Summary
Protokollen som presenteres her er ment å demonstrere forekomsten av heteroologe interaksjoner mellom Golgi-bosatte type III membranproteiner med cytoplasmatisk eksponert N- og / eller C-termini i levende pattedyrceller ved hjelp av den nyeste varianten av den delte luciferase komplementeringsanalysen.
Abstract
Målet med denne protokollen er å utforske anvendelsen av den nyeste varianten av delt luciferase komplementering for å demonstrere heteroologe komplekser dannet av nukleotid sukkertransportører (NSTs). Disse ER- og Golgi-bosatte multitransmembrane proteinene bærer cytoplasmatisk syntetiserte nukleotidsukker på tvers av organellemembraner for å levere enzymer som formidler glykosylering med deres substrater. NSTer finnes som dimers og/eller høyere oligomerer. Det er også rapportert om heterologe interaksjoner mellom ulike NST-er. For å verifisere om teknikken er egnet for å studere fenomenet NST-hetermerisering, testet vi den mot en kombinasjon av de to Golgi-bosatte NSTene som tidligere har vist seg å assosiere på flere andre måter. Luciferase komplementeringsanalysen ser ut til å være spesielt egnet for å studere interaksjoner mellom Golgi-bosatte membranproteiner, da det ikke krever høye uttrykksnivåer, som ofte utløser protein feillokalisering og øker risikoen for falske positiver.
Introduction
Dette manuskriptet beskriver en trinnvis protokoll for å se etter tilstedeværelsen av heterologe interaksjoner mellom Golgi-resident type III membranproteiner i forbigående transfekerte menneskelige celler ved hjelp av den nyeste varianten av den delte luciferase komplementeringsanalysen. Prosedyren har blitt mest omfattende testet mot nukleotid sukkertransportører (NSTs), men vi var også i stand til å oppnå positive resultater for andre Golgi-bosatte type III membranproteiner hvis N- og / eller C-termini står overfor cytoplasma.
Vår forskningsgruppe utforsker NSTs rolle i glykosylering av makromolekyler. NSTs er Golgi- og/eller ER-bosatte type III membranproteiner med N- og C-termini vendt mot den cytoplasmatiske siden av organellarmembranen1. NSTs antas å bære nukleotidaktiverte sukkerarter over organellemembraner for å levere glykosyltransferaser med sine substrater. NSTer danner dimers og/eller høyere oligomers2,3,4,5,6,7,8,9,10. Videre er det også rapportert heteroologe interaksjoner mellom ulike NST-er, 6,11. NSTs ble også demonstrert for å danne komplekser med funksjonelt relaterte glykosyleringsenzymer12,13,14. Vi søkte etter et alternativ til den nåværende brukte teknikken, fluorescens levetidsavbildning (FLIM)-basert FRET-tilnærming, for å studere interaksjoner mellom NSTs og funksjonelt relaterte Golgi-bosatte proteiner, så vi bestemte oss for å teste den splittede luciferase komplementeringsanalysen. Det tillot oss å identifisere et nytt samspill mellom en NST og et funksjonelt relatert glykosyleringsenzym9.
Den siste modifikasjonen av den delte luciferase komplementeringsanalysen, NanoBiT, brukes i protokollen som presenteres her15. Det er avhengig av rekonstituering av luciferase enzymet (f.eks. NanoLuc) fra de to fragmentene - den store, betegnet som stor BiT eller LgBiT, et 17,6 kDa protein, og den lille, bestående av bare 11 aminosyrer, betegnet som liten BiT eller SmBiT. De to proteinene av interesse er smeltet sammen med komplementære fragmenter og midlertidig uttrykt i en menneskelig cellelinje. Hvis de to fusjonsproteinene samhandler, produseres en luminescens in situ ved tilsetning av et cellegjennomtrengelig substrat. Disse to fragmentene er optimalisert slik at de forbinder med minimum affinitet med mindre de blir samlet av et samspill mellom proteinene av interesse de er smeltet sammen til.
Generelt har bioluminescensbaserte metoder noen fordeler i forhold til de som er basert på fluorescens. Bioluminescence-signaler har et høyere signal-til-støy-forhold fordi bakgrunnslysene er ubetydelige sammenlignet med det luciferase-avledede signalet16. I motsetning lider fluorescensbaserte tilnærminger vanligvis av en relativt høy bakgrunn forårsaket av fenomenet autofluorescens. Dessuten er bioluminescens mindre skadelig for de analyserte cellene enn fluorescens, som i det tidligere tilfellet er det ikke nødvendig å begeistre prøven. Av disse grunnene bioluminescent tilnærminger til å studere PPIs in vivo outkompetente de ofte brukte fluorescerende metoder som Förster Resonance Energy Transfer (FRET) eller Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).
