Summary
Het hier gepresenteerde protocol is bedoeld om het optreden van heterologe interacties tussen Golgi-residente type III membraaneiwitten met cytoplasmatisch blootgestelde N- en/of C-termini in levende zoogdiercellen aan te tonen met behulp van de meest recente variant van de split luciferase complementatie assay.
Abstract
Het doel van dit protocol is om de toepasbaarheid te onderzoeken van de meest recente variant van split luciferase complementatie voor het aantonen van heterologe complexen gevormd door nucleotide suikertransporters (NST's). Deze ER- en Golgi-residente multitransmembraaneiwitten dragen de cytoplasmatisch gesynthetiseerde nucleotidesuikers over organelmembranen om enzymen te leveren die glycosylering bemiddelen met hun substraten. NST's bestaan als dimeren en/of hogere oligomeren. Heterologe interacties tussen verschillende NST's zijn ook gemeld. Om te verifiëren of de techniek geschikt is voor het bestuderen van het fenomeen van NST-heteromerisatie, hebben we het getest tegen een combinatie van de twee Golgi-residente NST's waarvan eerder is aangetoond dat ze op verschillende andere manieren associëren. De luciferase-complementatietest lijkt bijzonder geschikt te zijn voor het bestuderen van interacties tussen Golgi-residente membraaneiwitten, omdat het geen hoge expressieniveaus vereist, die vaak eiwitmislokalisatie veroorzaken en het risico op valse positieven verhogen.
Introduction
Dit manuscript beschrijft een stap-voor-stap protocol om te controleren op de aanwezigheid van heterologe interacties tussen Golgi-residente type III membraaneiwitten in tijdelijk getransfecteerde menselijke cellen met behulp van de meest recente variant van de split luciferase complementatie assay. De procedure is het meest uitgebreid getest tegen nucleotide suikertransporters (NST's), maar we konden ook positieve resultaten behalen voor andere Golgi-residente type III-membraaneiwitten waarvan de N- en / of C-termini tegenover het cytoplasma staan.
Onze onderzoeksgroep onderzoekt de rol van NST's bij glycosylering van macromoleculen. NST's zijn Golgi- en/of ER-residente type III membraaneiwitten met N- en C-termini naar de cytoplasmatische kant van het organellaire membraan1. Van NST's wordt gedacht dat ze nucleotide-geactiveerde suikers over organelmembranen dragen om glycosyltransferasen van hun substraten te voorzien. NST's vormen dimeren en/of hogere oligomeren2,3,4,5,6,7,8,9,10. Bovendien zijn er ook heterologe interacties tussen verschillende NST's gemeld6,11. NST's bleken ook complexen te vormen met functioneel gerelateerde glycosylatie-enzymen12,13,14. We zochten naar een alternatief voor de momenteel gebruikte techniek, fluorescence lifetime imaging (FLIM)-gebaseerde FRET-benadering, voor het bestuderen van interacties van NST's en functioneel gerelateerde Golgi-residente eiwitten, dus besloten we om de split luciferase complementatie assay te testen. Het stelde ons in staat om een nieuwe interactie te identificeren tussen een NST en een functioneel gerelateerd glycosylatie-enzym9.
De meest recente wijziging van de split luciferase complementatie assay, NanoBiT, wordt gebruikt in het protocol dat hier wordt gepresenteerd15. Het is afhankelijk van de reconstitutie van het luciferase-enzym (bijv. NanoLuc) uit de twee fragmenten - de grote, aangeduid als grote BiT of LgBiT, een 17,6 kDa-eiwit, en de kleine, samengesteld uit slechts 11 aminozuren, aangeduid als kleine BiT of SmBiT. De twee eiwitten van belang zijn versmolten met de complementaire fragmenten en tijdelijk tot expressie gebracht in een menselijke cellijn. Als de twee fusie-eiwitten op elkaar inwerken, wordt in situ een luminescentie geproduceerd na toevoeging van een celdoorlatend substraat. Deze twee fragmenten zijn geoptimaliseerd zodat ze zich associëren met minimale affiniteit, tenzij ze worden samengebracht door een interactie tussen de eiwitten van belang waarmee ze zijn gefuseerd.
