Summary
Claisen-Schmidt 응축 반응은 메틴 브리지 접합 된 비압 방향족 화합물의 생성을위한 중요한 방법론이다. 알돌 반응의 기저 매개 이체를 활용하면 일반적으로 저렴하고 운영적으로 간단한 합성 접근법을 통해 다양한 형광 및/또는 생물학적 관련 분자에 접근할 수 있습니다.
Abstract
메틴-브리지 접합 된 비압 방향족 화합물은 포르피린, 디피린, 제약과 같은 생물학적으로 관련된 분자의 범위의 일반적인 성분이다. 또한, 이러한 시스템의 제한된 회전은 종종 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'f]피리미딘-3-ones, xanthoglows, 피릴로인소리니존 유사체, BODIPY 유사체 및 페클리노 및 이미드(GFPOR GFPor)의 페클리노 및 이미드(GFPor)의 피프리센소 시스템(Fluorina Greenzoin)에서 관찰되는 것과 같이 적당히 형광 시스템을 초래합니다. 이 원고는 일련의 형광 pH 의존 피라졸 /imidazole /isoindolone dipyrrinone 유사체를 생성하기 위해 Claisen-Schmidt 응축을 수행하는 저렴하고 운영적인 간단한 방법을 설명합니다. 방법론은 dipyrrinone 유사체의 합성을 설명하는 동안, 그것은 공액 비압 방향족 화합물의 넓은 범위를 생산하기 위해 번역 될 수있다. 이 방법에 활용되는 Claisen-Schmidt 응축 반응은 기본 조건(뉴클레오필 성분) 및 비-독열성 알데히드(전기필 성분)에서 열화할 수 있는 뉴클레오필 및 전기필로의 범위가 제한됩니다. 추가적으로, 뉴클레오필과 전기성 반응제는 우연히 수산화와 반응하지 않을 기능성 단을 포함해야 합니다. 이러한 한계에도 불구하고,이 방법론은 생물학적 또는 분자 프로브로 사용할 수있는 완전히 새로운 시스템에 대한 액세스를 제공합니다.
Introduction
두 개의 방향족 고리가 단백골 다리에 의해 연결되는 공해 된 바이실 시스템의 숫자는, 광자(그림 1A)1,2,3,4,5로흥분할 때, 본드 회전을 통해 이소성화를 겪는다. 흥분 된 이소머는 일반적으로 비 방사성 부패 프로세스6을통해 지상 상태로 휴식을 취할 것입니다. 본드 회전에 대한 에너지 장벽이 충분히 크게 증가하면 광소화를 제한하거나 방지할 수 있습니다. 대신, 광탄 흥분은 종종 비 방사성 부패(도 1B)보다는형광을 통해 이완하는 흥분 한 단일 상태를 초래한다. 광소화를 억제하는 것은 동월적 연결에 의해 두 방향족 링 시스템을 테더링하여 결합 회전을 기계적으로 제한함으로써 분자를 특정 이소성 상태로 잠급히게 함으로써 가장 일반적으로 수행됩니다. 이 접근법은 다음과 같은 여러 가지 다른 형광 트리플렉스 디피리네네 및 디피롤메탄 유사체를 만드는 데 활용되었습니다: 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'f]피리미딘-3-ones(1),x anthoglows(2)6,7,피렐로인돌리진 네디온 아날로그(3)8,및 BODIPY 유사체9 (4, 도2)이에 의해 피롤리딘 및 / 또는 피르롤 링 시스템은 메틸렌, 카보닐, 또는 붕소 디플루오로 링커. 일반적으로 1-4는 ΦF > 0.7을 가지고 있으며, 이는 이러한 시스템이 플루오로포어 유닛으로 매우 효율적이라는 것을 시사합니다.
또한 링 시스템을 공유적으로 연결하는 것 이외의 수단을 통해 광소화를 제한할 수도 있다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP)의 페놀 및 이미다졸리노네링(도 2)은단백질 환경에 의해 회전하도록 제한됩니다. 제한적인 설정은자유용액(10)에서동일한 크로모포어 유닛과 비교하여 양자 수율을 3배 증가시킨다. GFP의 단백질 비계가 스테릭 및 정전기효과(11)를통해 회전 장벽을 제공하는 것으로 여겨진다. 최근, 네바다 대학의 오도 그룹과 협력하여 우리 그룹은 디피리노네 기반 의 xanthoglow 시스템과 구조적 유사성을 부담하는 또 다른 불소 시스템을 발견(그림 2)12. 그러나 이러한 dipyrrinone 유사체는 공유 결합이 아닌 분자 내 수소 결합의 크anthoglow 시스템과 다르며 광원화를 억제하고 형광성 bicyclic 시스템을 초래합니다. 또한, 피라졸, 이미다졸 및 이소인돌론 디피리네 유사체는 양성자 및 탈화 상태에서 수소 결합할 수 있습니다. 방출은 시스템의 전자적 특성의 변화로 인해 흥분과 방출 파장의 적색 이동을 초래합니다. 수소 결합은제한된회전(13,14,15,16)에도양자 수율을 증가시키는 것으로 보고되었지만, 분자의 양성및 탈화 상태에서 이소성화가 제한된 형광계의 모드역할을 하는 다른 형광계통을 인식하지 못하고 있다. 따라서 이러한 pH 의존성 디피리노네 형광은 그런 면에서 고유합니다.
