). Størrelsen på pRS315 vektoren er 6.018 kb. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Screening for pRS315-SIR2 vektor ved gelelektroforese. Potensielle transformanter som inneholder pRS315-SIR2 vektoren ble fordøyd med HindIII og SacII, og deretter visualisert på en 1% agarose gel (med ethidiumbromid). Vellykket opprettelsen av vektoren vil gi et bånd på 5.963 kb (pRS315 ryggraden) og 2.461 kb (SIR2 genet). To potensielle transformanter ble sammenlignet med en tom vektorkontroll. Transformant #1 viser mønsteret som forventes av pRS315-SIR2 vektor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: PRS315-SIR2-vektoren øker SIR2-kopinummeret i en vill type gjærbakgrunn. Antallet SIR2-kopier som finnes i den ville genetiske bakgrunnen ble bestemt av kvantitativ PCR. Verdiene ble beregnet ved hjelp av metoden 2-ΔΔCt med ACT1 valgt som en internkontroll44. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Den kronologiske levetiden til atg1Δ+pRS315-SIR2. CLS ble bestemt ved kvantifisering av antall levedyktige kolonidanneenheter som en tidsfunksjon. Aldringskulturer av gjær ble fortynnet til 500 celler / plate og dyrket i 72 timer ved 30 ° C før avbildning (A). Data ble normalisert til dagen tre tidspunkt og plottet for visualisering (B). EV er tom vektor (pRS315 uten innsats) og SIR2O/E inneholder innsatsen (pRS315-SIR2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Komponent Endelig konsentrasjon
Kjernefritt vann Q.S. til endelig volum
Buffer 1.
DNTPs (konk: 10mM) 200uM Leilighet
Primer forover (konk: 10μM) 0,5 μM
Omvendt Primer (conc: 10μM) 0,5 μM
Mal gDNA 100-200ng
HF polymerase 1 enhet / 50μL PCR

Tabell 1: PCR-reaksjonskomponenter.

Trinn Temp Tid
Innledende denning 98 °C (andre) 2mins
Sykling 98 °C (andre) 30s
(35 sykluser) 53-60 °C (primer spesifikk) 30s
72 °C 30-tallet per kB
Endelig utvidelse 72 °C 5-10m leilighet
Holde 10 °C Uendelige

Tabell 2: PCR-sykkelforhold.

Belastning: Overordnede: Ploidy:
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 + pRS315 (LEU vektor) VED Å4741 Haploid
MATa hans3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 + pRS315-SIR2 O/E (LEU vektor) VED Å4741 Haploid
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0atg1Δ + pRS315 tom vektor (LEU vektor) VED Å4741 Haploid
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0atg1Δ + pRS315-SIR2 O/E (LEU vektor) VED Å4741 Haploid

Tabell 3: Stammer som brukes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Å løse genetikken til aldring er en vanskelig utfordring, med mange muligheter for videre studier som potensielt kan gi betydelig innsikt i de komplekse interaksjonene som finnes. Det finnes mange metoder som tillater rask generering av tap av funksjonmutanter for studiet av nullstammer av gjær45,46. Denne metoden presenterer en enkel tilnærming til å identifisere og klone gener på pRS315 vektor for overexpression suppressor studier. En fordel med denne tilnærmingen er at dette gir en moderat overuttrykk fra en stabil vektor, som kan unngå uforutsette utfordringer som kan oppstå ved bruk av en kromosomintegrasjon47. Denne tilnærmingen presenteres på en måte som vil oppmuntre til rekruttering av forskere på ulike nivåer av sin vitenskapelige karriere, med mange av forfatterne på denne publikasjonen bidrar gjennom identifisering og kloning av antatte suppressors som en del av deres utdanning.

I dette arbeidet viser vi hvordan du bruker det vell av data som er tilgjengelige utarbeidet i Saccharomyces genomdatabasen for å identifisere en ønsket fenotype, i dette tilfellet genetiske koblinger til en endret kronologisk levetid. Vi klonet SIR2 inn i pRS315 vektor for å teste effekten av moderat overuttrykk på CLS av kortvarig autofagi mangelfull mutant, atg1Δ. Gjennom en 17-dagers aldring tidskurs var det ingen effekt sett på CLS i autofagi mutant og en mer akselerert CLS sett i vill-type bakgrunn. Dette kan tolkes som den beskjedne kopinummerøkningen i SIR2 ikke har noen effekt på CLS i atg1Δ mutant bakgrunn. Siden ATG1 er en transkripsjonsfaktor som er nødvendig for å indusere autofagi, er våre konklusjoner begrenset til initiering av autofagiveien. I tillegg ser vi ikke en økning på CLS i vår ville type genetisk bakgrunn - kanskje tyder på at CLS utvide fenotyper for å øke kopinummeret sir2 kan være spesifikk for visse genetiske bakgrunner og er ikke allestedsnærværende.

