Summary
В данной работе представлен метод вылупления без использования яичной скорлупы для токсикологических исследований твердых загрязнителей, таких как микропластик.
Abstract
Микропластик является новым глобальным типом загрязнителей, который представляет большую угрозу для здоровья животных из-за их поглощения и перемещения в тканях и органах животных. Экотоксикологические эффекты микропластика на развитие эмбрионов птиц не известны. Птичье яйцо представляет собой полноценную систему развития и питания, а все развитие эмбриона происходит в яичной скорлупе. Таким образом, прямая запись развития эмбрионов птиц под давлением загрязняющих веществ, таких как микропластик, сильно ограничена непрозрачной яичной скорлупой в традиционном инкубатории. В этом исследовании влияние микропластика на развитие эмбриона перепела визуально контролировалось путем вылупления без яичной скорлупы. Основные этапы включают очистку и дезинфекцию оплодотворенных яйцеклеток, инкубацию перед воздействием, кратковременную инкубацию после воздействия и извлечение образца. Результаты показывают, что по сравнению с контрольной группой, влажный вес и длина тела группы, подвергаемой воздействию микропластика, показали статистическую разницу, а доля печени всей подвергойся воздействию группы значительно увеличилась. Дополнительно мы оценили внешние факторы, влияющие на инкубацию: температуру, влажность, угол вращения яйца и другие условия. Этот экспериментальный метод предоставляет ценную информацию об экотоксикологии микропластика и новый способ изучения неблагоприятного воздействия загрязняющих веществ на развитие эмбрионов.
Introduction
Производство пластиковых отходов в 2015 году составило около 6300 млн тонн, одна часть из которых была переработана, а остальная часть была сожжена или похоронена под землей. По оценкам, около 12 000 млн тонн пластиковых отходов будут захоронены под землей к 2050году1. С вниманием международного сообщества к пластиковым отходам, Томпсон впервые предложил концепцию микропластика в 2004году 2. Микропластики (МП) относятся к мелким твердым пластмассам с диаметром частиц менее 5 мм. В настоящее время исследователи обнаружили повсеместное присутствие депутатов на береговой линии различных континентов, атлантических островов, внутренних озер, Арктики и глубоководных местообитаний3,4,5,6,7. Поэтому все больше исследователей начали изучать экологические опасности депутатов.
Организмы могут поглощать депутатов в окружающей среде. В пищеварительном тракте были обнаружены 233 морских организма по всему миру (в том числе 100% видов черепах, 36% видов тюленей, 59% видов китов, 59% видов морских птиц, 92 видов морских рыб и 6 видов беспозвоночных)8. Более того, депутаты могут блокировать пищеварительную систему организмов, накапливаться и мигрировать в своих бобах9. Установлено, что депутаты могут передаваться по пищевой цепочке, и их потребление отличается изменениями среды обитания, стадией роста, пищевыми привычками и источниками пищи10. Некоторые исследователи сообщили о существовании депутатов в помете морских птиц11,а это значит, что морские птицы выступают в качестве переносчика депутатов. Кроме того, прием внутрь депутатов может повлиять на здоровье некоторых организмов. Например, депутаты могут запутаться в желудочно-кишечном тракте, тем самым увеличив смертность китообразных12.
Только депутаты оказывают токсическое воздействие на организмы, а также совместное токсическое воздействие на организмы с другими загрязнителями. Проглатывание связанных с окружающей средой концентраций пластикового мусора может нарушить функцию эндокринной системы взрослых рыб13. Размер микропластиков является одним из важных факторов, влияющих на их усвоено и накопление организмами14,15. Малогабаритные пластмассы, особенно наноразмерные, склонны к взаимодействию с клетками и организмами с высокой токсичностью16,17,18,19. Хотя вредное воздействие микропластиков размером наночастицы на организмы превышает текущий уровень исследований, обнаружение и количественная оценка микропластиков с размерами менее нескольких микрометров, особенно субмикронов / нанопластиков в окружающей среде, по-прежнему является большой проблемой. Кроме того, нанопластики также оказывают некоторое влияние на эмбрионы. Полистирол может повредить развитие эмбрионов морских ежей, регулируя профили белка и генов20.
Чтобы изучить потенциальное влияние депутатов на организмы, мы провели это исследование. Из-за сходства между эмбрионами птиц и человеческими эмбрионами они обычно используются в исследованиях биологии развития21, включая ангиогенез и антиангиогенез, тканевую инженерию, имплантат биоматериала и опухоли головного мозга22,23,24. Эмбрионы птиц обладают преимуществами низкой стоимости, короткого цикла культивации и простоты эксплуатации25,26. Поэтому мы выбрали эмбрионы перепелов с коротким циклом роста в качестве экспериментального животного в этом исследовании. Одновременно мы можем непосредственно наблюдать морфологические изменения эмбрионов перепелов, подвергшихся воздействию МП на стадии эмбрионального развития, используя технологию инкубационного вылупления без яичной скорлупы. Экспериментальными материалами были полипропилен (ПП) и полистирол (ПС). Поскольку pp и PS27 составляют наибольшую долю типов полимеров, полученных в отложениях и водоемах во всем мире, наиболее распространенными типами полимеров, извлеченными из захваченных морских организмов, являются этилен и пропилен28. Этот экспериментальный протокол описывает весь процесс визуальной оценки токсикологического воздействия депутатов на эмбрионы перепелов, подвергшиеся воздействию депутатов. Мы можем легко расширить этот метод для изучения токсичности других загрязняющих веществ для развития эмбрионов других яйцекладущих животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка перед воздействием
- Отбирайте оплодотворенные перепелиные яйца, рожденные в тот же день, для теста на воздействие.
- Выбирайте перепелиные яйца с одинаковым весом. Каждая оплодотворенная перепелиная яйцеклетка составляет около 10-12 г.
- Полностью очистите все оплодотворенные перепелиные яйца от внешнего кала и другого мусора.
- Стерилизуйте каждое предварительно вылупившиеся оплодотворенное перепелиное яйцо и яйца, которые будут использоваться (выбирайте яйца с похожей формой скорлупы, особенно кончик яйца) раствором антибиотика (пенициллин и стрептомицин, 1:1000, комнатная температура). Стерилизуйте инкубатор 75% этанолом.
- Откройте яйца тупым концом бормашины, оставив яичную скорлупу на кончике для дальнейшего использования. Перед переносом оплодотворенных яйцеклеток содержимое яйцеклеток выливается наружу. Это для удержания влаги яичной скорлупы. Диаметр отверстия яйца составлял около 3 см.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить повреждение эмбриона перепела, используйте бормашилу, чтобы открыть тупой конец яйца и сделать трещину как можно более гладкой. - После стерилизации поместите оплодотворенные перепелиные яйца в инкубатор при температуре 38 °C с влажностью 60% в течение 24-48 ч. Убедитесь, что тупой конец перепелиного яйца обращен вверх.
- Во время инкубации оплодотворенных перепелиных яиц стерилизуйте инструменты, необходимые в последующих экспериментах, в стерилизационном горшке. Эти инструменты включают в себя полиэтиленовую пленку, бикер, стерильную воду, наконечники пипеток, хирургические прямые ножницы, пинцет и ложку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пленку с температурным допуском, достаточно высоким, чтобы избежать проблем с высокотемпературной стерилизацией.
2. Вылупление перепелиного яйца без скорлупы
- Переложите предварительно вылупившиеся оплодотворенные перепелиные яйца из инкубатора на чистую скамейку и положите их ровно на контейнер, чтобы стабилизировать их примерно на 1-2 мин.
- С помощью ножниц (хирургические прямые ножницы 12,5 см) проткните небольшое отверстие (диаметром 3 мм) в центральной оси предварительно вылупившихся оплодотворенных перепелиных яиц и вырежьте 1-2 см небольшое отверстие. Аккуратно перенесите яичный белок и желток оплодотворенных перепелиных яиц в разрезанную яичную скорлупу.
ПРИМЕЧАНИЕ: При разрезании ножницами небольшого отверстия избегайте прикосновения к желтку перепелиных яиц. - Добавляем контрольный раствор (без МП) и открытый раствор различных масс (0,1, 0,2 и 0,3 мг) микропластика с тремя размерами частиц (100, 200 и 500 нм) к содержимому яйца пипеткой. При этом добавляют 1 каплю пенициллина и 1 каплю стрептомицина шприцем 1 мл.
- Закройте отверстие яичной скорлупы стерилизованной пленкой (шаг 1.6).
- Согласно шагу 2.1-2.4 обработайте все оплодотворенные перепелиные яйца.
- Поместите перенесенные эмбрионы перепелов в инкубатор с температурой 38 °C с влажностью 60% на необходимый период. В этом эксперименте используйте угол поворота яйца ±30°. Переворачивайте яйца раз в час.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перевод должен быть как можно более быстрым, что требует большей практики на ранней стадии.
3. Сбор образцов
- После семи дней культивирование удаляют из желтка хорошо развитые эмбрионы, наблюдаемые невооруженным глазом, и промывают фосфатно-буферным раствором (ПБС).
- Высушите излишки раствора вне очищенного эмбриона абсорбирующей бумагой и взвесьте в чистой чашке Петри.
- Откройте всю грудную полость, отделите печень и сердце от внутренних органов плоскогубцами и иглонос и поместите в центрифужные трубки объемом 1,5 мл сразу после очистки.
- Быстро запишите вес на электронные весы и рассчитайте гепатосоматический индекс (HIS = вес печени / масса тела х 100). Измерьте длину грудины и тела.
- Исходя из вышеуказанных показателей, оцените влияние депутатов на эмбриональное развитие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Качество эмбриона здесь относится к качеству удаления желтка.
4. Анализ данных
- Сообщайте экспериментальные данные в виде средней ± стандартной погрешности (SEM).
- Используйте однофакторный дисперсионный анализ для сравнения средних нескольких групп образцов. Значение существенной разницы составило α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для анализа экспериментальных данных мы сравнили влажную массу, длину тела, длину грудины и изменение гепатосоматического индекса между контрольной группой и 6 экспериментальными группами, измеряя и отражая рост и развитие эмбрионов перепелов с макроперрости. Мы обнаружили шесть нормальных эмбрионов перепелов в каждой группе. Каждый эмбрион достиг требуемой стадии Гамбургера и Гамильтона (HH).
На рисунке 1мы перенесли предварительно вылупившиеся оплодотворенные перепелиные яйца в яичную скорлупу полушария и поместили их в инкубатор. Затем мы зафиксировали развитие эмбрионов в среднем периоде инкубации в течение трех дней. Как показано на рисунке 2,A-A2 является контрольной группой, а B-B2 - одной группой лечения. С точки зрения макроскопического развития эмбриона, эмбрионы развивались нормально без неблагоприятного воздействия микропластика.
Таблица 1 и Таблица 2 представляют собой среднюю ± SEM влажного веса, длины тела и длины грудины эмбриона перепела после недельного воздействия. Таблицы показывают, что вес влаги и длина тела значительно изменяются в разных группах воздействия. Масса и длина тела групп, получавших 0,1 мг, 0,3 мг, 100 нм и 500 нм МП, несколько уменьшились. Масса тела и длина тела 0,2 мг 200 нм обработанных микропластиком групп увеличились незначительно (Р < 0,05).
Гепатосоматический индекс (HIS) показывает долю печени в перепелином эмбрионе, что является важным признаком для оценки степени развития печени. Кроме того, HSI играет важную роль в патогенезе повреждения клеточных мембран печени и воспалительной инфильтрации. Как показано на Фиг.3 и Фиг.4,по сравнению с контрольной группой, доля печени во всей группе лечения значительно увеличилась после воздействия микропластика. Тем не менее, не было выявлено существенной разницы между 0,2 мг и 0,3 мг 100 нм групп лечения МП и контрольной группой.
Рисунок 1:Вылупление перепелиных яиц без скорлупы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Развитие эмбриона перепела на 6-й, 7-й и 8-й день в средней стадии вылупления без яичной скорлупы. Зеленая стрелка указывает на глаза; синяя стрелка указывает на конечности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Гепатосоматический индекс эмбрионов перепелов после воздействия МП (нм) в течение 7 дней. Значимые различия между контрольной и лечебной группами обозначены * P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Гепатосоматический индекс эмбрионов перепелов после воздействия МП (мкм) в течение 7 дней. Значимые различия между контрольной и лечебной группами обозначены * P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Лечение депутатов | Вес (г) | Длина (см) | Длина грудины |
| Контроль | 2.509±0.324 | 5.425±0.477 г. | 1.025±0.094 г. |
| 100 морских миль | 1.812±0.155* | 4.632±0.315* | 0.950±0.152 |
| 200 морских миль | 2.272±0.368 | 5.297±0.268 г. | 1.025±0.076 г. |
| 500 морских миль | 1.785±0.127* | 4.892±0.154* | 1.017±0.082 г. |
Таблица 1: Влажная масса, длина тела и длина грудины эмбрионов перепелов после воздействия МП (нм) в течение 7 дней
| Лечение | Вес (г) | Длина (см) | Длина грудины |
| Контроль | 2.161±0.166 | 5.23±0.26 | 1.10±0.04 |
| 0,1 мг | 1.960±0.338* | 4.82±0.75* | 1.04±0.04 |
| 0,2 мг | 2.410±0.366* | 5.25±0.26 | 1.07±0.10 |
| 0,3 мг | 1.901±0.759 | 4.95±0.15* | 1.02±0.09 |
Таблица 2: Влажная масса, длина тела и длина грудины эмбрионов перепелов после воздействия МП (мкм) в течение 7 дней. По сравнению с контрольной группой * указывает на P < 0,05, ** указывает на P < 0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной работе представлена эффективная экспериментальная схема оценки развития эмбриона перепела путем выявления основных показателей развития. Тем не менее, есть еще некоторые ограничения для этого эксперимента.
Во-первых, смертность эмбрионов перепелов на более поздней стадии вылупления выше из-за вылупления без раковины. Существуют искусственно неконтролируемые факторы, такие как разрушение нормального соотношения белков в экспериментальном процессе. Мы ограничили время воздействия эмбрионов, чтобы обеспечить точность эксперимента. Исследование эмбриотоксичности может происходить только на ранних и средних стадиях развития эмбриона. Во-вторых, изучение депутатами развития эмбрионов перепелов происходит только на уровне базового морфологического анализа. Таким образом, выводы относительно просты и могут существовать дефекты. В то же время требования к экспериментальным условиям и эксплуатации относительно высоки в процессе этого эксперимента. Поэтому некоторые примечательные моменты перечислены ниже:
Очень важно дезинфицировать и стерилизовать оплодотворенные перепелиные яйца в подготовительной работе из-за вредных патогенных микроорганизмов на поверхности оплодотворенных перепелиных яиц. При дезинфекции микробы могут вторгаться в оплодотворенные перепелиные яйца во время инкубации, что приводит к гибели эмбрионов перепелов. Даже если передача будет успешной, смертность будет выше. Поэтому следует проделать хорошую работу по дезинфекции и стерилизации, чтобы снизить экспериментальную смертность.
Когда птицы высиживают яйца, они часто меняют положение яиц и поддерживают циркуляцию воздуха, чтобы поддерживать постоянную температуру для яиц и правильное положение для плода. В этом эксперименте использовалась пленка для запечатывания яичной скорлупы. Если угол вращения яйца слишком большой, то яичный белок вытечет наружу. Если он слишком мал, то может произойти адгезия между пленкой эмбриона и пленкой яичной скорлупы, что приведет к мертвым эмбрионам. Поэтому установите угол поворота в соответствии с фактической ситуацией.
Во время переноса эмбрионов перепелов предварительно оплодотворенные перепелиные яйца помещают горизонтально, а затем разрезают в середине яичной скорлупы. Таким образом, небольшая часть яичного белка легко вытекает наружу, что разрушает нормальную пропорцию и распределение толстого и тонкого яичного белка. Это заставляет желток, который должен был быть сверху, наклоняется в одну сторону, в результате чего эмбрион умирает. Поэтому позаботьтесь о том, чтобы весь яичный белок тек в новую яичную скорлупу в полушарии, чтобы обеспечить нормальную пропорцию и распределение во время переноса.
После успешного переноса экспериментатор должен быть осторожен, чтобы не уронить жидкость напрямую. Жидкость должна полагаться на стенку яичной скорлупы, чтобы заставить ее течь медленно во время добавления загрязняющих веществ и антибиотиков.
Помимо четырех пунктов, упомянутых выше, строго контролируйте условия инкубации. Координация баланса температуры, влажности и вентиляции. Держите инкубационную лабораторию тихой и темной для достижения наилучшей среды инкубации.
В заключение, этот эксперимент обеспечивает базовый протокол для изучения воздействия загрязнителей окружающей среды на развитие эмбрионов перепелов. Существуют и другие типы показателей при изучении эмбрионального роста и развития, включая развитие сосудов, окислительный стресс и повреждение клеток. Приведенный выше эксперимент является лишь простой макроскопической оценкой эмбрионального развития с морфологического аспекта. Наконец, улучшенная исследовательская идея и протокол в будущем могут обеспечить новый метод токсикологического исследования роста и развития эмбрионов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать. Все авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу этой статьи.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана ключевыми научно-исследовательскими проектами в Синьцзян-Уйгурском автономном районе (2017B03014, 2017B03014-1, 2017B03014-2, 2017B03014-3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi sample tissue grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | Tissuelyser-24 | Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature |
| Electronic balance | OHAUS corporation | PR Series Precision | Used for weighing |
| Fertilized quail eggs | Guangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd. | Quail eggs for hatching without shell | |
| Fluorescent polypropylene particles | Foshan Juliang Optical Material Co., Ltd. | Types of plastics selected for the experiment | |
| Incubator | Shandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd. | 264 pc | Provide a place for embryo growth and development |
| Nanometer-scale polystyrene microspheres | Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. | 100 nm, 200 nm, 500 nm | Types of plastics selected for the experiment |
| Steel ruler | Deli Group | 20 cm | Used to measure length |
| Vertical heating pressure steam sterilizer | Shanghai Shenan Medical Instrument Factory | LDZM-80KCS-II | Sterilize the experimental articles |
References
- Geyer, R., Jambeck, J. R., Law, K. L. Production, use, and fate of all plastics ever made. Science Advances. 3 (7), 5 (2017).
- Thompson, R. C., et al. Lost at sea: Where is all the plastic. Science. 304 (5672), 838-838 (2004).
- Barletta, M., Lima, A. R. A., Costa, M. F. Distribution, sources and consequences of nutrients, persistent organic pollutants, metals and microplastics in South American estuaries. Science of the Total Environment. 651, 1199-1218 (2019).
- Eriksson, C., Burton, H., Fitch, S., Schulz, M., vanden Hoff, J. Daily accumulation rates of marine debris on sub-Antarctic island beaches. Marine Pollution Bulletin. 66 (1-2), 199-208 (2013).
- Zhang, C. F., et al. Microplastics in offshore sediment in the Yellow Sea and East China Sea, China. Environmental Pollution. 244, 827-833 (2019).
- Obbard, R. W., et al. Global warming releases microplastic legacy frozen in Arctic Sea ice. Earths Future. 2 (6), 315-320 (2014).
- Van Cauwenberghe, L., Vanreusel, A., Mees, J., Janssen, C. R.
- Wilcox, C., Van Sebille, E., Hardesty, B. D. Threat of plastic pollution to seabirds is global, pervasive, and increasing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11899-11904 (2015).
- Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: A review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
- Ferreira, G. V. B., Barletta, M., Lima, A. R. A. Use of estuarine resources by top predator fishes. How do ecological patterns affect rates of contamination by microplastics. Science of the Total Environment. 655, 292-304 (2019).
- Provencher, J. F., Vermaire, J. C., Avery-Gomm, S., Braune, B. M., Mallory, M. L. Garbage in guano? Microplastic debris found in faecal precursors of seabirds known to ingest plastics. Science of the Total Environment. 644, 1477-1484 (2018).
- Baulch, S., Perry, C. Evaluating the impacts of marine debris on cetaceans. Marine Pollution Bulletin. 80 (1-2), 210-221 (2014).
- Rochman, C. M., Kurobe, T., Flores, I., Teh, S. J. Early warning signs of endocrine disruption in adult fish from the ingestion of polyethylene with and without sorbed chemical pollutants from the marine environment. Science of the Total Environment. 493, 656-661 (2014).
- Mattsson, K., et al. Brain damage and behavioural disorders in fish induced by plastic nanoparticles delivered through the food chain. Scientific Reports. 7, 7 (2017).
- Brown, D. M., Wilson, M. R., MacNee, W., Stone, V., Donaldson, K. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine polystyrene particles: A role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicology and Applied Pharmacology. 175 (3), 191-199 (2001).
- Salvati, A., et al. Experimental and theoretical comparison of intracellular import of polymeric nanoparticles and small molecules: toward models of uptake kinetics. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 7 (6), 818-826 (2011).
- Frohlich, E., et al. Action of polystyrene nanoparticles of different sizes on lysosomal function and integrity. Particle and Fibre Toxicology. 9, 13 (2012).
- Bexiga, M. G., Kelly, C., Dawson, K. A., Simpson, J. C. RNAi-mediated inhibition of apoptosis fails to prevent cationic nanoparticle-induced cell death in cultured cells. Nanomedicine. 9 (11), 1651-1664 (2014).
- Lehner, R., Weder, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Emergence of Nanoplastic in the Environment and Possible Impact on Human Health. Environmental Science, Technology. 53 (4), 1748-1765 (2019).
- Pinsino, A., et al. Amino-modified polystyrene nanoparticles affect signalling pathways of the sea urchin (Paracentrotus lividus) embryos. Nanotoxicology. 11 (2), 201-209 (2017).
- El-Ghali, N., Rabadi, M., Ezin, A. M., De Bellard, M. E. New Methods for Chicken Embryo Manipulations. Microscopy Research and Technique. 73 (1), 58-66 (2010).
- Rashidi, H., Sottile, V. The chick embryo: hatching a model for contemporary biomedical research. Bioessays. 31 (4), 459-465 (2009).
- Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo characterization of ultrasound contrast agents: microbubble spectroscopy in a chicken embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Ribeiro, C. A. O., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Li, X. D., et al. Caffeine interferes embryonic development through over-stimulating serotonergic system in chicken embryo. Food and Chemical Toxicology. 50 (6), 1848-1853 (2012).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (11), 2776-2796 (2018).
- Alejo-Plata, M. D., Herrera-Galindo, E., Cruz-Gonzalez, D. G. Description of buoyant fibers adhering to Argonauta nouryi (Cephalopoda: Argonautidae) collected from the stomach contents of three top predators in the Mexican South Pacific. Marine Pollution Bulletin. 142, 504-509 (2019).