이 비디오에서는 형광 디피리논 아날로그 시리즈의 합성 및 화학적 특성에 중점을 둡니다. 특히, 전체 형광 유사체 시리즈를 구성하는 데 사용되었던 Claisen-Schmidt 응축 방법론에 중점을 두고 있다. 이 반응은 알데히드 그룹을 공격하는 기본 매개 비닐 압단 이온의 생성에 의존하여 나중에 제거를 받는 알코올을 생산합니다. 디피리네네 아날로그 시리즈의 경우, 피라졸 또는 이미다졸 링에 부착된 알데히드 군에 대한 공격을 용이하게 하기 위해 피롤리네네/이소인돌론을 에놀레이트로변환(도 3); 제거 후 메틴 브리지로 연결된 완전히 공자 된 바이크실 시스템이 형성됩니다. 전체 계열의 디피리네네 아날로그는 쉽게 구할 수 있는 상업용 재료로 구성될 수 있으며, 일반적으로 중간정도의 단일 1-냄비 반응 서열에서 높은 수율(수율은 약 50~95%)으로 생성될 수 있다는 점에 주목할 만하다. 대부분의 디피리네 아날로그는 자연에서 매우 결정적이기 때문에 표준 작업 조건 이외의 정제는 거의 정제가 요구되므로 무분별하게 순수한 샘플을 생성해야합니다. 따라서, 이 불소 계통은 쉽게 이용 가능한 상업적 물자에서 접근하기 위하여 단지 몇 단계만 필요로 하고 상대적으로 짧은 시간 프레임에 있는 분석 또는 생물학 연구 결과를 위해 합성, 정제 및 준비될 수 있습니다.
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Protocol
1. 디피리네 아날로그 합성을 위한 일반적인 절차 16-25
- 파이롤리네네/이소인돌론(1.00mmol)과 해당 피라졸/이미다졸 알데히드(1.00mmol)를 라운드 하단 플라스크에서 5.0mL의 에탄올로 녹입니다.
- 한 부분으로 플라스크에 수성 KOH(24.0mmol, 10M, 2.40mL)를 추가합니다.
- TLC에 의해 반응이 완료될 때까지 혼합물을 저어서 역류합니다(반응 시간 목록은 표 1 참조). 디클로로메탄에서 10% 메탄올의 TLC 용액이 사용되었고, 아날로그는 0.62 에서 0.86 범위 의 범위 안팎의 Rf 값을 보유하는 것으로 관찰되었다. 충분한 양의 진공 그리스를 적용하거나 유리 조인트 의 중간 단계에서 PTFE 슬리브를 사용하여 응축기의 유리와 둥근 바닥 플라스크가 고온 및 기본 조건에서 압류되는 것을 방지하십시오.
- 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 회전 증발기를 사용하여 압력 감소하에서 휘발성을 증발시키십시오.
- 얼음 목욕을 사용하여 반응 혼합물을 0 °C로 식힙니다.
- 한 부분에 아세트산(30.0mmol, 1.70 mL)을 추가하여 남은 유성 혼합물을 중화한다.
- 진공 여과를 사용하여 결과 제품 재료를 정화 (2a,화합물: 17, 18, 20-22, 24 및 25)또는 액체 액체 추출/컬럼 크로마토그래피를 사용하소서(2b 단계참조, 화합물: 16, 19,및 23).
2. 절차 정화
- 진공 여과를 통해
- 장착 된 고무 어댑터를 사용하여 사이드 암 플라스크에 Hirsch 깔때기를 맞춥니다.
- 히르쉬 깔때기에 둥근 필터 용지를 바르고 탈이온된 물을 사용하여 가볍게 젖어 깔때기를 준수하십시오.
- 진공 소스를 플라스크의 측면 암에 연결하고 진공 상태에서 유리 제품을 분리할 수 없도록 하여 충분한 진공 밀봉이 있는지 확인합니다.
- 결정화된 제품이 포함된 플라스크를 진공 필터 위에 붓고 걸러내십시오. 10mL의 얼음처럼 차가운 산화물로 결정을 헹구는 다.
- 여과된 결정이 모든 액체의 여과 에 따라 진공 소스에 연결하면서 필터 용지 위에 계속 건조되도록 합니다.
- 여과된 결정을 수집하고 25mL 라운드 하단 플라스크에 배치합니다.
- 둥근 바닥 플라스크를 프릿지 글래스 조인트/진공 선 어댑터에 부착합니다. keck 클립으로 유리 조인트 조합을 확보하십시오.
- 유리 고진공선 어댑터의 리브드 엔드에, 높은 진공 펌프로 라우팅되는 진공 선을 부착하고 진공 트랩(액체 질소 또는 드라이 아이스/아세톤과 같은 냉각제 사용)을 적절히 냉각하여 결정성 물질로부터 증발할 수 있는 휘발성 물질을 응축시합니다. 높은 진공 펌프를 켜서 결정에서 남은 용매의 미량의 완전한 증발을 보장합니다.
- 크리스탈이 최소 1시간 동안 높은 진공 상태에서 건조되도록 합니다. 진공 선/어댑터에서 둥근 바닥 플라스크를 제거하고, 높은 진공 펌프를 끄고, 진공 트랩을 청소합니다.
-
열 크로마토그래피를 통한 절차 정화
- 아세트산 처리 된 반응 혼합물 내용물을 희석 (단계로부터 1.6) 10 mL의 탈온화 된 물로 희석하고 분리 깔때기로 옮김. 분리 유입경로에 디클로로메탄 10mL를 추가합니다. 두 층을 분리하기 위해 분리 깔때기를 부드럽게 흔들고 배출합니다.
- 디클로로메탄(3 x 5mL)의 후속 부분을 사용하여 수성 층을 추출한다. 무수성 Na2SO4를사용하여 유기 분획과 건조를 결합합니다. 회전 증발기로 저압하에서 모든 휘발성을 제거하고 제거합니다.
