Summary
クレイゼン-シュミット凝縮反応はメチンブリッジ結合二環芳香族化合物の生成のための重要な方法論である。アルドール反応の塩基媒介バリアントを利用することにより、蛍光および/または生物学的に関連する分子の範囲は、一般的に安価で運用的に簡単な合成アプローチを通じてアクセスすることができます。
Abstract
メチンブリッジ結合二環芳香族化合物は、ポルフィリン、ジピリノン、医薬品などの生物学的に関連する様々な分子の一般的な成分です。さらに、これらのシステムの回転を制限すると、3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]ピリミジン-3-1、キサントホグロー、ピロロインドリンジネジオン類似体、BODIPYアナログ、フェノールおよびイミダゾロン環で観察されるほど中程度の蛍光系が多い。本稿では、クラゼン・シュミット凝縮を行い、一連の蛍光pH依存性ピラゾール/イミダゾール/イソインドロロンジピリノン類似体を生成する安価で運用上簡単な方法を説明しています。方法論はジピリロン類似体の合成を示すが、それは結合二環芳香族化合物の広い範囲を生成するために翻訳することができる。この方法で利用されるClaisen-Schmidt縮合反応は、塩基性条件下で起用される求核物質および求電子物(求核成分)および非溶化性アルデヒド(電子親水成分)に限定される。さらに、求核反応物質と求水反応物質の両方は、誤って水酸化物と反応しない官能基を含んでいる必要があります。これらの制限にもかかわらず、この方法論は、生物学的または分子プローブとして使用することができる完全に新しいシステムへのアクセスを提供します。
Introduction
2つの芳香環がモノメチン橋で連結される多くの共役二環系は、結合回転を介して異性化を受け、光子(図1A)1、2、3、4、5で励起した場合である。励起された異性体は、一般的に非放射減衰プロセス6を通じて地盤状態に緩和する。ボンド回転に対するエネルギーバリアが十分に大きくなると、光異性化を制限または防止することができる。その代わりに、フォトニック励起は、非放射減衰ではなく蛍光を介してリラックスすることが多い励起された一重の状態をもたらす(図1B)。光異性化の抑制は、共有結合によって2つの芳香環系をテザリングして結合回転を機械的に制限することによって最も一般的に達成され、それによって分子を特定の異性体状態にロックする。このアプローチは、次のようないくつかの異なる蛍光三環式ジピリノンおよびジピロールメタンアナログを作成するために利用されてきた:3H,5H-ジピロロ[1,2-c:2',1'f]ピリミジン-3-1(1),キサント ホグロース(2)6、7、ピロロインドリンジインジオンアナログ(3)8、およびBODIPYアナログ9(4、図2)によりピロリジンおよび/またはピロールリングシステムがメチレン、カルボニル、カルボニルとつながれている、 またはホウ素ジフルオロリンカー。通常、1~4 は ΦF > 0.7 を所有しており、これらのシステムはフルオロフォアユニットとして非常に効率的であることを示唆しています。
また、環系を共有結合する以外の手段により光異性化を制限することも可能である。例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)のフェノールおよびイミダゾリノンリング(図2)は、タンパク質環境による回転に制限されています。制限的な設定は自由解10の同じ発火単位と比較して量子収率を3桁増加させる。GFPのタンパク質足場は、立体及び静電効果11を通じて回転バリアを提供すると考えられている。最近、ネバダ大学のOdohグループと共同で、リノはジピリノー系のキサントホロー系と構造的類似性を持つ別のフルオロフォア系を発見した(図2)12。しかし、これらのジピロン類似体は、共有結合ではなく分子内水素結合という点でキサントホロー系とは異なり、光異性化を抑止し、蛍光二環系をもたらす。さらに、ピラゾール、イミダゾール、およびイソインドロネジピロン類似体は、プロトン化および脱プロトン化された状態で水素結合することができる。デプロトネーションは、励起波長と発光波長の両方の赤ずれをもたらし、システムの電子的性質の変化による可能性が高い。水素結合は、13、14、15、16の制限された回転を経ても量子収率を増加させると報告されているが、分子のプロトン化および分解状態の両方で制限異性化が蛍光のモードとなる他の蛍光系は認識していない。したがって、これらのpH依存性ジピロンフルオロフォアは、その点でユニークである。