Vår protokoll er avhengig av å referere luminescens oppnådd for proteinkombinasjonen av interesse for luminescens oppnådd for kontrollkombinasjonen. Sistnevnte inkluderer et av de testede proteinene som er smeltet sammen med et større fragment og et kontrollprotein (f.eks. HaloTag), smeltet sammen med et mindre fragment. Sistnevnte er et protein av bakteriell opprinnelse som ikke forventes å samhandle med noen av pattedyrproteiner. Å bruke dette proteinet som en kontroll gir begrensninger for topologien til de Golgi-bosatte par proteinene som skal analyseres. Siden i pattedyrceller syntetiseres dette proteinet i cytoplasma, bør begge proteiner av interesse ha minst en cytoplasmatisk hale.
Denne tilnærmingen kan være spesielt nyttig for første screening av PPIer. Det kan bli den valgte metoden når fusjonsproteinene av interesse uttrykkes på nivåer som rett og slett ikke er tilstrekkelige for andre tilnærminger som skal brukes. På samme måte kan den delte luciferase komplementeringsanalysen være det beste alternativet hvis proteinene av interesse uttrykkes på høye nivåer, men dette påvirker deres subcellulære lokalisering negativt eller er kjent for å tvinge ikke-spesifikke interaksjoner. Siden det mindre fragmentet bare har 11 aminosyrer, kan den delte luciferase komplementeringsanalysen påføres når du bruker større koder er umulig. Til slutt kan den brukes til å bekrefte data som er innhentet ved hjelp av andre teknikker, som i tilfelle presentert her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av uttrykksplasmider
- Undersøk membrantopologien til proteinene av interesse ved hjelp av et topologiforutsigelsesverktøy.
- Design kloningsstrategien slik at de større og mindre fragmentene vil møte cytoplasma når fusjonsproteinene er satt inn i Golgi-membraner. Hvis, som i tilfellet presentert her, både N- og C-termini av proteinene av interesse er cytoplasmisk orientert, merke proteinene på åtte mulige måter (se figur 1B). Hvis N- eller C-terminus av ett eller begge proteiner av interesse er lysende orientert, må du utelukke det fra merking.
- Trekk genene av interesse inn i passende uttrykksvektorer (se Materialtegn) ved å følge standard kloningsprotokoller.
MERK: Det anbefales å teste alle mulige retninger, siden noen kodealternativer kanskje ikke fungerer på grunn av utilstrekkelig nærhet, suboptimal orientering eller romlige begrensninger.
2. Forbigående transfeksjon av uttrykket plasmider inn i cellene
- Høst den tilhørende HEK293T-cellekulturen ved å prøve å resuspendere cellene i et dedikert komplett vekstmedium. Plate cellene (2 x 104/100 μL/brønn) på en klar bunn, hvit side 96-brønns plate. Juster totalt antall brønner for å imøtekomme alle testede kombinasjoner og kontroller, inkludert replikeringer.
MERK: Forsøk bare å bruke de indre 60 brønnene på platen for å minimere termiske skift og unngå fordampning over natten. Bruk av poly-D-lysinbelagte plater anbefales på det sterkeste, for eksempel de som er angitt i materialtabellen, ellers kan celler løsne under de påfølgende vasketrinnene. - Kultur cellene over natten under standardforhold (37 °C, 5 % CO2).
- På neste dag transfekt cellene med de ønskede kombinasjonene av uttrykk plasmider oppnådd i punkt 1.1.
- Fortynn uttrykksplasmider i et serumfritt medium (se Materialtabell) til 6,25 ng/μL for hver konstruksjon.
- Tilsett lipidbasert transfeksjonsreagens ved et passende lipid-til-DNA-forhold og inkuber i henhold til produsentens instruksjon.
- Tilsett 8 μL lipid:DNA-blanding til utpekte brønner. Bland innholdet på platen ved forsiktig rotasjon. Dette resulterer i transfeksjon av begge uttrykkskonstruksjoner ved 50 ng/brønn.
- Kultur cellene i 20-24 timer under standard forhold (37 °C, 5 % CO2).