Over het algemeen hebben op bioluminescentie gebaseerde methoden enkele voordelen ten opzichte van methoden die gebaseerd zijn op fluorescentie. Bioluminescente signalen hebben een hogere signaal-ruisverhouding omdat de achtergrondlumescentie verwaarloosbaar is in vergelijking met het luciferase-afgeleide signaal16. Fluorescentie-gebaseerde benaderingen daarentegen lijden meestal aan een relatief hoge achtergrond veroorzaakt door het fenomeen van autofluorescentie. Bovendien is bioluminescentie minder schadelijk voor de geanalyseerde cellen dan fluorescentie, omdat het in het eerste geval niet nodig is om het monster te prikkelen. Om die redenen concurreren bioluminescente benaderingen voor het bestuderen van PPI's in vivo met de veelgebruikte fluorescerende methoden zoals Förster Resonance Energy Transfer (FRET) of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).
Ons protocol is gebaseerd op verwijzende luminescentie verkregen voor de eiwitcombinatie die van belang is voor luminescentie verkregen voor de controlecombinatie. De laatste omvat een van de geteste eiwitten die is gefuseerd met een groter fragment en een controle-eiwit (bijv. HaloTag), gefuseerd met een kleiner fragment. De laatste is een eiwit van bacteriële oorsprong waarvan niet wordt verwacht dat het interageert met een van de eiwitten van zoogdieren. Het gebruik van dit eiwit als controle stelt beperkingen aan de topologie van de Golgi-residente paren van eiwitten die moeten worden geanalyseerd. Omdat in zoogdiercellen dit eiwit wordt gesynthetiseerd in het cytoplasma, moeten beide eiwitten van belang ten minste één cytoplasmatische staart hebben.
Deze aanpak kan met name nuttig zijn voor de eerste screening van PPI's. Het kan de voorkeursmethode worden wanneer de fusie-eiwitten van belang worden uitgedrukt op niveaus die eenvoudigweg onvoldoende zijn om andere benaderingen toe te passen. Evenzo kan de split luciferase-complementatietest de beste optie zijn als de eiwitten van belang op hoge niveaus tot expressie komen, maar dit heeft een negatieve invloed op hun subcellulaire lokalisatie of het is bekend dat het niet-specifieke interacties forceert. Omdat het kleinere fragment slechts 11 aminozuren bevat, kan de split luciferase complementatietest worden toegepast wanneer het gebruik van grotere tags onmogelijk is. Ten slotte kan het worden gebruikt om gegevens die zijn verkregen met behulp van andere technieken verder te bevestigen, zoals in het hier gepresenteerde geval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie van expressieplasmiden
- Onderzoek de membraantopologie van de eiwitten van belang met behulp van een topologie voorspellende tool.
- Ontwerp de kloonstrategie zo dat de grotere en kleinere fragmenten het cytoplasma onder ogen zien zodra de fusie-eiwitten in Golgi-membranen zijn ingebracht. Als, zoals in het hier gepresenteerde geval, zowel N- als C-termini van de betrokken eiwitten cytoplasmatisch georiënteerd zijn, tag de eiwitten dan op acht mogelijke manieren (zie figuur 1B). Als N- of C-terminus van een of beide eiwitten van belang luminaal georiënteerd is, sluit het dan uit van tagging.
- Subclone de genen van belang in geschikte expressievectoren (zie Tabel van materialen) door het volgen van standaard kloonprotocollen.
OPMERKING: Het testen van alle mogelijke oriëntaties wordt aanbevolen, omdat sommige taggingopties mogelijk niet werken vanwege onvoldoende nabijheid, suboptimale oriëntatie of ruimtelijke beperkingen.
2. Voorbijgaande transfectie van de expressieplasmiden in de cellen
- Oogst de aanhangende HEK293T-celcultuur door trypsinisatie en resuspend de cellen in een speciaal volledig groeimedium. Plaats de cellen (2 x 104/100 μL/put) op een heldere bodem, witte kant 96-well plaat. Pas het totale aantal putten aan om plaats te bieden aan alle geteste combinaties en controles, inclusief replicaties.
