Summary
La procédure décrit l’isolement des villosités de l’épithélium intestinal de la souris subissant une dédifférenciation afin de déterminer leur potentiel de formation organoïde.
Abstract
La clonogénicité des organoïdes de l’épithélium intestinal est attribuée à la présence de cellules souches dans celui-ci. L’épithélium de l’intestin grêle de la souris est compartimenté en cryptes et villosités : la tige et les cellules proliférantes sont confinées dans les cryptes, tandis que l’épithélium des villosités ne contient que des cellules différenciées. Par conséquent, les cryptes intestinales normales, mais pas les villosités, peuvent donner naissance à des organoïdes dans les cultures 3D. La procédure décrite ici ne s’applique qu’à l’épithélium des villosités subissant une dédifférenciation conduisant à la tige. La méthode décrite utilise la souris mutante conditionnelle Smad4-loss-of-function:β-caténine gain-of-function (Smad4KO:β-caténineGOF). La mutation provoque la dédifférenciation des villosités intestinales et la génération de cellules souches dans les villosités. Les villosités intestinales subissant une dédifférenciation sont grattées de l’intestin à l’aide de lames de verre, placées dans une passoire de 70 μm et lavées plusieurs fois pour filtrer les cellules lâches ou les cryptes avant le placage dans la matrice BME-R1 afin de déterminer leur potentiel de formation organoïde. Deux critères principaux ont été utilisés pour s’assurer que les organoïdes résultants ont été développés à partir du compartiment des villosités dédifférenciantes et non à partir des cryptes: 1) évaluer au microscope les villosités isolées pour s’assurer de l’absence de cryptes attachées, avant et après le placage dans la matrice 3D, et 2) surveiller le déroulement du développement organoïde à partir des villosités. L’initiation organoïde à partir des villosités ne se produit que deux à cinq jours après le placage et semble de forme irrégulière, tandis que les organoïdes dérivés de la crypte du même épithélium intestinal sont apparents dans les seize heures suivant le placage et semblent sphériques. La limite de la méthode, cependant, est que le nombre d’organoïdes formés et le temps nécessaire à l’initiation organoïde à partir des villosités varient en fonction du degré de dédifférenciation. Par conséquent, en fonction de la spécificité de la mutation ou de l’insulte à l’origine de la dédifférenciation, le stade optimal auquel les villosités peuvent être prélevées pour déterminer leur potentiel de formation organoïde doit être déterminé empiriquement.
Introduction
Les cryptes intestinales, mais pas les villosités, forment des organoïdes lorsqu’elles sont cultivées dans une matrice de Matrigel ou de BME-R1. Ces organoïdes sont des structures auto-organisatrices, souvent appelées « mini-intestin » en raison de la présence des différentes lignées différenciées, progéniteurs et cellules souches présents dans l’épithélium intestinal in vivo. Le potentiel de formation d’organoïdes à partir de cryptes est attribué à la présence de cellules souches1. Les villosités intestinales, d’autre part, ne sont constituées que de cellules différenciées et ne peuvent donc pas former d’organoïdes. Cependant, les mutations2 ou les conditions qui permettent la dédifférenciation de l’épithélium des villosités peuvent conduire à des cellules souches dans lesvillosités 2,3. Ce changement de destin entraînant une tige dans l’épithélium des villosités peut être confirmé en plaquant l’épithélium villositédifférenciant dans une matrice 3D afin de déterminer leur potentiel de formation d’organoïdes comme indicateur de la tige de novo dans l’épithélium villus. Par conséquent, l’aspect critique de cette procédure est d’assurer l’absence de contamination de la crypte.
La mutation conditionnelle Smad4KO:β-caténineGOF provoque une dédifférenciation dans l’épithélium intestinal marquée par l’expression de marqueurs de prolifération et de cellules souches dans les villosités, et finalement la formation de structures de type crypte dans les villosités appelées cryptes ectopiques La présence de cellules souches ces villosités dédifférenciées a été déterminée par l’expression de marqueurs de cellules souches dans les cryptes ectopiques(in vivo)et la capacité des villosités mutantes à former des organoïdes wh en plaqué Matrigel3. La procédure mentionnée ci-dessous élabore la méthodologie utilisée pour confirmer la tige de l’épithélium intestinal dédifférenciant chez les souris mutantes Smad4KO:β-caténineGOF. Une caractéristique clé de cette méthodologie pour isoler les villosités était l’utilisation du grattage de la lumière intestinale, par opposition à la méthode de chélation EDTA4. Contrairement à la méthode de chélation EDTA, l’isolement des villosités par grattage conserve la majorité du mésenchyme sous-jacent et permet d’ajuster la pression de grattage pour produire des villosités sans cryptes attachées. La pression de raclage est subjective pour l’opérateur, par conséquent, la pression optimale pour produire des villosités sans cryptes attachées doit être déterminée empiriquement par l’opérateur. L’aspect critique de cette procédure est d’assurer l’absence de contamination de la crypte par un examen microscopique des villosités avant et après le placage dans la matrice BME-R1.