MERK: Dyrking av cellene i lengre tid kan føre til høyere nivåer av fusjonsproteinuttrykk, noe som kan fremme en ikke-spesifikk sammenheng mellom fragmentene.
3. Middels utveksling
- På neste dag erstatter det betingede mediet med 100 μL av et serumfritt medium i hver brønn. Kontroller at cellene ikke er koblet fra ved middels utveksling.
MERK: Dette trinnet bør gjøres 2-3 timer før tilsetning av furimazin arbeidsløsningen. Serumuttak minimerer bakgrunnen forårsaket av autoluminescens av furimazin.
4. Fremstilling av furimazin arbeidsløsning
- Like før målingen blander du 1 volum furimazin med 19 volumer av en fortynningsbuffer (en 20 ganger fortynning).
MERK: Det totale volumet av furimazinarbeidsløsningen som skal fremstilles, avhenger av antall individuelle brønner som skal analyseres (furimazinarbeidsløsningen legges til cellekulturmediet i et 1:5-forhold, derfor bør hver brønn som tidligere er fylt med 100 μL av et serumfritt medium 25 μL av furimazinarbeidsløsningen tilsettes). - Tilsett furimazinarbeidsløsningen i utpekte brønner (25 μL/brønn). Bland platen forsiktig for hånd eller bruk en orbital shaker (f.eks. 15 s ved 300-500 rpm).
5. Måling av luminescens
- Sett platen inn i en mikroplateleser med luminescens.
- For eksperimenter som skal utføres ved 37 °C likevekter platen i 10-15 min ved den angitte temperaturen.
- Velg brønnene som skal analyseres.
- Les luminescens med integrasjonstid på 0,3 s. Fortsett å overvåke luminescens i opptil 2 timer når det er nødvendig.
6. Dataanalyse
- Beregn gjennomsnittsverdier og standardavvik for alle de testede og kontrollkombinasjonene.
- Analyser data ved hjelp av enveis ANOVA med flere sammenligninger.
- Beregn verdier for foldeendring ved å dividere en gjennomsnittlig luminescens oppnådd for kombinasjoner av interesse med en gjennomsnittlig luminescens oppnådd for de tilsvarende negative kontrollene. Evaluer resultatene.
MERK: Tilnærmingen til dataanalyse som foreslås her antar at interaksjonen kan hevdes hvis luminescensen oppnådd for den testede kombinasjonen er statistisk signifikant høyere enn luminescensen oppnådd for den tilsvarende kontrollkombinasjonen og samtidig overskrider forholdet mellom disse to verdiene 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å oppnå de mest pålitelige dataene i denne tilnærmingen bør alle mulige kombinasjoner testes (se figur 1). Parallelt bør positive og negative kontroller inkluderes. Den positive kontrollen skal bestå av de to proteinene som er kjent for å samhandle, hvorav den ene er smeltet sammen med det større fragmentet og den andre er smeltet sammen med det mindre fragmentet. Den negative kontrollen bør ideelt sett bestå av de to ikke-interagerende type III membranproteinene merket på samme måte. Det kan imidlertid være utfordrende å etablere en slik kontroll, da mangelen på interaksjon mellom de to kontrollproteinene bør bekreftes grundig ved hjelp av flere alternative tilnærminger. Derfor kan man bruke et cytoøst protein av ikke-menneskelig opprinnelse som ikke forventes å samhandle med noe humant protein (f.eks. HaloTag) som en negativ kontroll, hvis N- og/ eller C-termini av proteinene, hvis interaksjon skal bestemmes, blir cytoplasmisk eksponert som i tilfellet presentert her. Vi anbefaler på det sterkeste en ytterligere verifisering av resultatene oppnådd ved hjelp av denne typen kontroll ved å uttrykke de ukodede varianter av et av proteinene av interesse kombinert med titrering av de tilsvarende plasmidene. Hvis de to proteinene spesifikt samhandler, bør en ekstra kopi av en av dem som mangler luciferasefragmentet resultere i en bestemt reduksjon av luminescens.