OPMERKING: Probeer alleen de binnenste 60 putten van de plaat te gebruiken om thermische verschuivingen te minimaliseren en nachtelijke verdamping te voorkomen. Het gebruik van met poly-D-lysine gecoate platen wordt ten zeerste aanbevolen, zoals aangegeven in de tabel met materialen, anders kunnen cellen losraken tijdens de volgende wasstappen. - Kweek de cellen 's nachts in standaardomstandigheden (37 °C, 5% CO2).
- Transfecteer de cellen de volgende dag met de gewenste combinaties van expressieplasmiden die zijn verkregen in punt 1.1.
- Verdun expressieplasmiden in een serumvrij medium (zie materiaaltabel) tot 6,25 ng/μL voor elk construct.
- Voeg het op lipiden gebaseerde transfectiereagens toe met een geschikte lipide-DNA-verhouding en incubeer volgens de instructies van de fabrikant.
- Voeg 8 μL lipide:DNA-mengsel toe aan aangewezen putjes. Meng de inhoud van de plaat door voorzichtig te draaien. Dit resulteert in transfectie van beide expressieconstructen bij 50 ng/put.
- Kweek de cellen gedurende 20-24 uur in standaardomstandigheden (37 °C, 5% CO2).
OPMERKING: Het kweken van de cellen voor een langere tijd kan resulteren in hogere niveaus van fusie-eiwitexpressie, wat een niet-specifieke associatie tussen de fragmenten kan bevorderen.
3. Middelgrote uitwisseling
- Vervang de volgende dag het geconditioneerde medium door 100 μL van een serumvrij medium in elke put. Zorg ervoor dat de cellen niet zijn losgekomen bij medium uitwisseling.
OPMERKING: Deze stap moet 2-3 uur vóór de toevoeging van de furimazine-werkoplossing worden uitgevoerd. Serumontwenning minimaliseert achtergrond veroorzaakt door autoluminescentie van furimazine.
4. Bereiding van furimazine werkoplossing
- Meng vlak voor de meting 1 volume furimazine met 19 volumes van een verdunningsbuffer (een 20-voudige verdunning).
OPMERKING: Het totale volume van de te bereiden furimazine-werkoplossing hangt af van het aantal individuele putjes dat moet worden geanalyseerd (de furimazine-werkoplossing wordt in een verhouding van 1:5 aan het celkweekmedium toegevoegd, daarom moet aan elke put die eerder is gevuld met 100 μL van een serumvrij medium 25 μL van de furimazine-werkoplossing worden toegevoegd). - Voeg de furimazine-werkoplossing toe aan aangewezen putten (25 μL/putje). Meng de plaat voorzichtig met de hand of met behulp van een orbitale shaker (bijvoorbeeld 15 s bij 300-500 tpm).
5. Luminescentie meten
- Plaats de plaat in een luminescentie microplaatlezer.
- Voor experimenten die moeten worden uitgevoerd bij 37 °C, houdt u de plaat gedurende 10-15 minuten in evenwicht bij de aangegeven temperatuur.
- Selecteer de putten die moeten worden geanalyseerd.
- Lees luminescentie met integratietijd van 0,3 s. Blijf luminescentie tot 2 uur controleren wanneer dat nodig is.
6. Data-analyse
- Bereken gemiddelde waarden en standaardafwijkingen voor alle geteste en controlecombinaties.
- Analyseer gegevens met behulp van eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen.
- Bereken de waarden van de vouwverandering door een gemiddelde luminescentie die voor interessante combinaties wordt verkregen, te delen door een gemiddelde luminescentie die voor de overeenkomstige negatieve regelaars wordt verkregen. Evalueer de resultaten.
