Summary
تقدم هذه الورقة طريقة الفقس دون استخدام قشر البيض للدراسات السمية لملوثات الجسيمات مثل البلاستيك الدقيق.
Abstract
البلاستيك الدقيق هو نوع من الملوثات العالمية الناشئة التي تشكل تهديدا صحيا كبيرا للحيوانات بسبب امتصاصها ونقلها في الأنسجة الحيوانية والأعضاء. الآثار الإيكولوجية للبلاستيك الدقيق على تطور أجنة الطيور غير معروفة. بيضة الطيور هي نظام تطوير وتغذية كامل ، ويحدث تطور الجنين بأكمله في قشر البيض. لذلك ، فإن السجل المباشر لتطور جنين الطيور تحت ضغط الملوثات مثل البلاستيك الدقيق محدود للغاية بسبب قشر البيض المبهم في الفقس التقليدي. في هذه الدراسة، تم رصد آثار البلاستيك الدقيق على نمو جنين السمان بصريا عن طريق الفقس دون قشر البيض. وتشمل الخطوات الرئيسية تنظيف وتطهير البويضات المخصبة، والحضانة قبل التعرض، والحضانة القصيرة الأجل بعد التعرض، واستخراج العينة. تظهر النتائج أنه بالمقارنة مع مجموعة التحكم ، أظهر الوزن الرطب وطول الجسم للمجموعة المعرضة للبلاستيك الدقيق فرقا إحصائيا وزادت نسبة الكبد للمجموعة المعرضة بالكامل بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتقييم العوامل الخارجية التي تؤثر على الحضانة: درجة الحرارة والرطوبة وزاوية دوران البيض وغيرها من الحالات. وتوفر هذه الطريقة التجريبية معلومات قيمة عن التكسينات الإيكولوجية للبلاستيك الدقيق وطريقة جديدة لدراسة الآثار الضارة للملوثات على نمو الأجنة.
Introduction
بلغ إنتاج النفايات البلاستيكية حوالي 6300 طن متري في عام 2015، تم إعادة تدوير عشرها، وتم حرق البقية أو دفنها تحت الأرض. وتشير التقديرات إلى أن حوالي 12000 طن من النفايات البلاستيكية سيتم دفنها تحت الأرض بحلول عام 20501. مع اهتمام المجتمع الدولي للنفايات البلاستيكية، اقترح طومسون لأول مرة مفهوم البلاستيك الدقيق في عام 20042. تشير البلاستيك الدقيق (أعضاء البرلمان) إلى البلاستيك الجسيمات الصغيرة التي يقل قطرها عن 5 ملم. في الوقت الحاضر، اكتشف الباحثون وجود أعضاء البرلمان في كل مكان في الساحل من مختلف القارات، وجزر المحيط الأطلسي، والبحيرات الداخلية، والقطب الشمالي، وموائل أعماق البحار3و4و5و6و7. ولذلك، بدأ المزيد من الباحثين في دراسة المخاطر البيئية لأعضاء البرلمان.
يمكن للكائنات الحية استيعاب أعضاء البرلمان في البيئة. تم العثور على أعضاء البرلمان في الجهاز الهضمي من 233 الكائنات البحرية في جميع أنحاء العالم (بما في ذلك 100٪ أنواع السلاحف، 36٪ أنواع الفقمة، 59٪ أنواع الحيتان، 59٪ أنواع الطيور البحرية، 92 نوعا من الأسماك البحرية، و 6 أنواع من اللافقاريات)8. وعلاوة على ذلك، قد يمنع أعضاء البرلمان الجهاز الهضمي للكائنات الحية، وتتراكم، وتهاجر في البوب9بهم . وقد تبين أنه يمكن نقل أعضاء البرلمان عبر السلسلة الغذائية، ويختلف مداها مع التغيرات في الموائل، ومرحلة النمو، وعادات التغذية، ومصادر الغذاء10. وأفاد بعض الباحثين بوجود أعضاء البرلمان في فضلات الطيور البحرية11، مما يعني أن الطيور البحرية تعمل كناقل لأعضاء البرلمان. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤثر ابتلاع أعضاء البرلمان على صحة بعض الكائنات الحية. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون أعضاء البرلمان متشابكين في الجهاز الهضمي ، وبالتالي زيادة وفيات الحيتانيات12.