Les villosités intestinales sont grattées de la lumière intestinale avec des lames de verre et placées dans un filtre de 70 μm et lavées avec du PBS pour se débarrasser des cellules lâches ou des cryptes, le cas échéant, avant le placage dans la matrice BME-R1. La méthode met l’accent sur les critères suivants pour éviter la contamination des tésiers : a) confiner la récolte des villosités dans la moitié proximale du duodénum où les villosités sont les plus longues, b) minimiser le nombre d’éraflures produisant des villosités, c) laver le filtre contenant les villosités à travers une série de PBS dans une boîte à six puits, et d) confirmer l’absence de contamination des cryptes par un examen microscopique avant et après le placage dans la matrice BME-R1. L’isolement de Villosité par grattage, plutôt que par chélation EDTA, empêche la perte complète du mésenchyme sous-jacent qui peut fournir les signaux de niche5,6,7,8, si nécessaire, pour l’initiation organoïde de l’épithélium villus.
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Protocol
Toutes les expériences menées sur des souris, y compris l’utilisation du tamoxifène et l’euthanasie par luxation cervicale, ont reçu l’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut d’echnologie Stevens.
1. Souris
NOTE : La génération de Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Des souris Villin-CreERT2 ont déjà été décrites3. Des souris femelles adultes âgées de huit à douze semaines ont été utilisées.
- Induire la mutation Smad4KO:β-caténineGOF dans le Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 avec injection intrapéritonéale de tamoxifène dans l’huile de maïs pendant quatre jours consécutifs.
- Sacrifier la luxation cervicale de la souris dix jours après la première injection de tamoxifène.
- Vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70% pour empêcher la fourrure de souris de pénétrer dans la cavité péritonéale.
- Ouvrez la cavité abdominale avec des ciseaux à dissection pour exposer l’intestin. Isolez l’intestin à l’aide des ciseaux et des pinces.
NOTE: La perte concomitante de Smad4 et le gain de mutation fonctionnelle de la β-caténine (Smad4KO;β-caténineGOF) dans l’épithélium intestinal ont été obtenus par injectionde Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Souris Villin-CreERT2 tous les jours pendant quatre jours consécutifs avec 0,05 g de tamoxifène / kg de poids corporel dans l’huile de maïs. Ces souris sont récoltées dix jours après la première injection de tamoxifène pour assurer la présence de cellules exprimant des marqueurs associés aux cellules souches dans les villosités dédifférenciées.
2. Isolement et préparation du duodénum
- Disséquer la moitié proximale du duodénum.
- Rincez le duodénum avec 5 mL de PBS glacé dans une seringue de 10 mL pour dégager le contenu luminal.
- Ouvrez le duodénum longitudinalement avec un ciseau incliné et posez le duodénum à plat sur une plaque de Petri de 15 cm sur de la glace avec la lumière du duodénum face à l’opérateur.
3. Isolation des villosités par raclage
- Avant de commencer le raclage, placez une passoire à mailles de 70 μm dans l’un des puits d’une plaque de culture tissulaire de 6 puits. Remplissez tous les puits avec 4 mL de 1x PBS et placez la plaque de culture tissulaire de 6 puits sur de la glace (Figure 1).
- Grattez les villosités comme suit à l’aide de deux lames de verre microscopiques : l’une pour maintenir le duodénum vers le bas et l’autre pour gratter (Figure 1B1).
- Gratter le côté luminal du duodénum superficiellement deux fois pour éliminer le mucus. Appliquez une pression telle que cette étape élimine la couche de mucus, mais pas les villosités.
- Gratter à nouveau le duodénum, en appliquant deux fois la même pression que dans 3..1, au cours de laquelle on peut voir des villosités s’accumuler sur les diapositives (Figure 1B2). C’est la pression optimale (qui doit être déterminée empiriquement par l’opérateur) pour donner les villosités sans les cryptes attachées.