- 2.2.2 단계에서 얻은 잔류물을 희석시 희석합니다. CH 2Cl2의5mL. 약 75g의 실리카 젤을 사용하여 플래시 컬럼 크로마토그래피를 수행합니다. 디클로로메탄에서 10% 메탄올의 용액으로 시료를 엘테.
- 회전 증발기는 감소된 압력하에서 용매의 수집된 분수를 제거합니다. CH 2Cl2의약 10mL를 사용하여 고체 잔류물을 25mL 원형 바닥 플라스크로 전송한다. 회전 증발기로 저압하에서 용매를 제거합니다.
- 2.1.7 - 2.1.9 단계에 설명된 바와 같이 고진공 하에서 나머지 고체 잔류물을 건조시.
3. 어금니 압전 획득 및 UV/VispK 아날로그에 대한 연구 16-25
- 아날로그 16 - 25에대한 UV / 비스 분광측정을위한 복합 스톡 솔루션을 만듭니다.
- 선택한 디피리네 아날로그(16 - 25)의10 μmol을 계량하고 10 mL 체피 플라스크에 추가합니다.
- 볼륨 플라스크의 10.0 mL 마크에 DMSO를 추가합니다.
참고: 화합물이 완전히 용해되지 않으면 열총을 사용하여 플라스크를 가열하고 필요에 따라 플라스크를 교반하여 화합물을 완전히 녹입니다.
- 다양한 pH 수준에서 인산염 완충식염(PBS) 솔루션을 만듭니다. 유사체는 약 4에서 15까지 pH에 이르는 PBS 버퍼를 특징으로 했다.
- 1L 체피 실린더를 사용하여 900mL의 탈온화 수에 100mL의 PBS(x100)를 희석하여 PBS 스톡 솔루션 1L을 만듭니다.
- 준비된 PBS 스톡 솔루션(3.2.1단계)을 100mL 비커로 옮기고 마그네틱 스터드 바를 추가합니다. 그런 다음 보정된 pH 미터를 사용하여 pH의 변화를 모니터링하고, PBS 버퍼를 수성 1.0 M NaOH(pH > 7.0의 버퍼를 얻으려면) 또는 1.0 M HCl(pH < 7.0을 가진 버퍼를 얻으려면)로 적시한다.
참고: 잘 정의된 적정 곡선을 생성하는 데이터를 얻으려면 예상 변곡점 외부의 0.5점 의 변곡점 및 0.5의 증가 지점의 ± 0.5 내의 0.1 pH 단위로 pH 버퍼를 생성하는 것이 좋습니다.
- PBS(pH 7.0) 및 1.0 M NaOH(pH 14.0) 솔루션에서 아날로그 16-25에 대한 어금반 흡수 스펙트럼을 획득한다.
- 깨끗하고 건조한 석영 큐벳을 사용하여 "빈"을 준비한 다음 PBS 스톡 솔루션(pH 7.0) 또는 100 -1000 μL 마이크로파이프를 사용하여 큐벳에 2.0 mL를 추가합니다.
참고: 큐벳 솔루션에 기포가 없도록 하고 큐벳 외부의 먼지나 파편으로 인한 빛이 산란되는 것을 방지하기 위해 큐벳의 측면을 철저히 닦아야 하는 빈 솔루션 데이터 수집 프로세스의 무결성이 중요합니다. 거품이 지속되면 딱딱한 표면에 놓인 종이 타월에 큐벳을 부드럽게 반복해서 두드립니다. - UV/Vis 분광계를 사용하여 선택한 솔루션을 200-800 nm 범위에 블랭크합니다.
- 두 번째 깨끗하고 건조한 석영 큐벳에 PBS (pH 7.0) 또는 1.0 M NaOH (pH 14)의 2.00 mL을 추가한 다음 dipyrrinone 아날로그(16 - 25)스톡 용액 (단계 3.1 참조)을 5-50 μL 마이크로렛으로 넣습니다. 큐벳에 캡을 놓고 큐벳을 반전시키는 것 외에도 잘 흔들어 줍니다.
참고: 큐벳 솔루션에 기포가 없는지 확인하고 큐벳 외부의 먼지나 파편으로 인한 빛이 산란되는 것을 방지하기 위해 큐벳의 측면을 철저히 닦아야 하는 것이 중요하다. 거품이 지속되면 딱딱한 표면에 놓인 종이 타월에 큐벳을 부드럽게 반복해서 두드립니다. - UV/비스 분광계를 사용하여 200-800 nm 범위에 대한 dipyrrinone 아날로그 용액에 대한 흡수 스펙트럼을 획득하십시오.
- 동일한 큐벳에, dipyrrinone 아날로그 스톡 솔루션의 10 μL을 추가하고 3.3.3 및 3.3.4 단계를 반복합니다.
- 반복 단계 3.3.5 디피리네네 아날로그 스톡 솔루션의 총 50 μL까지 5 개 이상의 여기 파장 데이터 포인트를 획득하기 위해 큐벳에 추가되었습니다. 반복 단계 3.3.1 - 3.3.6 모든 재고 솔루션이 16 - 25의 모든 주식 솔루션이 PBS (pH 7.0) 및 1.0 M NaOH 모두에서 얻어졌습니다.
- 깨끗하고 건조한 석영 큐벳을 사용하여 "빈"을 준비한 다음 PBS 스톡 솔루션(pH 7.0) 또는 100 -1000 μL 마이크로파이프를 사용하여 큐벳에 2.0 mL를 추가합니다.
- PBS(pH 7.0) 및 1.0 M NaOH에서 16-25에 대한 어금니성 흡수값을 가장 적합선형 회귀 분석을 사용하여 가져옵니다.
- 그래프 패드 프리즘 7과 같은 그래프 프로그램을 사용하여, 디피리논 아날로그 농도 (x 축)에 대해 측정 된 흡광도 (y 축)을 플롯합니다. 플롯된 5개의 점에 대해 가장 적합한 선형 회귀 분석을 만듭니다. 선형 관계를 관찰해야 하며 통계 분석은 R2 값을 ≥ 0.98을 보여야 합니다.
- PBS(pH 7.0)에서 아날로그 16-25 및 1.0 M NaOH용 반복 단계 3.4.1을 반복한다.
- PBS(pH 7.0)에서 16-25 및 1.0 M NaOH에 대한 어금니를 계산하여 최적의 핏 선형 곡선으로부터 추정된 경사 값을 사용합니다.
- PK의 값을 16 - 25 UV/비스 분광성 측정을 사용하여 결정
- 깨끗하고 건조한 석영 큐벳으로 100 -1000 μL 마이크로파이프를 사용하여 선택한 pH 수준(3.2단계에서 제조)에서 PBS 버퍼의 1,900 μL을 전송합니다.
참고: 저장소에서 일부 버퍼에서 흰색 침전제가 형성될 수 있음을 발견했습니다. 버퍼가 완전히 균일하고 침전물이 보이는 경우 중력 여과를 사용하여 사용 직전에 침전물을 제거하십시오. 3.3.1 단계 후 의 메모를 참조하십시오. - UV/비스 분광계를 사용하여 선택한 PBS 버퍼 솔루션을 200-800 nm 범위에 블랭크합니다.
- 두 번째 깨끗하고 건조한 석영 큐벳에, 선택한 PBS 버퍼의 1,900 μL을 전송한 다음 5-50 μL 마이크로 파이프를 사용하여 선택한 아날로그 스톡 솔루션의 100 μL을 추가합니다. 큐벳에 캡을 놓고 큐벳을 반전시키는 것 외에도 잘 흔들어 줍니다.
참고: 3.3.3단계 이후에 이전 메모를 참조하십시오. - UV/비스 분광계를 사용하여 200-800 nm 범위에 대한 dipyrrinone 아날로그용 흡수 스펙트럼을 획득한다.
- 3.2 단계에서 생성된 PBS 버퍼 각각에서 16 -25에 대해 3.5.1 - 3.5.4 단계를 반복합니다.
- 깨끗하고 건조한 석영 큐벳으로 100 -1000 μL 마이크로파이프를 사용하여 선택한 pH 수준(3.2단계에서 제조)에서 PBS 버퍼의 1,900 μL을 전송합니다.
- pK가 16-25의 값을 가장 잘 맞는 시그로이드 곡선 피팅 함수를 사용하여 결정합니다.
- 그래프 프로그램을 사용하여, 다양한 pH 수준에서 16-25에 대해 측정된 흡광도(nm)를 그래프로 분석한다.
- 380-415 nm 사이의 파장을 선택하길, 낮은 pH 수준(< 7.0)에서 흡광도가 작고(0-0.1 단위) 및 더 큰 pH(> 12.0) 흡광도는 상당히 큽니다(0.8-1.0 단위). 선택한 파장 대 pH에서 흡광도를 플롯합니다.
- 시그오이드 커브 함수를 사용하여 각 아날로그 16 -25에가장 적합한 곡선을 생성합니다. 경구의 반 높이에서 추정된 pH를 보고합니다. 보고된 pK값입니다.
4. 양자 수율 획득 및 형광 연구
- 디피리네 유사체 16 - 18 및 20 - 25에대한 형광 연구 스톡 솔루션을 만듭니다.
- 3.1 단계에서 생성된 dipyrrinone 아날로그 스톡 솔루션을 사용하여 2-20 μL 마이크로피펫을 사용하여 1mL 체피 플라스크에 스톡 솔루션의 10 μL을 추가한 다음 PBS(pH 7.0) 버퍼를 1mL 마크에 추가합니다. 볼륨 플라스크에 캡을 놓고 플라스크를 반전하고 흔들어 잘 섞습니다. 이러한 희석 주식 용액은 형광 스펙트럼을 생성하는 데 사용되며 형광 스톡 솔루션이라고 합니다.
- 아날로그 16 - 18 및 20 - 25에대한 반복 단계 4.1.1 .
- 아날로그 16 - 18 및 20 - 25에대해 다양한 농도에서 형광 방출 스펙트럼을 획득하십시오. 18을제외한 모든 유사체의 경우, 19.96, 39.84, 59.64, 79.37 및 99.01 nM의 농도에서 pH 7 및 14의 솔루션에서 각 아날로그에 대해 5개의 스펙트럼을 획득한다. 아날로그 18의 경우, 49.75, 99.01, 147.8, 196.1 및 243.9 nM의 농도에서 pH 7의 용액에서 5개의 스펙트럼을 획득한다. pH 14의 용액에서, 99.01, 196.1, 291.3, 384.6, 476.2 nM의 농도에서 아날로그 18에 대한 다섯 스펙트럼을 획득한다.
- 투명한 4면 쿼츠 큐벳에 3.00mL의 PBS(pH 7.0) 또는 1.0 NaOH를 100-1,000 μL 마이크로파이프를 사용하여 1,000μL 단위로 추가합니다.
참고: 3.3.1단계 이후에 는 참고를 참조하십시오. - 플루오로미터 및 플루오로미터 소프트웨어 프로그램 FluorEssence를 사용하여 선택한 솔루션에 대한 방출 스펙트럼을 획득하고 이를 솔루션 "블랭크"로 레이블을 지정합니다.
- 동일한 큐벳에 0.5-10 μL 마이크로피펫을 사용하여 선택한 디피리네 종 아날로그(4.1부)에 형광 스톡 용액 6μL을 추가합니다. 큐벳에 캡을 놓고 큐벳을 반전하고 부드럽게 흔들어 잘 섞습니다.
참고: 3.3.3단계 이후에 는 참고를 참조하십시오. - 불소계를 사용하여, λ최대 복근을 이용하여 선택된 화합물 용액에 대한 방출 스펙트럼을 발산 파장으로 획득한다. 흥분 강도는 각성 파장을 넘어 15 nm에서 시작하여 200 nm 범위에서 측정하였다 (일반적으로 200 nm 범위는 형광 강도가 기준선으로 복귀하기 위해 필요합니다).
- 반복 단계 4.2.3 - 4.2.4 총 30 μL의 형광 스톡 용액이 큐벳에 추가될 때까지.
- 반복 단계 4.2.1 - 4.2.5 아날로그에 대한 16 - 25 PBS (pH 7.0) 및 1.0 M NaOH.
참고: 큐벳 농도는 아날로그 18에 대해 변경되었고 데이터를 사용하여 획득하였다: PBS의 2.0 mL5 연속 10 μL 증분의 형광 스톡 용액(양성18) 용액 및 2.0 m NaOH의 2.0 mL, 5개의 20 μL 증분의 화합물 재고 용액(deproat) 188을 위한 추가 된 화합물 재고 용액(deproat) 용액(deproat) 용액을 추가하였다.
- 투명한 4면 쿼츠 큐벳에 3.00mL의 PBS(pH 7.0) 또는 1.0 NaOH를 100-1,000 μL 마이크로파이프를 사용하여 1,000μL 단위로 추가합니다.
- 윌리엄스, A. T. 외.17의 방법을 사용하여 양자 수율을 결정
- 스프레드시트 소프트웨어 프로그램(즉, Microsoft Excel)을 사용하여 다양한 농도 수준에서 PBS [pH 7.0] 또는 1.0 M NaOH 중 하나에서 가져온 단일 dipyrrinone 아날로그용 방출 스펙트럼에 대한 데이터(방출 강도 데이터 포인트)를 가져옵니다.
- "공백" 솔루션(단계 4.2.1 - 4.2.2)에 대한 배출 스펙트럼에서 데이터 포인트를 가져오고, 다양한 농도 수준에서 획득한 해당 파장에서 배출 강도 데이터 요소로부터 "빈" 배출 강도 데이터 포인트를 뺍니다.
- "공백" 수정된 방출 강도 데이터 포인트를 그래프 프로그램(예: GraphPad Prism 7)로 전송하고, 파장 대 배출을 플롯합니다. dipyrrinone 아날로그의 다양한 농도 수준에서 얻은 각 곡선에 대한 곡선 아래 영역을 계산합니다.
- 윌리엄스에 의해 설명 된 기술에 따라, A. T. 외, dipyrrinone 아날로그의 다양한 농도 수준의 각각에 대한 추정 된 흡광도 값을 계산합니다. 이는 4.2.3-4.2.5 단계에서 사용되는 dipyrrinone 아날로그의 각 농도에 따라 계산된 어어 흡수성 값(최적 선형 회귀 분석에서, 단계 3.4 참조)을 곱하여 달성된다.
- GraphPad Prism 7과 같은 그래프 프로그램을 사용하여, 가장 큰 방출 값에 대응하는 배출 파장에 대해 각 농도 곡선(단계 4.3.4) 하에서 계산된 영역에 대해 아날로그의 추정 된 흡광도(x 축)의 플롯을 만듭니다. r2와 선형 관계는 0.96 ≥ 관찰해야 합니다.
- 0.5M H2SO4(Φ F = 0.55) 18 및 탄올(ΦF = 0.27)18, 19의안트라신에서 퀴닌에 대해 3.1-3.4 및 4.1-4.3.5와 유사한 단계를 수행하여 표준에 대한 데이터를 얻을 수 있다.
- 다음 방정식에서 4.3.5 및 4.3.6 단계에서 얻은 추정 경사면을 사용하여 PBS(pH 7.0) 및 1.0 M NaOH에서 16-25 및 1.0 M NaOH에 대한 양자 수율 값을 가져옵니다.
Φx=Φst st(그라드x/그라드세인트)(η2x/η2st)
Φst가 표준의 양자 수율을 나타내는 경우 Φx는 미지의 양자 수율을 나타내며, 그라드는 최고의 선형 핏의 경사이며, η 사용되는 용매의 굴절률(굴절률 비는 η = 에탄올에 대한 1.36 및 η =0.5M H2SO4)를사용하여 계산되었다. - 퀴닌 및 탄트라신에 대해 얻은 Φx의 평균으로 PBS(pH 7.0)와 1.0 M NaOH에서 16 - 18 및 20 - 25의 양자 수율을 보고합니다.
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Representative Results
Claisen-Schmidt 응축 반응은 프로토콜 섹션에 기재된 1냄비 절차를 사용하여 dipyrrinone유사체(16-25, 도 4)에대한 액세스를 제공하였다(1단계 참조). 아날로그 16-25 모두 응축 피롤리노네 9,브로모이소인돌론 10,또는 이소인돌론 11에 의해 생성되었다 1H-imidazole-2-carboxaldehyde(12)), 1 H-imidazole-5-carboxaldehyde(13),1H-피라졸-3-카르바칼데히드(14),또는 1H-피라졸-4-카르바팔데히드(15); 상기 조합은 분자 내 수소결합(표 1)을형성할 수 없는 대조화합물, 19를포함하는 10가지 다른 유사체를 생산하였다. 반응 시간은 전형적으로 완료를 위해 역류의 24 h를 필요로 하지만, 20 단지 6 h의 경우, 반면, 23 및 24 각각 30 h및 27 h의 약간 더 긴 시간. 제품 수율은 41%에서 96%로, 표 1에설명된 바와 같이, 이는 딥리네온에 대한 유사한 응축 반응의 전통적인 추세를 따릅니다. 화합물 17, 18, 20 - 22,24 및 25, 그들의 높은 결정적 특성으로 인해, 모두 간단한 진공 여과 방법에 의해 정제되었다; 단지 화합물 16, 19,및 23 정화를 위한 크로마토그래피를 필요로 했습니다.
프로토콜 섹션에서 3- 4 단계를 수행하여 얻은 화합물(16-25)의광물리적 특성은 표 2에요약된다. pK는 각 화합물에 대해 측정된 값이 12에서 > 13.5까지 다양하며, 이는 각 dipyrrinone 아날로그를 완전히 분해하기 위해 충분한 기본 조건이 필요하다는 것을 시사한다. 각 화합물의 양성 및 탈화제 상태에서 다른 광물리적 특성으로 인해 스펙트럼은 16-25의중립(pH 7.0 PBS) 및 기본(1.0 M NaOH) 용액을 사용하여 획득되었다. 중립 pH(양성자 상태)에서 화합물 16-25는324nm에서 365nm까지 에 이르는 λmax abs를 가지며, 이는 모두 10~37nm로 변속되어 분해된 상태에 비해 이다. 어금니 의 범위는 15,000에서 30,000사이이지만 주어진 아날로그의 양성및 분해 된 상태 사이에 실질적으로 벗어난 것으로 보이지 않습니다. 아날로그 19는 어떤 검출형 형광을 표시하지 않았다, 그러나, 16-18 및 20-25 발광 된 빛은 409 - 457 nm에서 중립 pH에서 457 nm 및 기본 pH에서 443 - 482 nm에 이르기까지 λmax em을 방출; 배출 파장에 대해서도 최대 양성/탈프로톤 흡광도 파장의 것과 유사한 적색 이동 추세가 관찰된다. ΦF는 중립 및 기본 수성 솔루션 모두에서 0.01에서 0.30까지 다양하며, 이는 비교 가능한 xanthoglows보다 상당히 낮습니다. 그러나 화합물 16, 20,및 25 로다민 B (ΦF = 0.23),20 아크리딘 오렌지 (ΦF = 0.36),21 파이로닌 Y (ΦF = 0.22),20 및 대부분의 시아닌 염료 시리즈 (일반적으로 ΦF = 12.0)와 같은 중고 형광류의 유사한 영역에서 가을. 22
Dipyrrinone analogs 16-25는 모두 표 2에 요약된 UV/Vis 및 형광 분광학 실험 이외에 융점 분석, IR 분광법, 1HNMR 및 13C NMR 분광법 및 고해상도 질량 분광법을 사용하여 화학적으로 특징지어졌습니다. 화학적 특성화 및 원래 1HNMR 및 13C NMR 스펙트럼은 원래 문헌 소스에서 찾을 수 있습니다,12, 편의를 위해, 화합물에 대한 특성 16, 20,및 23,이는 가장 큰 양자 수율을 소유하는 아래보고된다 :
(Z)-5-(1H-imidazol-2-yl)메틸렌)-3-에틸-4-메틸-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-1 (16). 160 °C에서 분해; 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.3 (brs, 1H), 9.87 (s, 1H), 7.13 (애플 리 케이 션, 2H), 5.93 (s, 1H), 2.23 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 2.00 (s, 3H), 0.98= 3; 13 C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170.7, 144.8, 140.0, 139.6, 133.9, 130.2, 117.6, 94.1, 16.7, 13.6, 9.33; IR (박막) 3742, 3148, 3063, 2924, 2353, 1651, 1543, 1450, 771, 717 cm-1; HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd 용 C11H13N3ONa 226.0956, 발견 226.0956.
(Z)-5-(1H-pyrazol-4-yl)메틸렌)-3-에틸-4-메틸-1,5-디하이드로-2H-피롤-2-1 (19). 202 °C에서 분해; 1 H NMR (400 MHz, CD3에서 20% CD3OD CD) δ 1H NMR (400 MHz, 클로로폼-d) δ 7.74 (s, 2H), 6.01 (s, 1H), 2.27 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 2.02 (s, 3H), 1.02 (s, 3H), 1.02 = 3: J= 3. 13 C{1H} NMR (101 MHz, CDCl3)δ 173.7, 141.9, 136.0, 133.0, 116.1, 105.0, 100.8, 16.9, 13.4, 9.61; IR (박막) 3163, 3117, 3048, 2963, 2362, 1674, 1558, 1512, 1396, 1257, 1157, 948, 871, 794, 702cm-1; HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ C11H13N3ONa 226.0956용 Calcd, 226.0955.
(Z)-3-(1H-이미다졸-2-yl)메틸렌)-5-브로모이소인돌린1-1(20). 213 °C에서 분해; 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.97 (s, 1H), 7.59 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.0, 1H), 7.06 (s, 2H), 6.57 (s, 1H); 13 C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 167.7, 146.6, 140.2, 134.5, 131.7, 129.1, 125.8, 125.03, 124.99, 123.6, 96.5; IR (박막) 3742, 3240, 2314, 1682, 1543, 1520, 1435, 1312, 1080, 826, 694cm-1; HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd 용 C12H8BrN3ONa 311.9749, 발견 311.9752.
(Z)-3-(1H-이미다졸-2-yl)메틸렌)이소인돌린-1-1-1(23). 228 °C에서 분해; 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.34 (s, 1H), 10.74 (들), 1H), 7.90 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.63 (dd, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 7.6, 7.3 Hz, 1H), 7.17 (s, 2H); 13 C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 167.3, 144.9, 137.3, 135.1, 132.8, 129.9, 129.3, 123.6, 121.0, 117.6, 92.9; IR (박막) 3741, 3201, 3086, 2361, 2322, 1682, 1543, 1520, 1119, 748, 687cm-1; HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd 용 C12H9N3ONa 234.0643, 발견 234.0641.
| 항목 | 피롤리네네/이소인돌론 | 알데하이드 | 수율(%)b | 시간 (h) | 제품 |
| 1 | 9 | 12 | 80 | 24 | 16 |
| 2 | 9 | 13 | 41 | 24 | 17 |
| 3 | 9 | 14 | 79 | 24 | 18 |
| 4 | 9 | 15 | 61 | 24 | 19 |
| 5 | 10 | 12 | 96 | 6 | 20 |
| 6 | 10 | 13 | 70 | 24 | 21 |
| 7 | 10 | 14 | 66 | 24 | 22 |
| 8 | 11 | 12 | 49 | 30 | 23 |
| 9 | 11 | 13 | 49 | 27 | 24 |
| 10 | 11 | 14 | 94 | 24 | 25 |
표 1. 16-25의 합성을 위한 조건 및 반응 수율
EtOH의 5mL에서 1mmol 스케일로 수행된 반응. b 격리된 수율.
| 화합물 | 복근. λ최대 (nm) | ε(M-1cm -1) | 플루어. λ최대 (nm) | Φb | pKa |
| 16 | 351 (384) | 24500 (22800) | 451 (482) | 0.30 (0.30) | 12.7 |
| 17 | 338 (380) | 18600 (18600) | 442 (462) | 0.01 (0.03) | 12.8 |
| 18 | 324 (349) | 29800 (25700) | 455 (465) | 0.01 (0.02) | 13 |
| 19 | 326 (358) | 29900 (21300) | – | – | 12.9 |
| 20 | 365 (378) | 15000 (15500) | 457 (475) | 0.22 (0.20) | 12.5 |
| 21 | 355 (380) | 15100 (16800) | 409 (443) | 0.03 (0.01) | 12.9 |
| 22 | 341 (363) | 19800 (23100) | 427 (452) | 0.02 (0.01) | >13.5 |
| 23 | 360 (373) | 29000 (21300) | 449 (474) | 0.25 (0.26) | 12 |
| 24 | 351 (373) | 17200 (19400) | 432 (454) | 0.07 (0.05) | 12.8 |
| 25 | 340 (357) | 20200 (23500) | 410 (449) | 0.02 (0.02) | >13.5 |
표 2. pH 7.0 PBS 버퍼 및 1 M NaOH(괄호에서 제공)에서 6-14 및 22의 광물리적 특성 및 pKa 값.
형광은 19에대해 검출할 수 없었다. b 퀴닌(Q = 0.55)15 및 안트라신(Q = 0.27)15,16이 표준으로 사용되었다.
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Discussion
Claisen-Schmidt 응축 접근법은 비교적 운영적인 단순한 프로토콜을 통해 피라졸, 이미다졸 및 이소인돌론 디피리논 형광을 생성하는 상당히 강력한 수단을 제공합니다. 형광 디피리네 종 유사체의 합성이이 연구의 초점이었지만, 유사한 조건이 dipyrrinones23,24,25 및 피롤 - 후란 유도와 같은 다른 bicyclic 메틴 연결된 링 시스템에 액세스하기 위해 적용 될 수 있음을 주목해야한다. 3H-pyrazol-3-1-furan 애드덕터27,이소인돌론 피롤 어덕트28,2H-Indol-2-1-pyrindine adducts29 잠재적인 의약품으로 약속을 보유. 일반적으로, 설명된 절차는 중간에서 높은 수율에 반응 제품을 제공하지만, 반응 진행도의 지속적인 모니터링이 성공적인 결과에 필수적이라는 점에 유의하는 것이 중요하다. 일부 예비 시험에서는, 과도한 반응 시간에 대한 가열이 반응의 완성(5-24시간)을 훨씬 넘어서, 후속 정화 단계를 복잡하게 할 수 있는 분해 제품으로 이어졌다는 것을 발견하였다. 이러한 이유로, TLC 분석은 반응 진행상황을 모니터링하고 반응속도의 감각을 얻기 위해 1h, 3h, 6h, 12h 및 24h 타임 마크에서 수행되는 것이 좋습니다.
Dipyrrinone 유사체 16-25,양성/중립 상태에서, 광물리학, 생물학적 및 분석 적 특성을 연구 할 때 문제가 될 수있는 일반적으로 사용되는 유기 용매에서 용해도 특성의 범위를 갖는다. 일반적으로16-25는 물, 알코올 용매(메탄올/에탄올), CH 2 Cl 2의용해도가 다양했지만 모두 DMF, DMSO 및 아세토닐릴과 같은 극성 아프로틱 용매에서 용해도가 양호했습니다. 따라서 UV/Vis(프로토콜의 3.1단계) 및 형광 연구(프로토콜의 단계 4.1) 및 대부분의 NMR 연구를 위한 모든 재고 솔루션은 DMSO 또는 DMSO-d6을 사용하여 수행되었습니다. 대부분의 화합물은 DMSO에서 완전히 용해하기 위해 부드러운 가열 (열총을 사용하여)이 필요했지만, 일단 용해되면 16-25가 용해 상태로 남아 있는 것처럼 보이며 침전하지 않고 수성 용액으로 희석 될 수 있습니다. 이온 상태의 극성 특성으로 인해 기본 용액의 아날로그 16-25는 용해도가 높지만 유기 용매의 용해도가 거의 없습니다.
Claisen-Schmidt 응축 반응은 메틴-연결된 bicyclic 방향족 화합물의 범위에 대한 액세스를 제공하지만, 내에서 설명하는 dipyrrinone 유사체를 넘어, 반응 조건은이 방법을 통해 생성 된 분자의 유형을 제한 할 수 있습니다. 반응의 근본적인 요구 사항으로서, 호화질 뉴클레오필 (예 : 피롤리논 또는 이소인돌론)과 비 이노놀리성 알데히드 전기필은 응축을 가능하게 하기 위해 반응해야 한다. 이 기본 요구 사항을 충족하지 못하면 링 시스템 및/또는 경쟁 측 제품의 생성을 함께 연결할 수 없게 될 수 있습니다. 또한, 상당히 기본적인 조건은 수산화와 의 반응에 취약 기능성 그룹 (즉, 에스테르, 니트릴, 넙치 등)와 비호환성을 만들 수있는 황량한 뉴클레오필을 생성하기 위해 사용됩니다. 이러한 경우, 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (DBU)30,트리에틸라민31,파이프리딘32,휘니그베이스33,및나2CO34로달성된 바와 같이, 질소염기 또는 탄산염으로 수산화를 대체 할 수있습니다. 유사 반응을 수행하기 위해, 우리는 단순히 가용성과 상대 비용으로 인해 수산화 나트륨을 사용하기로 결정했습니다. 이러한 제약 조건은 특정 화합물에 액세스하거나 다른 화합물에 대한 액세스를 완전히 방지하는 절차에 대한 수정을 요구할 수 있지만, 프로토콜에 설명된 방법은 절차적으로 간단하고 비용 효율적인 단일 단계 반응을 통해 수많은 시스템에 대한 방향족 고리를 결합하는 수단을 제공할 수 있습니다. dipyrrinone 유사체 16-25의경우, Claisen-Schmidt 응축은 현재까지 설명된 pH 의존형 형광에 가장 접근하기 쉬운 경로 중 하나를 가능하게 했습니다.
Claisen-Schmidt 응축 반응은 다른 bicyclic 및 트리클릭 형광소 시스템의 범위의 창조를 위한 중요한 반응으로 봉사할 가능성이 있습니다. 이 반응은 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'f]피리미딘-3-ones(1),xanthoglows(2),피르톨로인돌리진네디오네디온 아날로그의 개발에 중요했습니다.(3, 도 1)그리고 가장 최근에 는 디피리네종 유사체 16-25, 광소 공정을 제한하는 분자 설계와 Claisen-Schmidt 응축을 페어링하여 완전히 새로운 형광 시스템의 범위를 생성할 수 있다. 손에 연구에 더 구체적인, dipyrrinone 아날로그의 미래 디자인은 가능성이 강한 분자 수소 결합 용량과 낮은pK 값을 가진 형광 화합물을 생성하기 위해이 설명 된 절차를 사용하여 개발 될 것입니다. 이러한 향상된 pH 의존 프로브는 더 높은 양자 수율을 보유하는 동시에 더 넓은 범위의 세포내 이벤트에 대한 pH 변동을 시각화할 것으로 예상합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Z.R.W.와 N.B.는 NIH (2P20 GM103440-14A1)뿐만 아니라 1 H및 13C NMR을 인수하는 데 도움을 준 코정재 와 네바다 대학, 라스베이거스에 감사드립니다. 또한, 우리는 NSC 비주얼 미디어 학생, 아놀드 플레이스시아 플로레스, Aubry 제이콥스, 알리스테어 쿠퍼가이 원고의 촬영 및 애니메이션 프로세스에 도움을 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-ethyl-4-methyl-3-pyrrolin-2-one | Combi-Blocks | [766-36-9] | Yellow solid reagent |
| isoindolin-1-one | ArkPharm | [480-91-1] | Off-white solid reagent |
| 5-bromoisoindolin-1-one | Combi-Blocks | [552330-86-6] | Pink solid reagent |
| 2-formylimidazole | Combi-Blocks | [10111-08-7 ] | Off-white solid reagent |
| Imidazole-4-carbaldehyde | ArkPharm | [3034-50-2] | Solid reagent |
| 1-H-pyrazole-4-carbaldehyde | Oakwood Chemicals | [35344-95-7] | Solid reagent |
| 1-H-pyrazole-5-carbaldehyde | Matrix Scientific | [3920-50-1] | Solid reagent |
| Solid KOH Pellets | BeanTown Chemicals | [1310-58-3] | White solid pellets |
| Siliflash Silica Gel | Scilicycle | R12030B | Fine white powder |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (x10) | Growcells | MRGF-6235 | Colorless translucent liquid |
| Beckman Coulter DU-800 UV/Vis Spectrophotometer and Software | Beckman Coulter | N/A | Spectroscopy Instrument and Software |
| Fluoromax-4 Spectrofluorometer | Horiba Scientific | N/A | Spectroscopy Instrument |
| FluorEssence Fluoremetry Software V3.5 | Horiba Scientific | N/A | Spectroscopy Software |
| Finnpipette II Micropipette (sizes: 100-1,000, 20-200, and 0.5-10 µL) | Fischerbrand | N/A | Equipment |
| Wilmad-LabGlass Rotary Evaporator (Model: WG-EV311-V-PLUS) | SP Scienceware | N/A | Equipment |
| DuoSeal Vacuum Pump (Model Number: 1405) | Welch | N/A | Equipment |
| GraphPad Prism 4 | GraphPad | N/A | Data Analysis Software |
| SympHony pH Meter (Model: Sb70P) | VWR | N/A | Equipment |
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