فلنواب وحدهم لهم آثار سامة على الكائنات الحية، فضلا عن الآثار السامة المشتركة على الكائنات الحية ذات الملوثات الأخرى. ابتلاع تركيزات ذات الصلة بالبيئة من الحطام البلاستيك قد يزعج وظيفة نظام الغدد الصماء من الأسماك البالغة13. حجم البلاستيك الدقيق هو واحد من العوامل الهامة التي تؤثر على امتصاصها وتراكمها من قبل الكائنات الحية14،15. البلاستيك صغير الحجم ، وخاصة البلاستيك نانو الحجم ، عرضة للتفاعل مع الخلايا والكائنات الحية ذات السمية العالية16،17،18،19. وعلى الرغم من أن الآثار الضارة للبلاستيك الدقيق بحجم الجسيمات النانوية على الكائنات الحية تتجاوز مستوى البحوث الحالي، فإن الكشف عن البلاستيك الدقيق وتحديد حجمه بأحجام تقل عن عدة ميكرومترات، ولا سيما البلاستيك دون الميكرون/نانو في البيئة، لا يزال يشكل تحديا كبيرا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البلاستيك النانوي له أيضا بعض الآثار على الأجنة. البوليسترين يمكن أن تلحق الضرر تطوير أجنة قنفذ البحر من خلال تنظيم البروتين والجينات ملامح20.
لاستكشاف التأثير المحتمل لأعضاء البرلمان على الكائنات الحية، أجرينا هذه الدراسة. نظرا للتشابه بين أجنة الطيور والأجنة البشرية ، وعادة ما تستخدم في بحوث البيولوجيا التنموية21 بما في ذلك تولد الأوعية وتولد الأوعية ، وهندسة الأنسجة ، وزرع المواد الحيوية ، وأورام الدماغ22،23،24. أجنة الطيور لديها مزايا منخفضة التكلفة، ودورة ثقافة قصيرة وسهلة التشغيل25،26. لذلك، اخترنا أجنة السمان مع دورة نمو قصيرة كحيوان تجريبي في هذه الدراسة. في وقت واحد، يمكننا أن نلاحظ مباشرة التغيرات المورفولوجية لأجنة السمان المعرضة لأعضاء البرلمان خلال مرحلة النمو الجنيني باستخدام تكنولوجيا الفقس الخالية من قشر البيض. وكانت المواد التجريبية المستخدمة هي البولي بروبلين (PP) والبوليسترين (PS). لأن PP و PS27 تمثل أكبر نسبة من أنواع البوليمر التي تم الحصول عليها في الرواسب والمائيات في جميع أنحاء العالم، وأنواع البوليمر الأكثر شيوعا المستخرجة من الكائنات البحرية التي تم التقاطها هي الإيثيلين والبروبيلين28. يصف هذا البروتوكول التجريبي العملية الكاملة للتقييم البصري للآثار السمية لأعضاء البرلمان على أجنة السمان المعرضة لأعضاء البرلمان. يمكننا بسهولة توسيع هذه الطريقة لفحص سمية الملوثات الأخرى لنمو الأجنة من الحيوانات الأخرى oviparous.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التحضير قبل التعرض
- اختر بويضات السمان المخصبة التي ولدت في نفس اليوم لاختبار التعرض.
- حدد بيض السمان مع أوزان مماثلة. كل بويضة السمان المخصبة حوالي 10-12 غرام.
- تنظيف جميع بيض السمان المخصبة بالكامل من البراز الخارجي والحطام الآخر.