- Utilisez une pipette de transfert de 1 mL contenant du PBS pour transférer les villosités (qui sont recueillies sur la glissière de l’étape 3.2.2.) vers une passoire à mailles de 70 μm placée dans une boîte à 6 puits. Les villosités sont ainsi collectées après chaque éraflure (Figure 1B2).
- Laver les villosités recueillies dans la passoire de 70 μm (à partir de l’étape 3.3) en transférant la passoire (avec les villosités) à travers une série de puits dans un plat de 6 puits contenant du PBS froid (~ 4 mL/puits). Il s’agit d’enlever les cryptes lâches, le cas échéant.
- À l’aide d’une pipette p1000, transférer la suspension de villosités en PBS (~ 3 mL) de la passoire de 70 μm vers un nouveau tube de 15 mL sur glace.
- Utilisez une pointe de pipette p200 à 0,1 % enduite de BSA pour aspirer un volume de 50 μL de la suspension à villosités sur une glissière en verre. Compter le nombre de villosités dans la gouttelette de 50 μL sous grossissement 4x pour déterminer la concentration de villosités dans la suspension PBS. Par exemple, s’il y a 10 villosités dans la suspension de 50 μL examinée, la concentration en villosités est de 0,2 villosités/μL. C’est aussi le moment de confirmer l’absence de cryptes attachées.
- Calculer le volume de suspension de villosités requis pour plaquer à une concentration de 0,5 villosités/μL de matrice BME-R1. Ajouter 100 μL supplémentaires pour tenir compte de l’erreur de pipetage et du volume requis pour l’examen microscopique requis pour assurer la pureté des villosités.
ATTENTION: La pression utilisée dans les deux premières éraflures, qui élimine le mucus mais pas les villosités, doit être utilisée dans les éraflures suivantes au cours desquelles les villosités seront libérées. Limitez le nombre de grattements aller-retour à deux après la première observation de la libération des villosités. Cette mesure évite la libération de villosités avec les cryptes attachées. Il est essentiel d’évaluer microscopiquement les villosités pour s’assurer de l’absence des cryptes attachées.
4. Placage des villosités sur la matrice BME-R1
- À l’aide d’une pointe de pipette p200 émoussée revêtue de BSA à 0,1 %, transférez dans un tube de microcentrifugation le volume de villosités (à partir de l’étape 3.6) nécessaire à la plaque à une densité de ~ 6 villosités par puits dans 12,5 μL de matrice BME-R1. L’utilisation d’une pointe émoussée revêtue de BSA à ce stade garantit que les villosités, qui sont trop grandes pour une pointe pointue, sont aspirées sans être bloquées ou perdues d’être collées sur les côtés de la pointe.
- Faire tourner les villosités pendant 2 min à 200 x g dans une centrifugeuse réfrigérée (4 °C) et retirer le surnageant.
- Répétez l’étape 4.2 pour retirer tout PBS résiduel et passez à l’étape suivante sous une hotte à flux laminaire.
- Remettez ensemencez doucement la pastille dans la quantité requise de BME-R1 froid décongelé sur de la glace.
- À l’aide d’une pipette p20, plaque 12,5 μL/puits des villosités dans la matrice BME-R1 en 3D dans une plaque pré-préwargée en U de 96 puits.
- Incuber la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant 15 minutes pour permettre la solidification de la matrice BME-R1.
- Ajouter 125 μL/puits de milieux ENR (facteur de croissance épidermique/Noggin/R-spondin1) préchauffés : milieu DMEM F-12 avancé, complété par 1x pénicilline : streptomycine, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 5 % de milieu conditionné de cellules HEK293-T exprimant R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acétyl cystéine et 0,05 mg/mL de primocine.
- Incuber les villosités plaquées dans un incubateur de culture tissulaire maintenu à 37 °C avec 5% de CO2et changer le milieu tous les deux jours.
- Jetez tout puits dans lequel des organoïdes apparaissent avant deux jours de placage, car le premier moment où les organoïdes dérivés des villosités sont attendus est après deux jours.
REMARQUE: Tous les villosités qui ont la moitié ou plus de la moitié de la longueur des villosités sont comptées comme une villosité. Contrairement aux organoïdes dérivés de la crypte, les organoïdes dérivés des villosités ne sont pas attendus dans les 24 heures suivant le placage. Les villosités initiatrices des organoïdes semblent s’assombrir et rétrécir avant la formation d’organoïdes. Par conséquent, tous les puits avec des organoïdes se développant dans la journée de placage doivent être jetés pour éviter la plausibilité d’avoir dérivé d’une contamination plausible de la crypte. La méthodologie utilisée pour produire les supports conditionnés est disponible sur demande.
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Representative Results
Le facteur déterminant pour le succès de la procédure est la prévention de la contamination des cryptes. Le développement organoïde à partir des villosités (et non à partir de cryptes contaminantes) est assuré par la confirmation de quatre critères majeurs: 1) assurer la pureté des villosités prélevées par un examen microscopique avant et après le placage des villosités dans BME-R1, 2) placage d’un nombre limité de villosités par puits pour permettre la visualisation de tous les villosités plaquées individuellement, 3) sur le développement quotidien des organoïdes; les images de l’évolution du temps montrent le développement d’organoïdes à partir de villosités(figure 3),et 4) sur la cinétique et l’aspect morphologique des organoïdes initiant à partir de villosités; les organoïdes initiant à partir des villosités apparaissent de forme irrégulière au début et prennent deux à cinq jours avant d’être vus sous un grossissement 4x par opposition aux organoïdes dérivés de la crypte (cultivés en isolant les cryptes à l’aide de la méthode de chélation EDTA/PBS1,4) qui apparaissent pendant la nuit comme des structures sphériques avec des bordures bien définies (Figure 2).
Le moment optimal pour sacrifier les souris pour tester le potentiel de formation organoïde des villosités est après que les villosités-épithélium dédifférenciants expriment des marqueurs de cellules souches et commencent le développement de cryptes ectopiques dans les villosités in vivo (environ 10 jours après l’injection de tamoxifène du Smad4f / f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 souris). Ces souris ont une cre-recombinase inductible au tamoxifène qui provoque une perte de Smad4 concomitante à l’activation de la β-caténine avec le tamoxifène. Les cryptes ectopiques se développent complètement dans les deux semaines suivant l’induction de la mutation, tandis que les cellules souches de l’épithélium des villosités apparaissent dans la semaine suivant l’induction de la mutation in vivo. Le nombre de villosités qui forment des organoïdes lorsqu’ils sont plaqués dans Matrigel a été rapporté pour varier entre 2% et 12%3. Le prélèvement de la souris mutante pour le placage des villosités au moment où les cellules souches sont présentes (environ une semaine après l’induction de la cre-recombinase) prolongera le temps nécessaire à l’apparition des organoïdes dérivés des villosités, tandis que retarder la récolte à plus de dix jours après l’induction de la cre augmente le risque de contamination.
Figure 1: Installation expérimentale et grattage des villosités de l’épithélium intestinal. A) Seringue remplie de PBS (syrg) avec tube et filtre (Fltr) dans PBS. B) Isolation des villosités par raclage (B1) et transfert dans un filtre (B2). La flèche pointe vers les villosités recueillies sur la diapositive. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Distinction dans l’apparence des organoïdes émergeant des cryptes par rapport à l’épithélium des villosités dédifférencié du même intestin de souris : A) Dessin animé montrant des villosités et des cryptes. B) Montage entier (en PBS) de villosités préparées par raclage (panneau supérieur) et de cryptes préparées par chélation EDTA (panneau inférieur). C)Organoïdes dérivés de Villi (panneau supérieur) et dérivés de la crypte (panneau inférieur) provenant du même épithélium intestinal de souris dans BME-R1 (barres d’échelle, 500 um). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Évolution temporelle de la formation organoïde à partir des villosités dédifférenciantes. L’initiation organoïde à partir de deux villosités différentes est montrée (les régions encadrées sont agrandies dans les panneaux du milieu et du bas). Les villosités ayant un potentiel de formation organoïde semblent denses, peut-être en raison de la rétention du mésenchyme sous-jacent. L’initiation organoïde à partir des villosités est apparente au deuxième jour (flèche solide) à partir de l’un des villosités (boîte avec frontière brisée), tandis que dans l’autre villosité (boîte avec frontière solide), l’organoïde apparaît au quatrième jour (flèche). La case supérieure du panneau du jour 6 montre un organoïde dérivé des villosités développé. Barre d’échelle, 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Cette méthode peut confirmer la capacité d’auto-renouvellement de l’épithélium des villosités dédifférenciantes qui acquièrent des marqueurs de cellules souches in vivo. L’épithélium intestinal normal peut donner naissance à des organoïdes de la crypte mais pas du compartiment des villosités, lorsqu’il est cultivé en 3D en raison de la présence de cellules souches dans les cryptes1. Ainsi, la formation d’organoïdes à partir de l’épithélium des villosités dédifférenciées cultivé dans des cultures 3D confirme la formation de cellules souches à partir de l’inversion du destin cellulaire. Les rapports sur l’inversion du devenir cellulaire dans l’épithélium intestinal résultant de mutations et / ou de blessures augmentent2,3,9,10,11,12. Par conséquent, cette méthode est applicable dans des scénarios similaires où l’épithélium des villosités dédifférenciantes exprime des marqueurs de cellules souches in vivo.
Nous avons confirmé le développement des organoïdes à partir des villosités du mutant Smad4KO:β-caténineGOF à travers le cours du temps montrant le développement d’organoïdes à partir des villosités (Figure 3). L’aspect le plus critique est de prendre des mesures de précaution contre la contamination des cryptes, qui conduirait à des faux positifs. Les mesures suivantes ont été prises pour assurer la pureté de la préparation des villosités avant et après le placage : a) isolation des villosités de la moitié proximale du duodénum où les villosités sont les plus longues, b) minimisation du nombre d’éraflures et ajustement de la pression de grattage pour obtenir des villosités sans cryptes attachées, c) lavage des villosités avec du PBS après les avoir placées dans une crépine à mailles de 70 μm pour exclure toute crypte ou cellule lâche d) examen microscopique des villosités récoltées avant et après le placage, et e) minimiser le nombre de villosités plaquées par puits afin qu’elles puissent être visualisées individuellement dans la matrice plaquée.
Plusieurs considérations ont été prises en compte pour optimiser la procédure. Tout d’abord, nous avons récolté les villosités du duodénum proximal où les villosités sont les plus longues. La délimitation physique entre la différenciation et les compartiments prolifératifs dans l’intestin grêle nous permet d’adopter le grattage pour séparer mécaniquement les villosités des cryptes. Cette méthode ne peut donc être adoptée que dans les cas où le compartimentation entre le compartiment de différenciation et le compartiment prolifératif est strictement délimité - comme c’est le cas dans l’intestin grêle mais pas dans le côlon. Deuxièmement, nous avons optimisé le temps d’isolement des villosités après l’induction de la mutation en fonction du degré de dédifférenciation observé in vivo. La dédifférenciation dans le mutantgoF conditionnel Smad4KO:β-caténine est marquée par l’apparition in vivo de marqueurs de cellules souches et de cryptes ectopiques dans l’épithélium des villosités dans les sept et dix jours respectivement3. Ainsi, le temps nécessaire pour initier les organoïdes à partir des villosités mutantes diminue à mesure que le temps écoulé après l’induction de la mutation augmente. Par conséquent, tout en adaptant cette méthode à d’autres modèles de dédifférenciation de l’intestin, le moment optimal pour sacrifier les souris pour l’isolement des villosités doit être déterminé empiriquement en fonction du type de mutation ou de blessure et du degré de dédifférenciation qui en résulte in vivo. Troisièmement, nous avons choisi d’isoler les villosités par grattage plutôt que par la méthode de chélation EDTA afin de conserver le mésenchyme sous-jacent, car les diaphonies épithéliales-mésenchymateuses ont été impliquées dans la fonction des cellules souches intestinales dansl’intestin5,6,7,8,13. Les villosités qui initient les organoïdes apparaissent principalement sombres, peut-être en raison de la présence du mésenchyme sous-jacent(Figure 2B et 3). Nous avons vérifié l’expression du marqueur associé aux cellules souchesCD44 14,15, et du facteur de transcription spécifique de l’intestin Cdx216,17,18,19,20 confirmant l’origine épithéliale des organoïdes dérivés des villosités ( FigureS1).
Par rapport aux approches in vivo, les organoïdes se prêtent mieux à la manipulation génétique et au dépistage. Puisque nous observons des différences phénotypiques entre les organoïdes émergeant des cryptes et les villosités du même épithélium intestinal Smad4KO:β-caténineGOF (Figure 2B), nous supposons des différences moléculaires entre les deux, ce qui est actuellement à l’étude. Ainsi, cette méthode est utile pour étudier les implications des mutations causant la dédifférenciation et ses effets différentiels dans le compartiment progéniteur par rapport au compartiment de différenciation.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette publication a été soutenue par le numéro de prix K22 CA218462-03 du NIH National Cancer Institute. Les cellules HEK293-T exprimant R-Spondin1 ont été un don généreux du Dr Michael P. Verzi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
References
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