OPMERKING: De hier voorgestelde benadering van gegevensanalyse gaat ervan uit dat de interactie kan worden geclaimd als de luminescentie die voor de geteste combinatie wordt verkregen statistisch significant hoger is dan de luminescentie die wordt verkregen voor de overeenkomstige controlecombinatie en tegelijkertijd de verhouding van deze twee waarden groter is dan 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de meest betrouwbare gegevens in deze benadering te verkrijgen, moeten alle mogelijke combinaties worden getest (zie figuur 1). Tegelijkertijd moeten positieve en negatieve controles worden opgenomen. De positieve controle moet bestaan uit de twee eiwitten waarvan bekend is dat ze interageren, waarvan de ene is gefuseerd met het grotere fragment en de andere is gefuseerd met het kleinere fragment. De negatieve controle zou idealiter moeten bestaan uit de twee niet-interagerende type III-membraaneiwitten die op dezelfde manier zijn gelabeld. Het vaststellen van een dergelijke controle kan echter een uitdaging zijn, omdat het gebrek aan interactie van de twee controle-eiwitten grondig moet worden bevestigd met behulp van verschillende alternatieve benaderingen. Daarom kan men een cytosolisch eiwit van niet-menselijke oorsprong gebruiken waarvan niet wordt verwacht dat het interageert met een menselijk eiwit (bijv. HaloTag) als een negatieve controle, als N- en / of C-termini van de eiwitten, waarvan de interactie moet worden bepaald, cytoplasmatisch worden blootgesteld zoals in het hier gepresenteerde geval. We raden ten zeerste een aanvullende verificatie aan van de resultaten die zijn verkregen met behulp van dit type controle door co-expressie van de niet-gecodeerde varianten van een van de eiwitten van belang in combinatie met titratie van de overeenkomstige plasmiden. Als de twee eiwitten specifiek op elkaar inwerken, zou een extra kopie van een van hen zonder het luciferasefragment moeten resulteren in een specifieke afname van luminescentie.
Relatieve luminescentie-eenheden (RLU) waarden die typisch zijn voor positieve en negatieve combinaties zijn vermeld in tabel 1. De resultaten werden verkregen voor de twee NST's, SLC35A2 en SLC35A3, waarvan werd aangetoond dat ze geassocieerd waren door co-immunoprecipitatie en FLIM-FRET6, evenals in situ nabijheidsligatietest11. Zowel SLC35A2 als SLC35A3 zijn Golgi-residente type III membraaneiwitten met N- en C-termini tegenover het cytoplasma (figuur 1A). Daarom zijn er acht mogelijke tagging-opties en kunnen de resulterende fusie-eiwitten ook op acht mogelijke manieren bij elkaar worden gezet (figuur 1B). De gemiddelde RLU-waarden die overeenkomen met alle geteste en controlecombinaties zijn weergegeven in figuur 2A. De positieve controle is ook inbegrepen. Een eerste vereiste voor een geselecteerd resultaat om als indicatief voor een interactie te worden beschouwd, is dat de RLU-waarde die voor de combinatie van belang is verkregen, statistisch significant hoger is dan de RLU-waarde die voor de overeenkomstige controlecombinatie is verkregen. In figuur 2A zijn drie van dergelijke combinaties te zien (LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT, SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 en SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3). De volgende stap in de analyse van de resultaten omvat het verkrijgen van ratiowaarden voor de combinaties van belang door de overeenkomstige RLU-waarden te delen door RLU-waarden die voor de respectieve controles zijn verkregen. De resultaten van een dergelijke analyse zijn weergegeven in figuur 2B. Volgens de suggesties van de fabrikant zijn verhoudingen tussen 10 en 1000 zeer indicatief voor specifieke interacties. Er zijn twee combinaties die aan deze criteria voldoen (SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 en SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3) en het idee ondersteunen dat SLC35A2 en SLC35A3 samenwerken. Het feit dat de andere zes combinaties negatief zijn, betekent echter niet dat er helemaal geen interacties zijn tussen de respectieve fusie-eiwitten, maar suggereert eerder dat de taggingstrategie in deze gevallen niet optimaal was. Dit voorbeeld laat zien hoe belangrijk het is om alle mogelijke combinaties te testen.
De gegevens in figuur 2 werden bovendien bevestigd door de co-expressie van HA-tagged SLC35A2 of SLC35A3 met de combinatie die resulteerde in de hoogste relatieve luminescentie, namelijk SLC35A2-LgBiT + SmBiT-SLC35A3. Verschillende hoeveelheden van de plasmiden die coderen voor HA-gelabelde NST-varianten werden gebruikt voor co-transfectie. Dit resulteerde in een statistisch significante, dosisafhankelijke afname van RLU-waarden (figuur 3). Specifieke en dosisafhankelijke verstoring van de interactie tussen SLC35A2-LgBiT en SmBiT-SLC35A3 door de gelijktijdige co-expressie van HA-gelabelde NST-varianten wordt weergegeven in tabel 2.
Het meest voorkomende probleem in verband met de hier gepresenteerde methode is de slechte efficiëntie van transfectie. Om te controleren of dit de oorzaak is van suboptimale resultaten, neemt u positieve controle op in alle experimenten. De positieve controle die we hebben gebruikt om de hier gepresenteerde gegevens te verkrijgen, bestaat uit de twee op elkaar inwerkende fusie-eiwitten: cAPM-afhankelijke eiwitkinasekatalytische subeenheid alfa (PRKACA) gefuseerd met het kleinere fragment en cAPM-afhankelijk eiwitkinase type II-alfa regulerende subeenheid (PRKAR2A) gefuseerd met het grotere fragment. In onze handen bereikte de bijbehorende RLU-waarde ~ 6 x 105. Een significante (2-3 ordes van grootte) daling van dit aantal kan een indicatie zijn van de suboptimale efficiëntie van de uitgevoerde transfectie. In een dergelijk geval raden we aan om het welzijn van de gekweekte cellen te controleren en ervoor te zorgen dat het juiste aantal cellen wordt geplateerd voor transfectie.
Figuur 1: Schema's van membraantopologie en tagging. (A) Membraantopologie van SLC35A2- en SLC35A3-eiwitten. (B) Mogelijkheden om SLC35A2- en SLC35A3-eiwitten te labelen met de split luciferase-complementatietestfragmenten en de resulterende fusie-eiwitten voor de test te combineren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Resultaten van de split luciferase complementatie assay uitgevoerd in HEK293T cellen voor de geselecteerde eiwitcombinaties en de bijbehorende negatieve controles (verwerkte gegevens). A) RLU-waarden verkregen voor de geselecteerde eiwitcombinaties en de bijbehorende negatieve controles. Negatief, HaloTag gelabeld met SmBiT; PRKAR2A, cAPM-afhankelijke eiwitkinase type II-alfa regulerende subeenheid; PRKACA, cAPM-afhankelijke eiwitkinase katalytische subeenheid alfa. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen en worden gepresenteerd als een gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van drie technische replicaties. p < 0,1 *, p < 0,05 **, p < 0,01 ***. B) Vouwveranderingen berekend door een gemiddelde luminescentie verkregen voor de geteste combinatie (RLU SAMPLE) te delen door een gemiddelde luminescentie verkregen voor de overeenkomstige negatieve controle (RLU CONTROL). De drempelwaarde die als indicatief voor een interactie werd beschouwd, werd vastgesteld op 10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Specifieke en dosisafhankelijke verstoring van de interactie tussen SLC35A2-LgBiT en SmBiT-SLC35A3 door gelijktijdige co-expressie van HA-gelabelde NST-varianten. HEK293T-cellen werden getransfecteerd met plasmiden die coderen voor SLC35A2-LgBiT en SmBiT-SLC35A3 en bovendien met een lege pSelect-plasmide (mock) of met toenemende hoeveelheden pSelect-plasmiden die coderen voor HA-tagged SLC35A2 (linkerpaneel) en SLC35A3 (rechterpaneel). Gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen en worden gepresenteerd als een gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van drie technische replicaties. p < 0,05 **, p < 0,001 ****. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Resultaten van de test uitgevoerd in HEK293T-cellen voor de geselecteerde eiwitcombinaties en de bijbehorende negatieve controles (ruwe gegevens). Onverwerkte RLU-waarden verkregen voor de geselecteerde eiwitcombinaties en de bijbehorende negatieve controles worden weergegeven. Negatief, HaloTag gelabeld met SmBiT; PRKAR2A, cAPM-afhankelijke eiwitkinase type II-alfa regulerende subeenheid; PRKACA, cAPM-afhankelijke eiwitkinase katalytische subeenheid alfa, TR, technische replicatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Specifieke en dosisafhankelijke verstoring van de interactie tussen SLC35A2-LgBiT en SmBiT-SLC35A3 door gelijktijdige co-expressie van HA-gelabelde NST-varianten (ruwe gegevens). Onbewerkte RLU-waarden verkregen voor de geselecteerde eiwitcombinaties worden weergegeven. Mock, cellen die SLC35A2-LgBiT en SmBiT-SLC35A3 tot expressie brengen, co-transfecteerd met een lege pSelect-vector; HA-SLC35A2, cellen die SLC35A2-LgBiT en SmBiT-SLC35A3 tot expressie brengen, co-transfecterend met de aangegeven hoeveelheden van een pSelect plasmidecodering SLC35A2 gelabeld met het HA-epitoop aan het N-eindpunt; HA-SLC35A3, cellen die SLC35A2-LgBiT en SmBiT-SLC35A3 tot expressie brengen, co-transfecterend met de aangegeven hoeveelheden van een pSelect plasmidecodering SLC35A3 gelabeld met het HA-epitoop op het N-eindpunt; TR, technische replicatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat de demonstratie mogelijk maakt van heterologe complexen gevormd tussen Golgi-residente type III-membraaneiwitten, zoals NST's, met behulp van de split luciferase-complementatietest. De voorgestelde benadering van gegevensanalyse en -interpretatie omvat het relateren van de luminescentie verkregen voor de eiwitcombinatie van belang aan de luminescentie verkregen voor de overeenkomstige controlecombinatie, die is samengesteld uit een van de eiwitten van belang gefuseerd met het grotere fragment en het controle-eiwit van een bacteriële oorsprong gefuseerd met het kleinere fragment. Dit laatste komt tot expressie in het cytoplasma van zoogdiercellen; daarom vereist het gebruik ervan als referentie dat N- en / of C-termini van de eiwitten, waarvan de interactie moet worden geanalyseerd, zich aan de cytoplasmatische kant van het Golgi-membraan bevinden.
De kritieke stappen in het protocol zijn plasmideontwerp, plating van de te transfecteren cellen, transfectie zelf, de mediumuitwisseling, bereiding van de furimazine-werkoplossing en het toevoegen aan de cellen. Het plasmideontwerp moet zo worden gemaakt dat beide luciferasefragmenten naar het cytoplasma zijn gericht, anders werken controlecombinaties niet en ontbreken de referentie-RLU-waarden. Cellen die moeten worden getransfecteerd, moeten worden geplateerd zoals gespecificeerd in het protocol, anders kan de transfectie-efficiëntie suboptimaal zijn. We raden aan om multiwell-platen te gebruiken met het poly-L-lysine-gecoate oppervlak om celbevestiging te ondersteunen terwijl het medium wordt verwisseld. Ten slotte moet de furimazine-werkoplossing vers worden bereid en onmiddellijk aan de cellen worden toegevoegd. Zodra het is toegevoegd, moet de uitlezing zo snel mogelijk worden uitgevoerd.
Om onbesliste resultaten te voorkomen, moeten altijd positieve en negatieve controles worden opgenomen. De positieve controle moet altijd worden gebruikt, zodat de transfectie-efficiëntie wordt bewaakt. Het is erg belangrijk dat alle mogelijke fusie-eiwitten die topologisch compatibel zijn met elkaar en met de halotag-gebaseerde negatieve controle worden gegenereerd en gecombineerd. Indien mogelijk moet de negatieve controle worden gebruikt die bestaat uit een membraaneiwit dat geen interactie heeft met een van de betrokken eiwitten. Hier hebben we zo'n controle niet gebruikt, omdat de ontwikkeling ervan nog steeds aan de gang is. In plaats daarvan dwongen we een specifieke demontage van de interessante complexen af door een extra, ongelabelde kopie van een van de geanalyseerde eiwitten samen tot expressie te brengen. De expressievectoren die we gebruikten dragen de relatief zwakke herpes simplex virus-thymidine kinase (HSV-TK) promotor, die zorgt voor lage expressieniveaus die optimaal zijn voor het verkrijgen van specifieke uitkomst. In het geval van suboptimale resultaten kan het echter nuttig zijn om de CMV-gebaseerde vectoren te gebruiken of, als alternatief, de hoeveelheid plasmiden die worden gebruikt voor transfectie te optimaliseren.