- تعقيم كل بيضة السمان المخصبة قبل فقست والبيض لاستخدامها (اختيار البيض مع شكل قذيفة مماثلة، وخاصة غيض من البيض) مع محلول مضاد حيوي (البنسلين والستريبتوميسين، 1:1000، درجة حرارة الغرفة). تعقيم الحاضنة مع الإيثانول 75٪.
- فتح البيض مع نهاية حادة من مثقاب الأسنان، وترك قشر البيض في الطرف لمزيد من الاستخدام. قبل نقل البويضات المخصبة ، يتم سكب محتويات البويضات. هذا هو للحفاظ على رطوبة قشر البيض. وكان القطر الافتتاحي للبيضة حوالي 3 سم.
ملاحظة: للحد من الضرر الذي يلحق بجنين السمان، استخدم مثقاب الأسنان لفتح الطرف الحاد من البويضة وجعل الكراك سلسا قدر الإمكان. - بعد التعقيم، ضع بويضات السمان المخصبة في حاضنة 38 درجة مئوية مع رطوبة 60٪ لمدة 24-48 ساعة. تأكد من أن نهاية حادة من بيضة السمان يواجه.
- أثناء حضانة بويضات السمان المخصبة، قم بتعقيم الأدوات اللازمة في التجارب اللاحقة في وعاء التعقيم. وتشمل هذه الأدوات التفاف البلاستيك، كوب، والمياه العقيمة، نصائح ماصة، مقص الجراحية على التوالي، ملاقط، وملعقة.
ملاحظة: استخدم فيلما مع تحمل درجة حرارة عالية بما يكفي لتجنب المشاكل مع التعقيم في درجة حرارة عالية.
2. فقس بيضة السمان دون قذيفة
- نقل بيض السمان المخصبة قبل فقست من الحاضنة إلى مقعد نظيف ووضعها مسطحة على الحاوية لتحقيق الاستقرار لهم لمدة 1-2 دقيقة.
- استخدام مقص (12.5 سم الجراحية على التوالي مقص) لكزة ثقب صغير (قطر 3 ملم) في المحور المركزي للبيض السمان المخصبة قبل فقست وقطع 1-2 سم فتحة صغيرة. نقل بعناية بياض البيض وصفار بيض السمان المخصبة إلى قشر البيض قطع.
ملاحظة: عند قطع فتحة صغيرة مع مقص، وتجنب لمس صفار بيض السمان. - إضافة حل التحكم (بدون أعضاء البرلمان) والحل المكشوف من الكتل المختلفة (0.1، 0.2، و 0.3 ملغ) من البلاستيك الدقيق مع ثلاثة أحجام الجسيمات (100، 200، و 500 نانومتر) إلى محتويات البيض عن طريق ماصة. في الوقت نفسه، إضافة 1 قطرة من البنسلين و 1 قطرة من الستربتومايسين مع حقنة 1 مل.
- تغطية افتتاح قشر البيض مع الفيلم المعقم (الخطوة 1.6).
- وفقا للخطوة 2.1-2.4، علاج جميع بويضات السمان المخصبة.
- ضع أجنة السمان المنقولة في حاضنة 38 درجة مئوية مع رطوبة 60٪ للفترة اللازمة. في هذه التجربة، استخدم زاوية دوران البيض من ±30 درجة. بدوره البيض مرة واحدة في الساعة.
ملاحظة: يجب أن يكون النقل بأسرع وقت ممكن، الأمر الذي يتطلب المزيد من الممارسة في المرحلة المبكرة.
3. جمع العينات
- بعد سبعة أيام من الثقافة، قم بإزالة الأجنة المتطورة التي لاحظتها العين المجردة من الصفار واغسلها بمحلول الفوسفات المخزن مؤقتا (PBS).
- جفف محلول الفائض خارج الجنين النظيف بورق ماصة ووزنه في طبق بيتري نظيف.
- افتح تجويف الصدر بالكامل، وافصل الكبد والقلب عن الأحشاء بكشة أنف إبرة، وضع في أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل مباشرة بعد التطهير.