De kritiske trinnene i denne protokollen inkluderer riktig utforming av SIR2-konstruksjonen for å klone, og de riktige forholdene for å optimalisere ligation. Feilsøking av disse trinnene kan være nødvendig for å klone et gen for karakterisering via CLS-analysen. En begrensning av denne tilnærmingen er at den velger for celler som beholder plasmid, og som kan gå inn i cellesyklusen igjen. Selv om dette er en markør for fitness, er det viktig for oppfølgingsstudie ved hjelp av komplementære tilnærminger for å dissekere den aldrende fenotypen. Dette kan omfatte kvantifisering av celle levedyktighet ved vital fargestoff farging samt tilnærminger som ikke er avhengige av plasmid oppbevaring. Det finnes gode metoder tilgjengelig som viser ytterligere karakterisering av CLS gjennom kvantifisering av utveksten av eldre celler eller karakterisering av replikerende levetid48,49,,50. I tillegg er vår tilnærming begrenset til identifisering av interaksjoner som ikke er dødelige, og det ville være utfordrende å skille et mislykket forsøk på å klone et gen med et vellykket forsøk på å klone et gen som resulterer i en dødelig fenotype.

Vår tilnærming er nyttig for identifisering av gentilseende genetiske interaksjoner for videre studier. Det er enkelt og enkelt, og så langt brukte vi denne tilnærmingen til å klone SIR2, AIF1, UBI4og MDH1 og er i ferd med å følge opp studier med hver av disse konstruksjonene. Denne teknikken kan brukes til å karakterisere en rekke genetiske interaksjoner ved å følge protokollen omrisset i dette arbeidet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.

Acknowledgments

James T. Arnone ønsker å anerkjenne støtte fra studentene i Recombinant DNA Technologies kurset i 2017 og 2018 ved William Paterson University som var involvert i dette prosjektet fra starten, men hvis innsats ikke krysset terskelen for forfatterskap: Christopher Andino, Juan Botero, Josephine Bozan, Brenda Calalpa, Brenda Cubas, Headtlove Essel Dadzie, Irvin Gamarra, Preciousgift Isbor , Wayne Ko, Nelson Mejia, Hector Mottola, Rabya Naz, Abdullah Odeh, Pearl Paguntalan, Daniel Raza'e, Gabriella Rektor, Aida Shono og Matthew So. Dere er gode forskere, og jeg savner dere alle!

Forfatterne ønsker å anerkjenne uvurderlig støtte fra instruksjons- og forskningsteknologi ved William Paterson University for deres hjelp: Greg Mattison, Peter Cannarozzi, Rob Meyer, Dante Portella og Henry Heinitsh. Forfatterne ønsker også å anerkjenne Provost-kontoret for ART-støtte, Dekanus kontor og Senter for forskning ved College of Science and Health deres støtte til dette arbeidet, og Institutt for biologi for å støtte dette prosjektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungal/Bacterial DNA kit Zymo Research D6005
HindIIIHF enzyme New England Biolabs R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530S
Plasmid miniprep kit Qiagen 12123
SacII enzyme New England Biolabs R0157S
Salmon sperm DNA Thermofisher AM9680
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
  3. Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
  4. Longo, V. D., Fabrizio, P. Aging Research in Yeast. , Springer. 101-121 (2011).
  5. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  6. Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
  7. Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
  8. Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
  9. Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
  10. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
  11. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  12. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
  13. Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351 (2016).
  14. Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
  15. Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
  16. Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
  17. Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
  18. He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
  19. Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  20. Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
  21. Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
  22. Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1 (2013).
  23. Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
  24. Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
  25. Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790 (2019).
  26. Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
  27. Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
  28. Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
  29. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
  30. Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
  31. Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
  32. Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
  33. Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
  34. De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
  35. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064 (2012).
  36. Gietz, R. D., Woods, R. A. Methods in Enzymology. 350, Elsevier. 87-96 (2002).
  37. Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502 (2017).
  38. McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382 (2013).
  39. Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
  40. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
  41. Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
  42. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  43. Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
  44. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
  45. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  46. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  47. Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
  48. Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156 (2009).
  49. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209 (2009).
  50. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143 (2013).

Tags

Genetikk Utgave 163 kronologisk aldring autofagi SIR2 lysine deacetylase suppressor skjerm Saccharomyces cerevisiae kopi nummer skjerm
En suppressor skjerm for karakterisering av genetiske koblinger regulere kronologisk levetid i <em>saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dix, C., Sgro, S., Patel, A.,… More

Dix, C., Sgro, S., Patel, A., Perrotta, C., Eldabagh, N., Lomauro, K. L., Miguez, F. W., Chohan, P., Jariwala, C., Arnone, J. T. A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (163), e61506, doi:10.3791/61506 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter