Summary
La reazione di condensazione di Claisen-Schmidt è una metodologia importante per la generazione di composti aromatici biciclici coniugati colma di metina. Utilizzando una variante mediata dalla base della reazione aldola, è possibile accedere a una gamma di molecole fluorescenti e/o biologicamente rilevanti attraverso un approccio sintetico generalmente economico e operativamente semplice.
Abstract
I composti aromatici biciclici coniugati colma di metina sono costituenti comuni di una serie di molecole biologicamente rilevanti come porfirine, dipirrinones e prodotti farmaceutici. Inoltre, la rotazione limitata di questi sistemi spesso si traduce in sistemi altamente o moderatamente fluorescenti come osservato in 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]pirimidina-3-uno, xantoglow, analoghi pirroloindolizinedione, analoghi BODIPY e sistemi ad anello fenolici e imidazolinone di Green Fluorescent Protein (GFP). Questo manoscritto descrive un metodo economico e operativamente semplice per eseguire una condensazione claisen-schmidt per generare una serie di analoghi diapirrinone dipendenti dal pH fluorescente. Mentre la metodologia illustra la sintesi degli analoghi dipirrinone, può essere tradotta per produrre una vasta gamma di composti aromatici biciclici coniugati. La reazione di condensazione di Claisen-Schmidt utilizzata in questo metodo è limitata nell'ambito ai nucleofili e agli elettrofili che sono enolabile in condizioni di base (componente nucleofila) e aldeidi non enoluibili (componente elettrofilo). Inoltre, sia i reagenti nucleofili che elettrofili devono contenere gruppi funzionali che non reagiscano inavvertitamente con idrossido. Nonostante queste limitazioni, questa metodologia offre l'accesso a sistemi completamente nuovi che possono essere utilizzati come sonde biologiche o molecolari.
Introduction
Un certo numero di sistemi biciclici coniugati, in cui due anelli aromatici sono collegati da un ponte monometina, subiscono l'isomerizzazione tramite rotazione del legame, quando eccitati con un fotone(Figura 1A)1,2,3,4,5. L'isomero eccitato si rilasserà generalmente allo stato del suolo attraverso processi di decadimento nonradiativi 6. Se la barriera energetica alla rotazione del legame è aumentata in misura sufficiente, è possibile limitare o prevenire la fotoisomerizzazione. Invece, l'eccitazione fotonica si traduce in uno stato di singoletto eccitato che spesso si rilassa attraverso la fluorescenza piuttosto che il decadimento non radiativo (Figura 1B). La fotoisomerizzazione restrittiva è più comunemente realizzata limitando meccanicamente la rotazione del legame attraverso il collegamento dei due sistemi di anelli aromatici mediante collegamenti covalenti, bloccando così la molecola in un particolare stato isorico. Questo approccio è stato utilizzato per creare diversi analoghi fluorescenti triciclici dipirirolo e dipirolemetano come: 3H,5H-dipirrolo[1,2-c:2',1'-f]pirimidina-3-uno (1), xanthoglows (2)6,7, analoghi pirroloindolizinedione (3)8e analoghi BODIPY 9 (4 , Figura 2) in base ai quali i sistemi ad anello di pirrolidina e/o pirrolole sono reticolati con metilene, carbonile, o linker difluoro al boro. Tipicamente, 1-4 possiedono ΦF > 0,7 suggerendo che questi sistemi sono molto efficienti come unità di fluoroforo.
È anche possibile limitare la fotoisomerizzazione attraverso mezzi diversi dal collegamento covalente dei sistemi ad anello. Ad esempio, gli anelli fenolici e imidazolinone (Figura 2) della proteina fluorescente verde (GFP) sono limitati alla rotazione da parte dell'ambiente proteico; l'impostazione restrittiva aumenta la resa quantica di tre ordini di grandezza rispetto alla stessa unità di cromoforo nella soluzione libera10. Si ritiene che l'impalcatura proteica della GFP fornisca una barriera rotazionale attraverso effetti sterici ed elettrostatici11. Recentemente, il nostro gruppo in collaborazione con il gruppo Odoh dell'Università del Nevada, Reno ha scoperto un altro sistema a fluoroforo che presenta una somiglianza strutturale con i sistemi xanthoglow a base di dipirrinone (Figura 2)12. Questi analoghi dipirrinone, tuttavia, differiscono dal sistema xanthoglow in quanto i legami idrogeno intramolecolari, piuttosto che legami covalenti, scoraggiano la fotoisomerizzazione e si traducono in un sistema biciclico fluorescente. Inoltre, gli analoghi pirazolo, imidazolo e isoindolone dipirrinone possono legare idrogeno in stati protonati e deprotonati; la deprotonazione si traduce nello spostamento verso il rosso delle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, probabilmente a causa di un cambiamento nella natura elettronica del sistema. Mentre è stato riferito che l'legame idrogeno aumenta le rese quantistiche attraverso una rotazione limitata13,14, 15,16, non siamo a conoscenza di nessun altro sistema di fluoroforo in cui l'isomerizzazione limitata serve come modalità di fluorescenza sia negli stati protonati che deprotonati della molecola. Pertanto, questi fluorofori di dipirrinone dipendenti dal pH sono unici in questo senso.
In questo video, ci concentriamo sulla sintesi e caratterizzazione chimica della serie analogica fluorescente dipyrrinone. In particolare, c'è un'enfasi posta sulla metodologia di condensazione claisen-schmidt che è stata utilizzata per costruire la serie completa di analoghi fluorescenti. Questa reazione si basa sulla generazione di uno ione enolato vinilegoo mediato in base che attacca un gruppo di aldeide, per produrre un alcol che successivamente subisce l'eliminazione. Per la serie analogica del dipirrinone, un pirrolinone/isoindolone viene convertito in un enolato per facilitare un attacco ad un gruppo di aldeidi attaccato ad un anello di pirazolo o imidazolo(Figura 3); dopo l'eliminazione si forma un sistema biciclico completamente coniugato, collegato da un ponte di metina. È degno di nota che l'intera serie di analoghi dipyrrinone possa essere costruita con materiali commerciali prontamente disponibili e possa essere prodotta in una singola sequenza di reazione a un vaso tipicamente in rese da moderate a alte (le rese vanno da circa il 50-95%). Poiché la maggior parte degli analoghi del dipirrinone sono di natura altamente cristallina, è necessaria pochissima purificazione al di fuori delle condizioni di lavoro standard per produrre campioni analiticamente puri. Di conseguenza, questo sistema a fluoroforo richiede solo pochi passaggi per accedere da materiali commerciali prontamente disponibili e può essere sintetizzato, purificato e preparato per studi analitici o biologici in un lasso di tempo relativamente breve.
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Protocol
1. Procedura generale per la sintesi degli analoghi di dipirrinone 16-25
- Sciogliere il pirrolinone/isoindolone (1,00 mmol) e il corrispondente aldeide pirazolo/imidazolo (1,00 mmol) in 5,0 ml di etanolo in un pallone a fondo tondo.
- Aggiungere koh acquoso (24,0 mmol, 10 M, 2,40 mL) al pallone in una porzione.
- Mescolare e reflusso la miscela fino a quando il completamento della reazione non è confermato da TLC (vedere la tabella 1 per un elenco dei tempi di reazione). È stato usato un eluente TLC del 10% di metanolo nel diclorometano e gli analoghi sono stati osservati possedere valori Rf nell'intervallo da 0,62 a 0,86 o intorno a esso. Applicare una quantità sufficiente di grasso sottovuoto o utilizzare un manicotto PTFE all'interfase dei giunti di vetro per evitare che il vetro del condensatore e il pallone a fondo tondo si sequestrano ad alte temperature e condizioni di base.
- Lasciare raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente ed evaporare i volatili a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
- Raffreddare la miscela di reazione a 0 °C utilizzando un bagno di ghiaccio.
- Neutralizzare la miscela oleosa rimanente aggiungendo acido acetico (30,0 mmol, 1,70 mL) in una porzione.
- Purificare il materiale prodotto risultante utilizzando la filtrazione sottovuoto (vedere fase 2a, per i composti: 17, 18, 20-22, 24 e 25) o utilizzare l'estrazione liquido-liquido/ cromatografia a colonna (vedere fase 2b, per i composti: 16, 19 e 23).
2. Purificazione della procedura
- tramite filtrazione sottovuoto
- Montare un imbuto Hirsch su un pallone laterale utilizzando un adattatore in gomma montato.
- Applicare un pezzo di carta filtrante rotonda sull'imbuto Hirsch e bagnare leggermente utilizzando acqua deionizzata per consentire l'aderenza all'imbuto.
- Collegare una sorgente di vuoto al braccio laterale del pallone e assicurarsi che vi sia una tenuta sottovuoto sufficiente assicurandosi che nessuna delle vetrerie possa essere smontata durante il vuoto.
- Versare il pallone contenente il prodotto cristallizzato sul filtro sottovuoto e lasciare filtrare. Risciacquare i cristalli con 10 mL di acqua deionizzata ghiacciata.
- Lasciare che i cristalli filtrati continuino ad asciugarsi sopra la carta filtrante, pur essendo ancora collegati alla fonte di vuoto, a seguito della filtrazione di tutti i liquidi.
- Raccogliere i cristalli filtrati e posizionarli in un pallone a fondo rotondo da 25 ml.
- Collegare il pallone a fondo tondo a un adattatore di linea di giunto/vuoto in vetro macinato fritte. Fissare l'unione del giunto in vetro con una clip di keck.
- All'estremità a coste dell'adattatore di linea ad alto vuoto in vetro, attaccare una linea sottovuoto che viene instradata a una pompa ad alto vuoto e raffreddare adeguatamente una trappola per vuoto (utilizzando refrigerante come azoto liquido o ghiaccio secco / acetone) per condensare eventuali materiali volatili che possono evaporare dal materiale cristallino. Accendere la pompa ad alto vuoto per garantire la completa evaporazione di eventuali tracce di solvente rimanente dai cristalli.
- Lasciare asciugare i cristalli sotto vuoto alto per un minimo di 1 h. Rimuovere il pallone a fondo tondo dalla linea/adattatore sottovuoto, spegnere la pompa per vuoto alta e pulire la trappola per vuoto.
-
Purificazione della procedura tramite cromatografia a colonna
- Diluire il contenuto della miscela di reazione trattata con acido acetico (dal passo 1.6) con 10 mL di acqua deionizzata e trasferirlo in un imbuto separatore. Aggiungere 10 mL di diclorometano all'imbuto separatore. Agitare delicatamente e sfiatare l'imbuto separatorio per separare i due strati.
- Estrarre lo strato acquoso utilizzando porzioni successive di diclorometano (3 x 5 mL). Unire le frazioni organiche e asciugare utilizzando anidro Na2SO4. Decantare e rimuovere tutti i volatili a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
- Diluire il residuo ottenuto dal punto 2.2.2. con 5 mL di CH2Cl2. Eseguire la cromatografia a colonna flash utilizzando circa 75 g di gel di silice. Elute il campione con una soluzione di 10% di metanolo in diclorometano.
- Rimuovere le frazioni raccolte di solvente a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. Trasferire il residuo solido in un pallone a fondo tondo da 25 ml utilizzando circa 10 ml di CH2Cl2. Rimuovere il solvente a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
- Essiccare il residuo solido rimanente sotto vuoto elevato, come descritto in precedenza nei passaggi da 2.1.7 a 2.1.9.
3. Acquisizione dell'asoptività molare e UV/Vis pKa Studi per analoghi 16-25
- Creare soluzioni di stock composto per spettrofotometria UV/Vis per analoghi 16 - 25.
- Pesare 10 μmol dell'analogo dipirrinone selezionato (16 - 25) e aggiungerlo a un pallone volumetrico da 10 ml.
- Aggiungere DMSO al segno da 10,0 ml sul pallone volumetrico.
NOTA: Se il composto non si dissolve completamente, riscaldare il pallone usando una pistola termica e agitare il pallone in base alle esigenze per sciogliere completamente il composto.
- Creare soluzioni saline tamponate con fosfato (PBS) a vari livelli di pH. Gli analoghi erano caratterizzati in buffer PBS che andavano in pH da circa 4 a 15.
- Utilizzando un cilindro volumetrico da 1 L, creare 1 L di soluzione di materiale PBS diluire 100 mL di PBS (x100) in 900 mL di acqua deionizzata.
- Trasferire 50 mL della soluzione di scorta PBS preparata (fase 3.2.1) su un becher da 100 mL e aggiungere una barra di agitazione magnetica. Quindi, utilizzando un misuratore di pH calibrato per monitorare le variazioni del pH, titolare il buffer PBS con un acquoso NaOH da 1,0 M (per ottenere buffer con pH > 7.0) o 1,0 M HCl (per ottenere buffer con pH < 7.0).
NOTA: Per ottenere dati che si trattenano in una curva di titolazione ben definita, si consiglia di generare buffer di pH in incrementi di 0,1 unità di pH entro ± 0,5 del punto di flessione previsto e incrementi di 0,5 al di fuori del punto di flessione previsto.
- Acquisire spettri di asottabilità molare per analoghi 16 - 25 in soluzioni PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH (pH 14.0).
- Preparare una cuvetta di quarzo "vuota" utilizzando una cuvetta di quarzo pulita e asciutta, quindi aggiungere 2,0 mL di soluzione di materiale PBS (pH 7.0) o acquosa naoh da 1,0 M alla cuvetta utilizzando una micropipetta da 100 a 1000 μL.
NOTA: È importante per l'integrità del processo di acquisizione dei dati della soluzione vuota assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella soluzione di cuvetta e pulire accuratamente i lati della cuvetta con una salvietta Kim per evitare la dispersione della luce risultante da polvere o detriti all'esterno della cuvetta. Se le bolle persistono, toccare delicatamente e ripetutamente la cuvetta su un tovagliolo di carta posato su una superficie dura. - Utilizzando uno spettrofotometro UV/Vis, spegnete la soluzione selezionata per un intervallo da 200 a 800 nm.
- In una seconda cuvetta di quarzo pulita e secca aggiungere 2,00 mL di PBS (pH 7.0) o 1,0 M NaOH (pH 14) seguito da 10 μL della soluzione di stock analogica dipyrrinone (16 - 25) (vedere fase 3.1) con una micropipetta da 5-50 μL. Posizionare un tappo sulla cuvetta e agitare bene oltre a invertire la cuvetta.
NOTA: È importante per l'integrità del processo di acquisizione dei dati della soluzione campione assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella soluzione di cuvetta e pulire accuratamente i lati della cuvetta con una salvietta Kim per evitare la dispersione della luce risultante da polvere o detriti all'esterno della cuvetta. Se le bolle persistono, toccare delicatamente e ripetutamente la cuvetta su un tovagliolo di carta posato su una superficie dura. - Utilizzando lo spettrofotometro UV/Vis, acquisire uno spettro di assorbimento per la soluzione analogica dipyrrinone per un intervallo di 200 - 800 nm.
- Alla stessa cuvetta aggiungere altri 10 μL della soluzione di stock analogico di dipirrinone e ripetere i passaggi 3.3.3 e 3.3.4.
- Ripetere il passaggio 3.3.5 fino a quando un totale di 50 μL di soluzione di stock analogico di dipirrinone è stato aggiunto alla cuvetta al fine di acquisire almeno cinque punti dati della lunghezza d'onda di eccitazione. Ripetere i passaggi da 3.3.1 a 3.3.6 fino a ottenere tutte le soluzioni stock da 16 a 25 sia in PBS (pH 7.0) che in 1.0 M NaOH.
- Preparare una cuvetta di quarzo "vuota" utilizzando una cuvetta di quarzo pulita e asciutta, quindi aggiungere 2,0 mL di soluzione di materiale PBS (pH 7.0) o acquosa naoh da 1,0 M alla cuvetta utilizzando una micropipetta da 100 a 1000 μL.
- Ottenere valori di asoptività molare per 16 - 25 in PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH utilizzando l'analisi di regressione lineare best fit.
- Utilizzando un programma di grafica come GraphPad Prism 7, traccia l'assorbanza misurata (asse y) rispetto alla concentrazione analogica del dipirrinone (asse x). Create un'analisi di regressione lineare più adatta per i cinque punti tracciati. Si dovrebbe osservare una relazione lineare e l'analisi statistica dovrebbe mostrare un valore R2 ≥ 0,98.
- Ripetere il passaggio 3.4.1 per gli analoghi 16 - 25 in PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH.
- Calcola l'asoptività molare per 16 - 25 in PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH usando il valore di pendenza estrapolato dalla curva lineare più adatta.
- Determinare il pKcon valori di 16 - 25 studi utilizzando la spettrofotometria UV/Vis
- In una cuvetta di quarzo pulita e asciutta, trasferire 1.900 μL del tampone PBS al livello di pH selezionato (preparato nel passaggio 3.2) utilizzando una micropipetta da 100 a 1000 μL.
NOTA: Abbiamo notato al momento della conservazione che un precipitato bianco può formarsi in alcuni dei buffer. Per assicurarsi che il tampone sia completamente omogeneo e se è visibile un precipitato, utilizzare la filtrazione gravitazionale per rimuovere qualsiasi precipitato immediatamente prima dell'uso. Vedere la nota dopo il passaggio 3.3.1. - Utilizzando lo spettrofotometro UV/Vis, spegnete la soluzione tampone PBS selezionata per un intervallo di 200-800 nm.
- In una seconda cuvetta al quarzo pulita e asciutta, trasferire 1.900 μL del tampone PBS selezionato, quindi aggiungere 100 μL della soluzione di stock analogico selezionata utilizzando una micropipetta da 5-50 μL. Posizionare un tappo sulla cuvetta e agitare bene oltre a invertire la cuvetta.
NOTA: Vedere la nota precedente dopo il passaggio 3.3.3. - Utilizzando lo spettrofotometro UV/Vis, acquisire lo spettro di assorbimento per l'analogo dipyrrinone per un intervallo di 200 - 800 nm.
- Ripetere i passaggi da 3.5.1 a 3.5.4 per 16 - 25 in ciascuno dei buffer PBS generati nel passaggio 3.2.
- In una cuvetta di quarzo pulita e asciutta, trasferire 1.900 μL del tampone PBS al livello di pH selezionato (preparato nel passaggio 3.2) utilizzando una micropipetta da 100 a 1000 μL.
- Determinare il pKdi un valori per 16 - 25 utilizzando una funzione di raccordo a curva sigmoidale più adatta.
- Utilizzando un programma di grafo, grafare l'assorbanza misurata rispetto alla lunghezza d'onda (nm) per 16 - 25 ai vari livelli di pH.
- Scegli una lunghezza d'onda compresa tra 380-415 nm dove a livelli di pH più bassi (< 7.0) l'assorbanza è piccola (0-0,1 unità) e a una maggiore assorbanza di pH (> 12,0) è considerevolmente maggiore (0,8-1,0 unità). Traccia l'assorbanza alla lunghezza d'onda scelta rispetto al pH.
- Utilizzando una funzione di curva sigmoidale, generare una curva di adattamento migliore per ciascuno degli analoghi 16 - 25. Segnalare il pH estrapolato a mezza altezza della curva. Questo è il valore pKsegnalato.
4. Acquisizione della resa quantistica e studi sulla fluorescenza
- Creare soluzioni di stock di studio a fluorescenza per analoghi dipirrinone 16 - 18 e 20 - 25.
- Utilizzando una soluzione di stock analogico dipyrrinone creata nel passaggio 3.1, eseguire una diluizione della soluzione stock aggiungendo 10 μL della soluzione stock a un pallone volumetrico da 1 ml utilizzando una micropipetta da 2 a 20 μL, quindi aggiungere il buffer PBS (pH 7.0) al marchio da 1 ml. Posizionare un tappo sul pallone volumetrico e mescolare bene invertendo e scuotendo il pallone. Questa soluzione di stock diluita verrà utilizzata per generare gli spettri di fluorescenza e sarà definita soluzione di stock di fluorescenza.
- Ripetere il passaggio 4.1.1 per gli analoghi 16 - 18 e 20 - 25.
- Acquisire spettri di emissione di fluorescenza a concentrazioni variabili, per analoghi 16 - 18 e 20 - 25. Per tutti gli analoghi diversi da 18, acquisire cinque spettri per ogni analogico in soluzioni di pH 7 e 14 a concentrazioni di: 19.96, 39.84, 59.64, 79.37 e 99.01 nM. Per l'analogico 18, acquisire cinque spettri in una soluzione di pH 7 a concentrazioni di: 49,75, 99,01, 147,8, 196,1 e 243,9 nM. In una soluzione di pH 14, acquisire cinque spettri per analogico 18 a concentrazioni di: 99.01, 196.1, 291.3, 384.6, 476.2 nM.
- In una cuvetta al quarzo trasparente a quattro lati, aggiungere 3,00 mL di PBS (pH 7.0) o 1,0 NaOH utilizzando una micropipetta da 100 -1.000 μL in tre incrementi di 1.000 μL.
NOTA: Vedere nota dopo il passaggio 3.3.1. - Utilizzando il fluorometro e il programma software fluorometro FluorEssence, acquisire uno spettro di emissione per la soluzione selezionata ed etichettarlo come la soluzione "vuota".
- Alla stessa cuvetta aggiungere 6 μL di soluzione di fluorescenza per l'analogo di dipirrinone selezionato (Parte 4.1) utilizzando una micropipetta da 0,5-10 μL. Posizionare il cappuccio sulla cuvetta e mescolare bene invertendo e scuotendo delicatamente la cuvetta.
NOTA: Vedere nota dopo il passaggio 3.3.3. - Usando il fluorometro, acquisire uno spettro di emissione per la soluzione composta selezionata usando λmax abs come lunghezza d'onda di eccitazione. L'intensità di eccitazione è stata misurata su un intervallo di 200 nm a partire da 15 nm oltre la lunghezza d'onda di eccitazione (in genere è necessario un intervallo di 200 nm affinché l'intensità della fluorescenza ritorni alla linea di base).
- Ripetere i passaggi da 4.2.3 a 4.2.4 fino ad aggiungere alla cuvetta un totale di 30 μL di soluzione di fluorescenza.
- Ripetere i passaggi da 4.2.1 a 4.2.5 per analoghi 16 - 25 in PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH.
NOTA: Le concentrazioni di cuvette sono state modificate per l'analogico 18 e i dati sono stati acquisiti utilizzando: 2,0 mL di PBS con cinque incrementi consecutivi di 10 μL di soluzione di fluorescenza per una soluzione neutra (protonato 18)e 2,0 mL di NaOH da 1,0 M con cinque incrementi di 20 μL di soluzione di stock composto aggiunto per una soluzione di base (deprotonata 18).
- In una cuvetta al quarzo trasparente a quattro lati, aggiungere 3,00 mL di PBS (pH 7.0) o 1,0 NaOH utilizzando una micropipetta da 100 -1.000 μL in tre incrementi di 1.000 μL.
- Determinare la resa quantica usando il metodo di Williams, A. T. etal.
- Utilizzando un programma software per fogli di calcolo (cioè Microsoft Excel), importare i dati (punti dati sull'intensità delle emissioni) per gli spettri di emissione per un singolo analogo dipyrrinone (preso in PBS [pH 7.0] o 1.0 M NaOH) ai vari livelli di concentrazione.
- Importare i punti dati dagli spettri di emissione per la soluzione "in bianco" (passaggi 4.2.1 - 4.2.2) e sottrarre i punti dati di intensità di emissione "vuoti" dai punti dati sull'intensità di emissione, alle corrispondenti lunghezze d'onda, acquisiti a vari livelli di concentrazione.
- Trasferire i punti dati di intensità di emissione corretti "vuoti" in un programma di grafica, come GraphPad Prism 7, e tracciare l'emissione rispetto alla lunghezza d'onda. Calcolare l'area sotto la curva per ciascuna delle curve ottenute ai vari livelli di concentrazione dell'analogico dipirinone.
- Seguendo la tecnica delineata da Williams, A. T. et al, calcolare un valore di assorbanza estrapolato per ciascuno dei vari livelli di concentrazione dell'analogo di dipirrinone. Ciò si ottiene moltiplicando il valore di asorptività molare calcolato (dall'analisi di regressione lineare più adatta, vedi passaggio 3.4) per ogni concentrazione di dipirirrinone analogico utilizzata nei passaggi 4.2.3-4.2.5.
- Utilizzando un programma di grafica come GraphPad Prism 7, creare un grafico dell'assorbanza estrapolata dell'analogo (asse x) rispetto all'area calcolata sotto ogni curva di concentrazione (passo 4.3.4) per la lunghezza d'onda di emissione corrispondente al valore di emissione maggiore. Si deve osservare una relazione lineare con un ≥ r2 0,96.
- Eseguire passaggi analoghi a 3.1-3.4 e 4.1-4.3.5 per il chinino in 0,5 M H2SO4 (ΦF = 0,55)18 e l'antracene in etanolo (ΦF = 0,27)18,19 per ottenere dati per gli standard.
- Ottenere i valori di resa quantistica per 16 - 25 in PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH utilizzando le pendenze estrapolate ottenute dai passaggi 4.3.5 e 4.3.6 nella seguente equazione:
Φx =Φst(Gradx/Gradst)(η2x/η2st)
dove Φst rappresenta la resa quantico dello standard, Φx rappresenta la resa quantico dell'ignoto, Grad è la pendenza della migliore vestibilità lineare, e η è l'indice di rifrazione del solvente utilizzato (il rapporto dell'indice di rifrazione è stato calcolato usando η = 1,36 per l'etanolo e η = 1,35 per 0,5 M H2SO4). - Segnalare le rese quantiche per 16 - 18 e 20 - 25 in PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH come media del Φx ottenuto per chinino e antracene.
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Representative Results
La reazione di condensazione di Claisen-Schmidt ha fornito l'accesso agli analoghi del dipirrinone (16-25, Figura 4) utilizzando la procedura a un vaso descritta nella sezione del protocollo (vedere fase 1). Gli analoghi 16-25 sono stati tutti generati dalla condensazione del pirrolinone 9, bromoisoindolone 10o isoindolone 11 con 1H-imidazolo-2-carboxaldeide (12), 1H-imidazolo-5-carboxaldeide (13), 1H-pirazole-3-carboxaldeide (14), o 1H-pirazole-4-carboxaldeide (15); le combinazioni hanno prodotto dieci diversi analoghi tra cui un composto di controllo, 19, che non è in grado di formare legami idrogeno intramolecolari(tabella 1). I tempi di reazione richiedevano in genere 24 ore di reflusso per il completamento, tuttavia, nel caso di 20 erano necessarie solo 6 ore, mentre, per 23 e 24 volte leggermente più lunghe rispettivamente di 30 h e 27 h, erano necessarie. Le rese dei prodotti variavano dal 41% al 96%, come illustrato nella tabella 1, che seguono le tendenze tradizionali di reazioni di condensazione analoghe per i dipirrinones. I composti 17, 18, 20-22,24 e 25, a causa della loro natura altamente cristallina, sono stati tutti purificati con semplici metodi di filtrazione sottovuoto; solo i composti 16, 19e 23 richiedevano cromatografia per la purificazione.
Le proprietà fotofisiche dei composti da 16a25, ottenute dall'esecuzione dei passaggi da 3 a 4 nella sezione del protocollo, sono riassunte nella tabella 2. Il pKa valori misurati per ogni composto variava da 12 a > 13,5, suggerendo che sono necessarie condizioni sufficientemente basilare per deprotonare completamente ogni analogico dipirrinone. A causa delle diverse proprietà fotofisiche negli stati protonati e deprotonati di ciascun composto, gli spettri sono stati acquisiti utilizzando soluzioni neutre (pH 7.0 PBS) e di base (1,0 M NaOH) di 16-25. Nel pH neutro (stato protonato), i composti da 16a25 hanno λabs max che vanno da 324 nm a 365 nm, che sono tutti spostati in blu da 10 a 37 nm rispetto agli stati deprotonati. Le assorbitività molare vanno da 15.000 a 30.000 ma non sembrano deviare sostanzialmente tra gli stati protonati e deprotonati di un dato analogo. Analogico 19 non ha visualizzato alcuna fluorescenza rilevabile, tuttavia, 16-18 e 20-25 luce emessa con λmax em che vanno da 409 - 457 nm a pH neutro e 443 - 482 nm al pH di base; una tendenza simile allo spostamento verso il rosso a quella delle lunghezze d'onda massime di assorbanza protonata/deprototonata è osservata anche per le lunghezze d'onda di emissione. Il ΦF variava da 0,01 a 0,30 in soluzioni acquose sia neutre che di base, che sono notevolmente inferiori a xanthoglows comparabili, ma i composti 16, 20e 25 cadono nella regione simile di fluorofori fortemente usati come la rodiammina B (ΦF = 0,23),20 l'arancia acridina (ΦF = 0 .36),21 pironina Y (ΦF = 0,22),20 e la maggior parte della serie di coloranti cianuri (tipicamente ΦF = 0,12-0,28). 22 di cui: La commissione per i
Gli analoghi dipyrrinone 16-25 erano tutti chimicamente caratterizzati utilizzando l'analisi del punto di fusione, la spettroscopia IR, la spettroscopia NMR 1H e 13C NMR e la spettrometria di massa ad alta risoluzione oltre agli esperimenti di spettroscopia UV/Vis e fluorescenza riassunti nella tabella 2. La caratterizzazione chimica e gli spettrioriginali 1 H NMR e 13C NMR possono essere trovati dalla fonte della letteratura originale,12 tuttavia, per comodità, caratterizzazione per composti 16, 20 e 23, che possiedono le maggiori rese quantistiche sono riportati di seguito:
(Z)-5-((1H-imidazol-2-yl)metilene)-3-etile-4-metil-1,5-diidro-2H-pirrolo-2-uno (16). Si decompone a 160 °C; 1 ) La commissione per la H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,3 (brs, 1H), 9,87 (s, 1H), 7,13 (app, 2H), 5,93 (s, 1H), 2,23 (q, J = 7,5 Hz, 2H), 2,00 (s, 3H), 0,98 (t, J = 7,5 Hz, 3H); 13 di cui alla commissione per i C NMR (101 MHz, DMSO- d6) δ 170,7, 144,8, 140,0, 139,6, 133,9, 130,2, 117,6, 94,1, 16,7, 13,6, 9,33; IR (film sottile) 3742, 3148, 3063, 2924, 2353, 1651, 1543, 1450, 771, 717 cm-1; HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd per C11H13N3ONa 226.0956, Trovato 226.0956.
(Z)-5-((1H-pirazolo-4-yl)metilene)-3-etile-4-metil-1,5-diidro-2H-pirrolo-2-uno (19). Si decompone a 202 °C; 1 ) La commissione per la H NMR (400 MHz, 20% CD3OD in CDCl3) δ 1H NMR (400 MHz, Cloroformio-d) δ 7,74 (s, 2H), 6,01 (s, 1H), 2,27 (q, J = 7,4 Hz, 2H), 2,02 (s, 3H), 1,02 (t, J = 7,4 Hz, 3H); 13 di cui alla commissione per i C{1H} NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173,7, 141,9, 136,0, 133,0, 116,1, 105,0, 100,8, 16,9, 13,4, 9,61; IR (film sottile) 3163, 3117, 3048, 2963, 2362, 1674, 1558, 1512, 1396, 1257, 1157, 948, 871, 794, 702 cm-1; HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd per C11H13N3ONa 226.0956, Trovato 226.0955.
(Z)-3-((1H-imidazol-2-yl)metilene)-5-bromoisoindolina1-uno (20). Si decompone a 213 °C; 1 ) La commissione per la H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,97 (s, 1H), 7,59 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,48 (d, J = 8,0, 1H), 7,06 (s, 2H), 6,57 (s, 1H); 13 di cui alla commissione per i C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 167,7, 146,6, 140,2, 134,5, 131,7, 129,1, 125,8, 125,03, 124,99, 123,6, 96,5; IR (film sottile) 3742, 3240, 2314, 1682, 1543, 1520, 1435, 1312, 1080, 826, 694 cm-1; HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd per C12H8BrN3ONa 311.9749, Trovato 311.9752.
(Z)-3-((1H-imidazol-2-yl)metilene)isoindolina-1-uno (23). Si decompone a 228 °C; 1 ) La commissione per la H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,34 (s, 1H), 10,74 (s, 1H), 7,90 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,74 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,63 (dd, J = 7,6, 7,2 Hz, 1H), 7,50 (dd, J = 7,6, 7,3 Hz, 1H), 7,17 (s, 2H), 6,46 (s, 1H); 13 di cui alla commissione per i C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 167,3, 144,9, 137,3, 135,1, 132,8, 129,9, 129,3, 123,6, 121,0, 117,6, 92,9; IR (film sottile) 3741, 3201, 3086, 2361, 2322, 1682, 1543, 1520, 1119, 748, 687 cm-1; HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd per C12H9N3ONa 234.0643, Trovato 234.0641.
| entrata | Pirrolinone/Isoindolone | aldeide | Rendimento (%)b | Tempo (h) | prodotto |
| 1 | 9 | 12 | 80 | 24 | 16 |
| 2 | 9 | 13 | 41 | 24 | 17 |
| 3 | 9 | 14 | 79 | 24 | 18 |
| 4 | 9 | 15 | 61 | 24 | 19 |
| 5 | 10 | 12 | 96 | 6 | 20 |
| 6 | 10 | 13 | 70 | 24 | 21 |
| 7 | 10 | 14 | 66 | 24 | 22 |
| 8 | 11 | 12 | 49 | 30 | 23 |
| 9 | 11 | 13 | 49 | 27 | 24 |
| 10 | 11 | 14 | 94 | 24 | 25 |
La tabella 1. Condizioni e rese di reazione per la sintesi di 16-25a
a Reazioni eseguite su una scala di 1 mmol in 5 mL di EtOH. b Resa isolata.
| composto | Abs. λmax (nm) | ε (M-1 cm-1) | fluorite. λmax (nm) | Φ b) La commissione perl' | pKa |
| 16 | 351 (384) | 24500 (22800) | 451 (482) | 0.30 (0.30) | 12.7 |
| 17 | 338 (380) | 18600 (18600) | 442 (462) | 0.01 (0.03) | 12.8 |
| 18 | 324 (349) | 29800 (25700) | 455 (465) | 0.01 (0.02) | 13 |
| 19 | 326 (358) | 29900 (21300) | –a | –a | 12.9 |
| 20 | 365 (378) | 15000 (15500) | 457 (475) | 0.22 (0.20) | 12.5 |
| 21 | 355 (380) | 15100 (16800) | 409 (443) | 0.03 (0.01) | 12.9 |
| 22 | 341 (363) | 19800 (23100) | 427 (452) | 0.02 (0.01) | >13.5 |
| 23 | 360 (373) | 29000 (21300) | 449 (474) | 0.25 (0.26) | 12 |
| 24 | 351 (373) | 17200 (19400) | 432 (454) | 0.07 (0.05) | 12.8 |
| 25 | 340 (357) | 20200 (23500) | 410 (449) | 0.02 (0.02) | >13.5 |
La tabella 2. Proprietà fotofisiche e valori pKa di 6-14 e 22 in tampone PBS pH 7.0 e 1 M NaOH (dato tra parentesi).
una fluorescenza non era rilevabile per 19. b Chinino (Q = 0,55)15 e Antracene (Q = 0,27)15,16 erano usati come standard.
Figura 1: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'approccio di condensazione di Claisen-Schmidt fornisce un mezzo abbastanza robusto per generare fluorofori di pirazolo, imidazolo e isoindolone dipirrinone attraverso un protocollo relativamente semplicistico dal punto di vista operativo. Mentre la sintesi degli analoghi fluorescenti del dipirrinone è stata al centro di questo studio, va notato che condizioni simili possono essere applicate per accedere ad altri sistemi ad anello biciclici collegati alla metina come i dipirrinoni23,24,25 e gli addotti pirrole-furano26 così come gli addotti 3H-pyrazol-3-one-furan27, gli addotti di pirrole isoindolone28e 2 gli addottiH-Indol-2-one-pyrindine29 che promettono come potenziali farmaci. In generale, la procedura descritta fornisce prodotti di reazione a rese da moderate a elevate, tuttavia, è importante notare che il monitoraggio continuo dei progressi di reazione è essenziale per risultati positivi. In alcune delle nostre prove preliminari, si è constatato che il riscaldamento per tempi di reazione eccessivi, ben oltre (5-24 ore) il completamento della reazione, ha portato a prodotti di decomposizione che possono complicare le successive fasi di purificazione. Per questo motivo, si consiglia vivamente di eseguire l'analisi TLC a 1 h, 3 h, 6 h, 12 ore e 24 ore di tempo per monitorare l'avanzamento della reazione e ottenere un senso della velocità di reazione, così come la velocità di decomposizione del prodotto.
Gli analoghi di dipirrinone 16-25, allo stato protonato/neutro, possiedono una gamma di proprietà di solubilità in solventi organici comunemente usati che possono essere problematici quando si studiano proprietà fotofisiche, biologiche e analitiche. In generale, 16-25avevano una solubilità varia in acqua, solventi alcolici (metanolo/etanolo) e CH2Cl2, ma tutti avevano una buona solubilità in solventi aprotici altamente polari come DMF, DMSO e acetonitrile. Di conseguenza, tutte le soluzioni stock per UV/Vis (Fase 3.1 del protocollo) e studi di fluorescenza (Fase 4.1 del protocollo) e la maggior parte degli studi NMR sono stati effettuati utilizzando DMSO o DMSO-d6. Sebbene la maggior parte dei composti richiedesse un riscaldamento delicato (usando una pistola termica) per solubilizzare completamente in DMSO, una volta sciolti, 16-25 sembrano rimanere solubili e possono anche essere diluiti in soluzioni acquose senza precipitare. A causa della natura altamente polare dello stato ionico, gli analoghi da 16a25 in soluzione di base sono altamente solubili in acqua ma hanno poca solubilità nei solventi organici.
Mentre la reazione di condensazione di Claisen-Schmidt fornisce l'accesso a una serie di composti aromatici biciclici legati alla metina, oltre gli analoghi del dipirrinone descrivono all'interno, le condizioni di reazione possono limitare i tipi di molecole prodotte attraverso questo metodo. Come requisito fondamentale della reazione, sia un nucleofilo enolabile (come un pirrolinone o isoindolone) che un elettrofilo di aldeide non enoilabile devono reagire per consentire la condensa. Il mancato rispetto di questo requisito di base può comportare l'impossibilità di collegare tra loro i sistemi ad anello e/o la generazione di prodotti collaterali concorrenti. Inoltre, vengono utilizzate condizioni considerevolmente basilare per generare il nucleofilo enolato, che può creare incompatibilità con gruppi funzionali (cioè esteri, nitrili, alogenuri, ecc.) suscettibili a reazioni con idrossido. In questi casi, è possibile sostituire l'idrossido con basi azotate o carbonato, come è stato realizzato con 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-ene (DBU)30, trietilammina31,piperidina32,base33di Hünig e Na2CO334. Per effettuare una reazione analoga, abbiamo scelto di utilizzare idrossido di sodio semplicemente a causa della sua disponibilità e delle relative spese. Mentre questi vincoli possono richiedere modifiche alla procedura per accedere a composti specifici o impedire del tutto l'accesso ad altri, il metodo delineato nel protocollo può fornire un mezzo per accoppiare anelli aromatici per numerosi sistemi attraverso una reazione a passo singolo proceduralmente semplice ed economica. Nel caso degli analoghi dipyrrinone 16-25, la condensazione claisen-schmidt ha permesso una delle vie più accessibili ai fluorofori dipendenti dal pH descritti fino ad oggi.
La reazione di condensazione di Claisen-Schmidt ha il potenziale di servire come reazione chiave per la creazione di una serie di diversi sistemi di fluoroforo biciclici e triciclici. Mentre questa reazione è stata fondamentale per lo sviluppo di 3H,5H-dipirrolo[1,2-c:2',1'-f]pirimidina-3-uno (1), xantoglows ( 2), pyrroloindoli analoghi di dipirrinone (3, Figura 1), e più recentemente analoghi dipyrrinone 16-25, è possibile generare una gamma di sistemi fluorescenti completamente nuovi attraverso l'associazione della condensazione claisen-schmidt con disegni molecolari per limitare i processi fotoisomerici. Più specifici per lo studio in corso, i futuri progetti di analoghi del dipirrinone saranno probabilmente sviluppati utilizzando questa procedura delineata al fine di generare composti fluorescenti con una maggiore capacità di legame dell'idrogeno intramolecolare e valori pKa inferiori. Prevediamo che queste sonde potenziate dipendenti dal pH posseggono rese quantiche più elevate, consentendo al contempo la visualizzazione delle fluttuazioni del pH per una gamma più ampia di eventi intracellulari.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Z.R.W. e N.B. ringraziano il NIH (2P20 GM103440-14A1) per il loro generoso finanziamento, nonché Jungjae Koh e l'Università del Nevada, Las Vegas per la loro assistenza nell'acquisizione di NMR 1H e 13C. Inoltre, vorremmo ringraziare gli studenti dei media visivi NSC, Arnold Placencia-Flores, Aubry Jacobs e Alistair Cooper per il loro aiuto nei processi di riprese e animazione all'interno delle parti cinematografiche di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-ethyl-4-methyl-3-pyrrolin-2-one | Combi-Blocks | [766-36-9] | Yellow solid reagent |
| isoindolin-1-one | ArkPharm | [480-91-1] | Off-white solid reagent |
| 5-bromoisoindolin-1-one | Combi-Blocks | [552330-86-6] | Pink solid reagent |
| 2-formylimidazole | Combi-Blocks | [10111-08-7 ] | Off-white solid reagent |
| Imidazole-4-carbaldehyde | ArkPharm | [3034-50-2] | Solid reagent |
| 1-H-pyrazole-4-carbaldehyde | Oakwood Chemicals | [35344-95-7] | Solid reagent |
| 1-H-pyrazole-5-carbaldehyde | Matrix Scientific | [3920-50-1] | Solid reagent |
| Solid KOH Pellets | BeanTown Chemicals | [1310-58-3] | White solid pellets |
| Siliflash Silica Gel | Scilicycle | R12030B | Fine white powder |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (x10) | Growcells | MRGF-6235 | Colorless translucent liquid |
| Beckman Coulter DU-800 UV/Vis Spectrophotometer and Software | Beckman Coulter | N/A | Spectroscopy Instrument and Software |
| Fluoromax-4 Spectrofluorometer | Horiba Scientific | N/A | Spectroscopy Instrument |
| FluorEssence Fluoremetry Software V3.5 | Horiba Scientific | N/A | Spectroscopy Software |
| Finnpipette II Micropipette (sizes: 100-1,000, 20-200, and 0.5-10 µL) | Fischerbrand | N/A | Equipment |
| Wilmad-LabGlass Rotary Evaporator (Model: WG-EV311-V-PLUS) | SP Scienceware | N/A | Equipment |
| DuoSeal Vacuum Pump (Model Number: 1405) | Welch | N/A | Equipment |
| GraphPad Prism 4 | GraphPad | N/A | Data Analysis Software |
| SympHony pH Meter (Model: Sb70P) | VWR | N/A | Equipment |
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