- سجل بسرعة الوزن على التوازن الإلكتروني وحساب مؤشر الكبد (HIS = وزن الكبد / وزن الجسم × 100). قياس طول القص والجسم.
- استنادا إلى المؤشرات المذكورة أعلاه، قم بتقييم تأثير أعضاء البرلمان على النمو الجنيني.
ملاحظة: جودة الجنين هنا يشير إلى نوعية إزالة صفار.
4. تحليل البيانات
- الإبلاغ عن البيانات التجريبية في شكل خطأ قياسي ± المتوسط (SEM).
- استخدم تحليل الفرق أحادي العامل لمقارنة وسائل مجموعات متعددة من العينات. قيمة الفرق الهامة كانت α = 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحليل البيانات التجريبية، قارنا الوزن الرطب وطول الجسم وطول القص وتغيير المؤشر الكبدي بين مجموعة التحكم والمجموعات التجريبية ال 6، وقياس وعكس نمو وتطور أجنة السمان من منظور كلي. اكتشفنا ستة أجنة سمان طبيعية في كل مجموعة. وصل كل جنين إلى مرحلة هامبورغر وهاملتون (HH) المطلوبة.
في الشكل 1، نقلنا محتويات بيض السمان المخصبة قبل الفقس إلى قشر البيض في نصف الكرة الغربي ووضعناها في الحاضنة. ثم سجلنا تطور الأجنة في منتصف فترة الحضانة لمدة ثلاثة أيام. كما هو مبين في الشكل 2، A-A2 هي مجموعة التحكم ، وB-B2 هي مجموعة علاج واحدة. من منظور نمو الأجنة العيانية ، تطورت الأجنة بشكل طبيعي دون الآثار الضارة للبلاستيك الدقيق.
الجدول 1 والجدول 2 هما متوسط ± SEM للوزن الرطب وطول الجسم وطول القص لجنين السمان بعد التعرض لمدة أسبوع واحد. وتبين الجداول أن الوزن الرطب وطول الجسم يتغيران تغيرا كبيرا في مختلف مجموعات التعرض. انخفض الوزن وطول الجسم للمجموعات المعالجة مع 0.1 ملغ, 0.3 ملغ, 100 نانومتر, و 500 نانومتر أعضاء البرلمان قليلا. زاد وزن الجسم وطول الجسم من 0.2 ملغ من 200 نانومتر مجموعات المعالجة microplastic قليلا (P < 0.05).
مؤشر الكبد (HIS) يظهر نسبة الكبد في جنين السمان، وهو علامة هامة للحكم على درجة نمو الكبد. وعلاوة على ذلك، يلعب HSI دورا هاما في الإمراض من إصابة غشاء خلايا الكبد والتسلل الالتهابي. كما هو مبين في الشكل 3 والشكل 4، مقارنة مع مجموعة التحكم ، زادت نسبة الكبد في مجموعة العلاج بأكملها بشكل كبير بعد التعرض للبلاستيك الدقيق. ومع ذلك، لم يكن هناك فرق كبير بين 0.2 ملغ و 0.3 ملغ من 100 نانومتر مجموعات العلاج أعضاء البرلمان ومجموعة التحكم.
الشكل 1:فقس بيض السمان بدون قشرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:تطور جنين السمان في اليوم السادس والسابع والثامن في المرحلة الوسطى من الفقس بدون قشر البيض. يشير السهم الأخضر إلى العينين؛ يشير السهم الأزرق إلى الأطراف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:مؤشر الكبد لأجنة السمان بعد التعرض لأعضاء البرلمان (نانومتر) لمدة 7 أيام. يشار إلى اختلافات كبيرة بين مجموعات التحكم والعلاج من خلال * P < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:مؤشر الكبد لأجنة السمان بعد التعرض لأعضاء البرلمان (μm) لمدة 7 أيام. يشار إلى اختلافات كبيرة بين مجموعات التحكم والعلاج من خلال * P < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| علاج النواب | الوزن (ز) | الطول (سم) | طول القص |
| تحكم | 2.509±0.324 | 5.425±0.477 | 1.025±0.094 |
| 100 نانومتر | 1.812±0.155* | 4.632±0.315* | 0.950±0.152 |
| 200 نانومتر | 2.272±0.368 | 5.297±0.268 | 1.025±0.076 |
| 500 نانومتر | 1.785±0.127* | 4.892±0.154* | 1.017±0.082 |
الجدول 1: الوزن الرطب وطول الجسم وطول القص لأجنة السمان بعد التعرض لأعضاء البرلمان (نانومتر) لمدة 7 أيام
| العلاج | الوزن (ز) | الطول (سم) | طول القص |
| تحكم | 2.161±0.166 | 5.23±0.26 | 1.10±0.04 |
| 0.1 ملغ | 1.960±0.338* | 4.82±0.75* | 1.04±0.04 |
| 0.2 ملغ | 2.410±0.366* | 5.25±0.26 | 1.07±0.10 |
| 0.3 ملغ | 1.901±0.759 | 4.95±0.15* | 1.02±0.09 |
الجدول 2: الوزن الرطب وطول الجسم وطول القص لأجنة السمان بعد التعرض لأعضاء البرلمان (μm) لمدة 7 أيام. مقارنة بمجموعة التحكم، يشير * إلى P < 0.05، يشير ** إلى P < 0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم هذه الورقة خطة تجريبية فعالة لتقييم نمو جنين السمان من خلال الكشف عن مؤشرات النمو الأساسية. ومع ذلك، لا تزال هناك بعض القيود على هذه التجربة.
أولا، معدل وفيات أجنة السمان في المرحلة اللاحقة من الفقس أعلى بسبب الفقس أقل قذيفة. هناك عوامل لا يمكن السيطرة عليها بشكل مصطنع مثل تدمير نسبة البروتين الطبيعية في العملية التجريبية. لقد حدنا من وقت تعرض الأجنة لضمان دقة التجربة. لا يمكن أن يحدث بحث السمية الجنينية إلا في المراحل المبكرة والوسطى من نمو الجنين. ثانيا، دراسة أعضاء البرلمان حول نمو جنين السمان تحدث فقط على مستوى التحليل المورفولوجي الأساسي. وبالتالي، فإن الاستنتاجات بسيطة نسبيا وقد توجد عيوب. وفي الوقت نفسه، فإن متطلبات الظروف التجريبية والتشغيل مرتفعة نسبيا في عملية هذه التجربة. ولذلك، يتم سرد بعض النقاط الجديرة بالملاحظة على النحو التالي:
من المهم جدا تطهير وتعقيم بويضات السمان المخصبة في الأعمال التحضيرية بسبب الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض الضارة على سطح بيض السمان المخصب. إذا تم تطهيرها ، قد تتدخل الميكروبات في بويضات السمان المخصبة أثناء الحضانة ، مما يؤدي إلى وفاة أجنة السمان. وحتى لو نجح النقل، فإن معدل الوفيات سيكون أعلى. لذلك ، ينبغي القيام بعمل جيد في التطهير والتعقيم للحد من الوفيات التجريبية.
عندما تفقس الطيور البيض ، فإنها غالبا ما تغير موضع البيض وتحافظ على دوران الهواء للحفاظ على درجة حرارة ثابتة للبيض والموقف الصحيح للجنين. استخدمت هذه التجربة الفيلم لختم قشر البيض. إذا كانت زاوية دوران البيض كبيرة جدا، ثم بياض البيض سوف تتدفق. إذا كان صغيرا جدا، ثم الالتصاق بين فيلم الجنين وفيلم قشر البيض قد يحدث، مما أدى إلى الأجنة الميتة. لذلك، تعيين زاوية الدوران وفقا للحالة الفعلية.
أثناء نقل أجنة السمان ، يتم وضع بويضات السمان المخصبة مسبقا أفقيا ثم تقطع في منتصف قشر البيض. وبهذه الطريقة ، يتدفق جزء صغير من بياض البيض بسهولة ، مما يدمر النسبة الطبيعية وتوزيع بياض البيض السميك والرقيق. وهذا يجعل الصفار، الذي كان ينبغي أن يكون في الأعلى، يميل إلى جانب واحد، مما تسبب في وفاة الجنين. لذلك، يجب الحرص على جعل كل بياض البيض يتدفق إلى قشر البيض نصف الكرة الأرضية الجديد لضمان النسبة الطبيعية والتوزيع أثناء النقل.
بعد النقل الناجح ، يجب على المجرب أن يحرص على عدم إسقاط السائل مباشرة. يجب أن يعتمد السائل على جدار قشر البيض لجعله يتدفق ببطء أثناء إضافة الملوثات والمضادات الحيوية.
بالإضافة إلى النقاط الأربع المذكورة أعلاه، تحكم بشكل صارم في ظروف الحضانة. تنسيق توازن درجة الحرارة والرطوبة والتهوية. الحفاظ على مختبر الحضانة هادئة ومظلمة لتحقيق أفضل بيئة حضانة.
وفي الختام، توفر هذه التجربة بروتوكولا أساسيا لدراسة آثار الملوثات البيئية على تطور أجنة السمان. وهناك أيضا أنواع أخرى من المؤشرات في دراسة النمو والتطور الجنيني، بما في ذلك نمو الأوعية الدموية، والإجهاد التأكسدي، وتلف الخلايا. التجربة المذكورة أعلاه ليست سوى تقييم العياني بسيطة من التطور الجنيني من الجانب المورفولوجي. وأخيرا، فإن فكرة البحث المحسنة والبروتوكول في المستقبل يمكن أن يوفر طريقة جديدة للدراسة السمية لنمو الجنين وتطوره.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه. ويعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة أو علاقات شخصية معروفة كان يمكن أن تؤثر على ما يبدو على عمل هذه الورقة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال مشاريع البحث والتطوير الرئيسية في منطقة شينجيانغ الويغورية ذاتية الحكم (2017B03014، 2017B03014-1، 2017B03014-2، 2017B03014-3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi sample tissue grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | Tissuelyser-24 | Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature |
| Electronic balance | OHAUS corporation | PR Series Precision | Used for weighing |
| Fertilized quail eggs | Guangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd. | Quail eggs for hatching without shell | |
| Fluorescent polypropylene particles | Foshan Juliang Optical Material Co., Ltd. | Types of plastics selected for the experiment | |
| Incubator | Shandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd. | 264 pc | Provide a place for embryo growth and development |
| Nanometer-scale polystyrene microspheres | Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. | 100 nm, 200 nm, 500 nm | Types of plastics selected for the experiment |
| Steel ruler | Deli Group | 20 cm | Used to measure length |
| Vertical heating pressure steam sterilizer | Shanghai Shenan Medical Instrument Factory | LDZM-80KCS-II | Sterilize the experimental articles |
References
- Geyer, R., Jambeck, J. R., Law, K. L. Production, use, and fate of all plastics ever made. Science Advances. 3 (7), 5 (2017).
- Thompson, R. C., et al. Lost at sea: Where is all the plastic. Science. 304 (5672), 838-838 (2004).
- Barletta, M., Lima, A. R. A., Costa, M. F. Distribution, sources and consequences of nutrients, persistent organic pollutants, metals and microplastics in South American estuaries. Science of the Total Environment. 651, 1199-1218 (2019).
- Eriksson, C., Burton, H., Fitch, S., Schulz, M., vanden Hoff, J. Daily accumulation rates of marine debris on sub-Antarctic island beaches. Marine Pollution Bulletin. 66 (1-2), 199-208 (2013).
- Zhang, C. F., et al. Microplastics in offshore sediment in the Yellow Sea and East China Sea, China. Environmental Pollution. 244, 827-833 (2019).
- Obbard, R. W., et al. Global warming releases microplastic legacy frozen in Arctic Sea ice. Earths Future. 2 (6), 315-320 (2014).
- Van Cauwenberghe, L., Vanreusel, A., Mees, J., Janssen, C. R.
- Wilcox, C., Van Sebille, E., Hardesty, B. D. Threat of plastic pollution to seabirds is global, pervasive, and increasing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11899-11904 (2015).
- Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: A review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
- Ferreira, G. V. B., Barletta, M., Lima, A. R. A. Use of estuarine resources by top predator fishes. How do ecological patterns affect rates of contamination by microplastics. Science of the Total Environment. 655, 292-304 (2019).
- Provencher, J. F., Vermaire, J. C., Avery-Gomm, S., Braune, B. M., Mallory, M. L. Garbage in guano? Microplastic debris found in faecal precursors of seabirds known to ingest plastics. Science of the Total Environment. 644, 1477-1484 (2018).
- Baulch, S., Perry, C. Evaluating the impacts of marine debris on cetaceans. Marine Pollution Bulletin. 80 (1-2), 210-221 (2014).
- Rochman, C. M., Kurobe, T., Flores, I., Teh, S. J. Early warning signs of endocrine disruption in adult fish from the ingestion of polyethylene with and without sorbed chemical pollutants from the marine environment. Science of the Total Environment. 493, 656-661 (2014).
- Mattsson, K., et al. Brain damage and behavioural disorders in fish induced by plastic nanoparticles delivered through the food chain. Scientific Reports. 7, 7 (2017).
- Brown, D. M., Wilson, M. R., MacNee, W., Stone, V., Donaldson, K. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine polystyrene particles: A role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicology and Applied Pharmacology. 175 (3), 191-199 (2001).
- Salvati, A., et al. Experimental and theoretical comparison of intracellular import of polymeric nanoparticles and small molecules: toward models of uptake kinetics. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 7 (6), 818-826 (2011).
- Frohlich, E., et al. Action of polystyrene nanoparticles of different sizes on lysosomal function and integrity. Particle and Fibre Toxicology. 9, 13 (2012).
- Bexiga, M. G., Kelly, C., Dawson, K. A., Simpson, J. C. RNAi-mediated inhibition of apoptosis fails to prevent cationic nanoparticle-induced cell death in cultured cells. Nanomedicine. 9 (11), 1651-1664 (2014).
- Lehner, R., Weder, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Emergence of Nanoplastic in the Environment and Possible Impact on Human Health. Environmental Science, Technology. 53 (4), 1748-1765 (2019).
- Pinsino, A., et al. Amino-modified polystyrene nanoparticles affect signalling pathways of the sea urchin (Paracentrotus lividus) embryos. Nanotoxicology. 11 (2), 201-209 (2017).
- El-Ghali, N., Rabadi, M., Ezin, A. M., De Bellard, M. E. New Methods for Chicken Embryo Manipulations. Microscopy Research and Technique. 73 (1), 58-66 (2010).
- Rashidi, H., Sottile, V. The chick embryo: hatching a model for contemporary biomedical research. Bioessays. 31 (4), 459-465 (2009).
- Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo characterization of ultrasound contrast agents: microbubble spectroscopy in a chicken embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Ribeiro, C. A. O., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Li, X. D., et al. Caffeine interferes embryonic development through over-stimulating serotonergic system in chicken embryo. Food and Chemical Toxicology. 50 (6), 1848-1853 (2012).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (11), 2776-2796 (2018).
- Alejo-Plata, M. D., Herrera-Galindo, E., Cruz-Gonzalez, D. G. Description of buoyant fibers adhering to Argonauta nouryi (Cephalopoda: Argonautidae) collected from the stomach contents of three top predators in the Mexican South Pacific. Marine Pollution Bulletin. 142, 504-509 (2019).