Relative lystetthetsenheter (RLU)-verdier som er typiske for positive og negative kombinasjoner, er oppført i tabell 1. Resultatene ble oppnådd for de to NSTene, SLC35A2 og SLC35A3, som ble vist å være assosiert med co-immunoprecipitation og FLIM-FRET6 samt in situ proximity ligation assay11. Både SLC35A2 og SLC35A3 er Golgi-bosatte type III membranproteiner med N- og C-termini vendt mot cytoplasma (figur 1A). Derfor er det åtte mulige merkingsalternativer, og de resulterende fusjonsproteinene kan settes sammen også på åtte mulige måter (figur 1B). Gjennomsnittlige RLU-verdier som tilsvarer alle de testede og kontrollkombinasjonene, er avbildet i figur 2A. Den positive kontrollen er også inkludert. Et innledende krav til at et valgt resultat skal vurderes som en indikasjon på en samhandling, er at RLU-verdien som oppnås for rentekombinasjonen, er statistisk signifikant høyere enn RLU-verdien som er oppnådd for den tilsvarende kontrollkombinasjonen. I figur 2A ses tre slike kombinasjoner (LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT, SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 og SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3). Det neste trinnet i analysen av resultatene innebærer å oppnå forholdsverdier for kombinasjonene av interesse ved å dele de tilsvarende RLU-verdiene med RLU-verdier oppnådd for de respektive kontrollene. Resultatene av en slik analyse er vist i figur 2B. I følge produsentens forslag er forholdet mellom 10 og 1000 svært veiledende for spesifikke interaksjoner. Det er to kombinasjoner som oppfyller disse kriteriene (SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 og SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3) og støtter ideen om at SLC35A2 og SLC35A3 samhandler. Det faktum at de andre seks kombinasjonene er negative, betyr imidlertid ikke at det ikke er noen interaksjoner i det hele tatt mellom de respektive fusjonsproteinene, men antyder heller at merkingsstrategien ikke var optimal i disse tilfellene. Dette eksemplet viser hvor viktig det er å teste alle mulige kombinasjoner.
Data presentert i figur 2 ble i tillegg bekreftet av samuttrykket til HA-merket SLC35A2 eller SLC35A3 med kombinasjonen som resulterte i den høyeste relative luminescensen, nemlig SLC35A2-LgBiT + SmBiT-SLC35A3. Varierende mengder av plasmidene som koder HA-merkede NST-varianter ble brukt til samtransfeksjon. Dette resulterte i en statistisk signifikant, doseavhengig reduksjon i RLU-verdier (figur 3). Spesifikk og doseavhengig forstyrrelse av samspillet mellom SLC35A2-LgBiT og SmBiT-SLC35A3 ved samtidig samuttrykk av HA-merkede NST-varianter er vist i tabell 2.
Det vanligste problemet forbundet med metoden som presenteres her, er den dårlige effektiviteten av transfeksjon. Hvis du vil kontrollere om dette er årsaken til suboptimale resultater, inkluderer du positiv kontroll i alle eksperimenter. Den positive kontrollen vi brukte for å innhente dataene som presenteres her, består av de to interagerende fusjonsproteinene: cAPM-avhengig protein kinase katalytisk subenhet alfa (PRKACA) smeltet sammen med det mindre fragmentet og cAPM-avhengige proteinkinase type II-alfa regulatoriske underenhet (PRKAR2A) smeltet sammen med det større fragmentet. I våre hender nådde den tilsvarende RLU-verdien ~ 6 x 105. Et betydelig (2-3 størrelsesorden) fall i dette tallet kan være en indikasjon på den suboptimale effektiviteten til den utførte transfeksjonen. I et slikt tilfelle anbefaler vi å sjekke trivselen til de dyrkede cellene og sørge for at riktig antall celler blir belagt for transfeksjon.
Figur 1: Skjemaer for membrantopologi og merking. (A) Membrantopologi av SLC35A2- og SLC35A3-proteiner. (B) Muligheter for merking av SLC35A2- og SLC35A3-proteiner med de delte luciferase komplementeringsanalysefragmentene og kombinere de resulterende fusjonsproteinene for analysen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Resultater av den delte luciferase komplementeringsanalysen utført i HEK293T-celler for de valgte proteinkombinasjonene og de tilsvarende negative kontrollene (behandlede data). (A) RLU-verdier oppnådd for de valgte proteinkombinasjonene og de tilsvarende negative kontrollene. Negativ, HaloTag merket med SmBiT; PRKAR2A, cAPM-avhengig protein kinase type II-alfa regulatorisk underenhet; PRKACA, cAPM-avhengig protein kinase katalytisk subenhet alfa. Data ble analysert ved hjelp av enveis ANOVA med flere sammenligninger og presenteres som et gjennomsnitt ± standardavvik (SD) fra tre tekniske repliker. p < 0,1 *, p < 0,05 **, p < 0,01 ***. (B) Brett endringer beregnet ved å dele en gjennomsnittlig luminescens oppnådd for den testede kombinasjonen (RLU SAMPLE) med en gjennomsnittlig luminescens oppnådd for den tilsvarende negative kontrollen (RLU CONTROL). Terskelverdi som ble vurdert som en indikasjon på en samhandling, ble satt til 10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Spesifikk og doseavhengig forstyrrelse av samspillet mellom SLC35A2-LgBiT og SmBiT-SLC35A3 ved samtidig samuttrykk av HA-merkede NST-varianter. HEK293T celler ble transfektert med plasmider koding SLC35A2-LgBiT og SmBiT-SLC35A3 og, i tillegg, enten med en tom pSelect plasmid (mock) eller med økende mengder pSelect plasmider koding HA-merket SLC35A2 (venstre panel) og SLC35A3 (høyre panel). Data ble analysert ved hjelp av enveis ANOVA med flere sammenligninger og presenteres som et gjennomsnitt ± standardavvik (SD) fra tre tekniske repliker. p < 0,05 **, p < 0,001 ****. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Resultater av analysen utført i HEK293T-celler for de valgte proteinkombinasjonene og de tilsvarende negative kontrollene (rådata). Ubehandlede RLU-verdier oppnådd for de valgte proteinkombinasjonene og de tilsvarende negative kontrollene vises. Negativ, HaloTag merket med SmBiT; PRKAR2A, cAPM-avhengig protein kinase type II-alfa regulatorisk underenhet; PRKACA, cAPM-avhengig protein kinase katalytisk subenhet alfa, TR, teknisk replikering. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Spesifikk og doseavhengig forstyrrelse av samspillet mellom SLC35A2-LgBiT og SmBiT-SLC35A3 ved samtidig samuttrykk av HA-merkede NST-varianter (rådata). Ubehandlede RLU-verdier oppnådd for de valgte proteinkombinasjonene vises. Mock, celler som uttrykker SLC35A2-LgBiT og SmBiT-SLC35A3 co-transfected med en tom pSelect vektor; HA-SLC35A2, celler som uttrykker SLC35A2-LgBiT og SmBiT-SLC35A3 co-transfektert med de angitte mengdene av en pSelect plasmidkoding SLC35A2 merket med HA-epitopen ved N-terminus; HA-SLC35A3, celler som uttrykker SLC35A2-LgBiT og SmBiT-SLC35A3 co-transfektert med de angitte mengdene av en pSelect plasmidkoding SLC35A3 merket med HA-epitopen ved N-terminus; TR, teknisk replikering. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her gir vi en detaljert protokoll som muliggjør demonstrasjon av heteroologe komplekser dannet mellom Golgi-bosatte type III membranproteiner, som NSTs, ved hjelp av den delte luciferase komplementeringsanalysen. Den foreslåtte tilnærmingen til dataanalyse og tolkning innebærer å relatere luminescensen oppnådd for proteinkombinasjonen av interesse for luminescensen oppnådd for den tilsvarende kontrollkombinasjonen, som består av et av proteinene av interesse smeltet sammen med det større fragmentet og kontrollproteinet av bakteriell opprinnelse smeltet sammen med det mindre fragmentet. Sistnevnte uttrykkes i cytoplasma av pattedyrceller; Derfor krever bruk av det som referanse at N- og / eller C-termini av proteinene, hvis interaksjon skal analyseres, er på den cytoplasmatiske siden av Golgi-membranen.
De kritiske trinnene i protokollen er plasmid design, plating cellene som skal transfekteres, transfeksjon selv, medieutveksling, forberedelse av furimazin arbeidsløsning og legge den til cellene. Den plasmid design bør gjøres på en slik måte at begge luciferase fragmenter vender mot cytoplasma, ellers kontrollkombinasjoner vil ikke fungere og referansen RLU verdier vil mangle. Celler som skal transfekteres, bør belagt som angitt i protokollen, ellers kan transfeksjonseffektiviteten være suboptimal. Vi anbefaler at du bruker flervelplater med den poly-L-lysinbelagte overflaten for å støtte cellefeste mens mediet byttes ut. Til slutt bør furimazinarbeidsløsningen være nytilberedt og umiddelbart tilsatt cellene. Når den er lagt til, bør avlesningen utføres så snart som mulig.