De gepresenteerde methode, hoewel krachtig en handig, heeft enkele beperkingen. Ten eerste laat deze methode het niet toe om te concluderen of de geïdentificeerde complexen overeenkomen met dimeren of oligomeren van hogere orde. Bovendien kan de subcellulaire lokalisatie van de interagerende eiwitten niet worden gecontroleerd. Dit is echter mogelijk na de uitbreiding van het basisprotocol met bioluminescente beeldvorming, hoewel de ruimtelijke resolutie van dergelijke beelden aanzienlijk lager zou zijn in vergelijking met op fluorescentie gebaseerde benaderingen.
De gepresenteerde methode is zeer snel en efficiënt (de meting duurt maximaal enkele minuten en de gegevens worden verkregen uit duizenden cellen). Gegevensverwerking en -interpretatie is ook relatief eenvoudig. Er is weinig of geen optimalisatie van het basisprotocol nodig. De enige specifieke apparatuur die nodig is, is een luminometer. De split luciferase complementatie assay en BiFC werken volgens hetzelfde essentiële principe, d.w.z. reconstitutie van een functioneel eiwit uit zijn niet-functionele fragmenten. Algemene voordelen van op bioluminescentie gebaseerde benaderingen ten opzichte van die op fluorescentie werden al in de inleiding vermeld. Een specifiek voordeel van de split luciferase complementatie assay ten opzichte van BiFC is dat de eerste volledig omkeerbaar is15. In BiFC, zodra een fluorescerend eiwit is gereconstitueerd, zou het niet terugdissociëren in de overeenkomstige niet-fluorescerende fragmenten17. Daarentegen is de assemblage van de NanoLuc-subeenheden omkeerbaar, wat een unieke kans creëert om de dynamiek van PPI's te bestuderen. Ten slotte maakt de uitzonderlijke gevoeligheid van de gepresenteerde methode het mogelijk om aan te nemen dat deze aanpak zelfs zou moeten werken met de cellijnen die moeilijk te transfecteren zijn.
Het hier gepresenteerde protocol maakt het mogelijk om te bepalen of de twee Golgi-residente type III-membraaneiwitten op elkaar inwerken. Zoals reeds vermeld, kan de basisopstelling van de methode worden gekoppeld aan bioluminescentiebeeldvorming om de subcellulaire lokalisatie van de PPI van belang te bevestigen. De reversibiliteit van deze split luciferase complementatie assay maakt het mogelijk om de dynamiek van PPI's in real time te bestuderen. Het luminescerende signaal afgeleid van furimazine wordt ongeveer 2 uur volgehouden. Er zijn echter ook substraten beschikbaar voor de split luciferase-complementatietest die een aanzienlijk langere (uren tot dagen) duur van het resulterende signaal garanderen. Deze methode maakt het mogelijk om de factoren te identificeren die de PPI van belang veroorzaken of voorkomen. Enkele van de meest recente voorbeelden van de toepassing ervan zijn studies over interacties tussen G-eiwitten en G-eiwit-gekoppelde receptoren18, eiwit conformatieveranderingen19, eiwit ubiquitinatie20, internalisatie van celoppervlakreceptoren21 en identificatie van factoren die PPI's moduleren22,23. Daarom lijkt deze methode een veelzijdig hulpmiddel te zijn met een hoog potentieel om zelfs zeer uitdagende experimentele doelen te vervullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidie nr. 2016/23/D/NZ3/01314 van het National Science Centre (NCN), Krakau, Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al.
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
