的 本方案旨在利用最新版本的分裂荧光素酶互补实验，在活体哺乳动物细胞中展示高尔基体驻留型III类膜蛋白之间发生的异源相互作用，这些膜蛋白具有胞质暴露的N端和/或C端。
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本文内容
摘要
摘要
本实验方案旨在探讨最新版分裂荧光素酶互补技术在验证核苷酸糖转运蛋白（NSTs）形成异源复合物方面的适用性。这些定位于内质网和高尔基体的多跨膜蛋白可将细胞质中合成的核苷酸糖转运通过细胞器膜，为介导糖基化反应的酶提供底物。NSTs 以二聚体和/或更高阶寡聚体形式存在。不同 NST 之间可发生异源相互作用。 也已有不同NST的报道。为了验证该技术是否适用于研究NST异源寡聚化现象，我们采用此前已通过多种其他方法证实能够相互结合的两种高尔基体定位的NST进行测试。 荧光素酶互补实验似乎特别适用于研究高尔基体驻留膜蛋白之间的相互作用，因为它不需要高表达水平，而高表达通常会导致蛋白质错误定位，并增加假阳性结果的风险。
引言
本文描述了一种逐步操作方案，用于检测瞬时转染的人源细胞中高尔基体定位的III型膜蛋白之间是否存在异源相互作用，该方法采用最新版本的分裂荧光素酶互补检测技术。该实验流程已针对核苷酸糖转运蛋白（NSTs）进行了最广泛的验证，但我们也成功获得了其他高尔基体定位的III型膜蛋白的阳性结果，这些蛋白的N端和/或C端朝向细胞质。
我们的研究小组致力于探索NST在大分子糖基化中的作用。NST是定位于高尔基体和/或内质网的III型膜蛋白，其N端和C端均朝向细胞器膜的胞质侧1. NSTs 被认为可将核苷酸活化的糖跨过细胞器膜转运，从而为糖基转移酶提供底物。NSTs 可形成二聚体 和/或高级寡聚体2,3,4,5,6,7,8,9,10此外，异源....
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方案
1. 表达质粒的构建
- 使用拓扑预测工具分析目标蛋白的膜拓扑结构。
- 设计克隆策略，使得融合蛋白插入高尔基体膜后，较大的片段和较小的片段均朝向胞质侧。如果情况如此，例如 此处展示的感兴趣蛋白的N端和C端均为胞质朝向，可通过八种可能的方式对这些蛋白进行标记（参见 图1B）。如果目标蛋白之一或两者的N端或C端为腔内定位，则不应在其上添加标签。
- 将目的基因亚克隆至合适的表达载体中（参见 材料表按照标准的克隆实验方案进行。
注意：建议测试所有可能的方向，因为某些标记选项可能由于距离不足、方向不理想或空间限制而无法发挥作用。
2. 将表达质粒瞬时转染入细胞
- 通过胰酶消化收获贴壁生长的 HEK293T 细胞，并将细胞重悬于专用的完全培养基中。将细胞以每孔 100 µL 含 2 × 104 个细胞的密度接种至透明底、白色侧壁的 96 孔板中。根据所有待测组合及对照组（包括重复组）的数量调整所需孔数。
注意：建议仅使用板的内圈 60 个孔，以减少温度波动并避免过夜培养时发生蒸发。强烈推荐使用多聚-D-赖氨酸包被的 96 孔板（如材料表中所列产品），否则细胞可能在后续洗涤步骤中脱落。 - 在标准条....
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结果
为了在此方法中获得最可靠的数据，应测试所有可能的组合（见图1）。同时，应设置阳性和阴性对照。阳性对照应包含两种已知能够相互作用的蛋白质，其中一种与较大的片段融合，另一种与较小的片段融合。阴性对照理想情况下应包含两种同样标记但不相互作用的III型跨膜蛋白。然而，建立此类对照可能存在挑战，因为必须通过多种替代方法充分验证这两种对照蛋白之间确实不存在相互作用。因此，如果待检测相互作用的蛋白质的N端和/或C端位于胞质侧（如本例所示），可选用一种非人源的胞质蛋白（例如HaloTag）作为阴性对照，该蛋白预期不会与任何人源蛋白发生相互作用。我们强烈建议通过共表达目标蛋白中任一种的未标记变体并结合相应质粒的滴定实验，对使用此类阴性对照获得的结果进行额外验证。如果两种蛋白质特异性相互作用，则任一蛋白若缺失荧光素酶片段，均会导致发光信号特异性下降。
阳性和阴性组合典型的相对发光单位（RLU）值列于表1中。这些结果针对两种NST蛋白SLC35A2和SLC35A3获得，此前已通过共免疫沉淀和FLIM-FRET<.......
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讨论
本文提供了一种详细的实验方案，用于通过分裂荧光素酶互补分析法检测高尔基体驻留型III类膜蛋白（如NSTs）之间形成的异源复合物。所建议的数据分析与解释方法，是将目标蛋白组合所获得的发光信号，与相应的对照组合所获得的发光信号进行比较。该对照组合包含一个目标蛋白与较大片段融合，以及一个来源于细菌的对照蛋白与较小片段融合。后者在哺乳动物细胞的细胞质中表达； 因此，若以其作为参照，则要求待分析相互作用的蛋白的N端和/或C端位于高尔基体膜的细胞质侧。
实验方案中的关键步骤包括质粒设计、接种待转染细胞、转染操作、换液、呋喃荧光素工作液的配制以及将其加入细胞中。质粒设计应确保两个荧光素酶片段均朝向细胞质，否则对照组合将无法发挥作用，导致参考的相对光单位（RLU）值缺失。待转染细胞的接种应严格按照方案所述进行，否则可能导致转染效率不理想。我们建议使用表面涂有聚-L-赖氨酸的多孔板，以在换液过程中维持细胞贴壁。最后，呋喃荧光素工作液应现配现用，并立即加入细胞中。一旦加入后，应尽快进行信号检测。
为避免得出不明确的结果，实验中应始终设置.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由波兰克拉科夫国家科学中心（NCN）资助，项目编号为2016/23/D/NZ3/01314。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | |||
| 贴壁哺乳动物细胞系 | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96 孔白色/透明平底 TC 处理微孔板（带盖） | Corning | 356651 | |
| 细胞培养离心机 | |||
| 细胞培养添加剂（热灭活胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素） | |||
| CO2 培养箱 | |||
| 编码目标蛋白但未融合 NanoBiT 片段的表达质粒 | |||
| FuGENE HD 转染试剂 | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover 微孔板检测仪（或其它化学发光微孔板检测仪） | Promega | GM3000 | |
| 适用于所用细胞系的生长培养基 | |||
| 标准分子克隆所需材料与试剂（细菌、耐热 DNA 聚合酶、限制性内切酶、DNA 连接酶、核酸纯化相关材料与试剂） | |||
| NanoBiT MCS 起始系统 | Promega | N2014 | 该试剂盒包含可在不同方向上将目标蛋白与 NanoBiT 片段融合的载体，以及编码 HaloTag 蛋白与 SmBiT 融合蛋白的对照质粒和一对阳性对照质粒。 |
| Nano-Glo 活细胞检测试剂盒 | Promega | N2011 | 该试剂盒包含呋喃嗪（furimazine），其为可在活细胞中检测 NanoLuc 活性的底物，以及专用稀释缓冲液。 |
| Opti-MEM I 低血清培养基（无酚红） | Gibco | 11058021 | |
| 轨道摇床 | |||
| 数据分析软件（例如 GraphPad Prism） | |||
| PCR 仪 |
参考文献
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B.
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