For å unngå inkonklusive resultater bør positive og negative kontroller alltid inkluderes. Den positive kontrollen bør alltid brukes slik at transfeksjonseffektiviteten overvåkes. Det er svært viktig at alle mulige fusjonsproteiner som er topologisk kompatible med hverandre så vel som med HaloTag-basert negativ kontroll genereres og kombineres. Hvis det er mulig, bør den negative kontrollen som består av et membranprotein som ikke samhandler med noen av proteinene av interesse, brukes. Her benyttet vi ikke en slik kontroll, da utviklingen fortsatt er på vei. I stedet tvang vi en bestemt demontering av kompleksiteten av interesse ved å uttrykke en ekstra, ukodet kopi av et av de analyserte proteinene. Uttrykksvektorene vi brukte bærer den relativt svake herpes simplex virus-thymidine kinase (HSV-TK) promotoren, som sikrer lave uttrykksnivåer som er optimale for å oppnå spesifikt resultat. Når det gjelder suboptimale resultater, kan det imidlertid være gunstig å bruke CMV-baserte vektorer eller alternativt optimalisere mengden plasmider som brukes til transfeksjon.
Den presenterte metoden, selv om den er kraftig og praktisk, har noen begrensninger. For det første tillater denne metoden ikke å konkludere om de identifiserte kompleksene tilsvarer dimers eller høyere ordens oligomerer. Dessuten kan ikke den subcellulære lokaliseringen av de interagerende proteinene overvåkes. Dette er imidlertid mulig ved forlengelsen av den grunnleggende protokollen med bioluminescent avbildning, selv om romlig oppløsning av slike bilder vil være betydelig lavere sammenlignet med fluorescensbaserte tilnærminger.
Den presenterte metoden er veldig rask og effektiv (målingen tar opptil flere minutter og dataene er hentet fra tusenvis av celler). Databehandling og tolkning er også relativt enkelt. Liten eller ingen optimalisering av grunnprotokollen er nødvendig. Det eneste spesifikke utstyret som kreves er et luminometer. Den splittede luciferase komplementeringsanalysen og BiFC fungerer på samme essensielle prinsipp, det vil si rekonstituering av et funksjonelt protein fra sine ikke-funksjonelle fragmenter. Generelle fordeler med bioluminescensbaserte tilnærminger over de som er basert på fluorescens, var allerede oppført i introduksjonen. En spesifikk fordel med den splittede luciferase komplementeringsanalysen over BiFC er at førstnevnte er fullt reversibel15. I BiFC, når et fluorescerende protein er rekonstituert, ville det ikke dissosiere tilbake i de tilsvarende ikke-fluorescerende fragmentene17. I motsetning til dette er monteringen av NanoLuc-underenhetene reversibel, noe som skaper en unik mulighet til å studere dynamikken i PPIer. Til slutt gjør den eksepsjonelle følsomheten til den presenterte metoden det mulig å anta at denne tilnærmingen skal fungere selv med cellelinjene som er vanskelige å transfektere.
Protokollen som presenteres her gjør det mulig å avgjøre om de to Golgi-bosatte type III membranproteinene samhandler. Som allerede nevnt kan det grunnleggende oppsettet av metoden kombineres med bioluminescensavbildning for å bekrefte den subcellulære lokaliseringen av PPI av interesse. Reversibiliteten til denne splittede luciferase komplementeringsanalysen gjør det mulig å studere dynamikken i PPIer i sanntid. Luminescerende signal avledet fra furimazin opprettholdes i ca 2 timer. Substrater for den delte luciferase komplementeringsanalysen som sikrer en vesentlig lengre (timer til dager) varighet av det resulterende signalet er også tilgjengelig. Denne metoden gjør det mulig å identifisere faktorene som utløser eller forhindrer PPI av interesse. Noen av de nyeste eksemplene på søknaden inkluderer studier på interaksjoner mellom G-proteiner og G-protein-koblede reseptorer18, proteinkonformasjonsendringer19, proteinallokærisering20, internalisering av celleoverflatereseptorer21 og identifisering av faktorer som modulerer PPIer22,23. Derfor ser denne metoden ut til å være et allsidig verktøy med høyt potensial for å oppfylle selv svært utfordrende eksperimentelle mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskuddsnummer 2016/23/D/NZ3/01314 fra National Science Centre (NCN), Krakow, Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al.
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