このビデオでは、蛍光ジピロンアナログシリーズの合成と化学特性に焦点を当てています。特に、一連の蛍光アナログを完全に構築するために使用されたクラゼン・シュミット凝縮方法論に重点が置かれています。この反応は、アルデヒド基を攻撃する塩基媒介性ビニノラスエノール酸イオンの生成に依存し、その後、排除を受けるアルコールを生成する。ジピリノーンアナログシリーズの場合、ピロリニオン/イソインドロンは、ピラゾールまたはイミダゾールリングに付着したアルデヒド群への攻撃を容易にするためにエノレートに変換される(図3);除去後、メチン橋によって連結された完全結合二環系が形成される。ジピリロンアナログのシリーズ全体は、容易に入手可能な市販材料から構築することができ、一般的に中程度から高い収率(収率は約50〜95%)で単一のワンポット反応シーケンスで製造することができることは注目に値します。ジピリニオンアナログの大部分は、本質的に結晶性が高いため、分析的に純粋なサンプルを生成するために標準的なワークアップ条件以外の精製はほとんど必要ありません。したがって、このフルオロフォアシステムは、容易に入手可能な市販材料からアクセスするためにわずかなステップしか必要とされず、比較的短い時間枠での分析または生物学的研究のために合成、精製、および調製することができる。
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Protocol
1. ジピリニロンアナログの合成のための一般的な手順 16-25
- ピロリノール/イソインドロン(1.00ミリモル)とそれに対応するピラゾール/イミダゾールアルデヒド(1.00 mmol)を丸底フラスコで5.0mLのエタノールに溶かします。
- 水性KOH(24.0 mmol,10 M,2.40 mL)をフラスコに1つの部分に加えます。
- 反応が完了するまで攪拌還流し、反応が確認されるまで(反応時間のリストについては 表1参照)。ジクロロメタン中の10%メタノールのTLC溶出液が使用され、アナログは0.62〜0.86の範囲内または周囲のRf 値を有することが観察されている。十分な量の真空グリースを塗布するか、ガラスジョイントの相間にPTFEスリーブを使用して、凝縮器のガラスと丸底フラスコが高温と基本条件下で押収されるのを防ぎます。
- 反応混合物を室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターを使用して減圧下で揮発性物質を蒸発させます。
- 氷浴を用いて反応混合物を0°Cに冷却する。
- 酢酸(30.0 mmol、1.70 mL)を1つの部分に加えて残りの油性混合物を中和する。
- 真空濾過を使用して得られた製品材料を精製する (ステップ 2a、化合物: 17、18、20-22、24 および 25)を使用するか (ステップ 2bを参照してください: 化合物: 16、19、および 23)。
2. 手続き浄化
- 真空ろ過
- 装着されたゴム製アダプターを使用して、ヒルシュ漏斗をサイドアームフラスコに取り付けます。
- 丸いろ紙をヒルシュ漏斗に塗布し、脱イオン水を使用して軽く濡らして漏斗を付着させます。
- フラスコのサイドアームに真空源を接続し、真空中にガラス製品を引き離す必要がないことを確認して、十分な真空シールがあることを確認します。
- 結晶化した製品を含むフラスコを真空フィルターの上に注ぎ、濾過できるようにします。10 mLの氷冷脱イオン水で結晶をすすいでください。
- すべての液体のろ過に続いて、真空源に接続したまま、濾過された結晶がフィルターペーパーの上で乾燥し続けることを可能にする。
- ろ過した結晶を集め、25 mLの丸底フラスコに入れる。
- 丸底フラスコを、フリット付きグランドガラスジョイント/真空ラインアダプタに取り付けます。ガラスジョイントユニオンをケッククリップで固定します。
- ガラス高真空ラインアダプターのリブ付きエンドに、高真空ポンプにルーティングされる真空ラインを取り付け、真空トラップ(液体窒素やドライアイス/アセトンなどの冷却剤を使用)を適切に冷却して、結晶材料から蒸発する可能性のある揮発性物質を凝縮します。高真空ポンプをオンにして、残りの溶媒を結晶から完全に蒸発させます。
- 結晶を高真空下で1時間以上乾燥させます。真空ライン/アダプターから丸底フラスコを取り外し、高真空ポンプをオフにして、真空トラップを清掃します。
-
カラムクロマトグラフィーによる手順精製
- 酢酸処理反応混合物の内容物(ステップ1.6から)を10mLの脱イオン水で希釈し、セパレーター漏斗に移します。セパネルにジクロロメタン10mLを加えます。2つの層を分離するためにセパレーター漏斗を穏やかに振って通気します。
- ジクロロメタンの後続の部分(3 x 5 mL)を使用して水層を抽出します。無水Na2SO4を使用して有機分画と乾燥を組み合わせます。ロータリーエバポレーターを使用して減圧下ですべての揮発性物質をデカントし、除去します。
- 工程2.2.2から得られた残渣を希釈する。CH 2 Cl2の5 mLと。約75gのシリカゲルを用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーを行う。ジクロロメタン中に10%メタノールの溶液でサンプルを溶出させます。
- ロータリーエバポレーターを使用して減圧下で回収した溶媒の分量を除去します。約10 mLのCH 2Cl2を用いて、固体残渣を25mL丸底フラスコに移す。ロータリーエバポレーターを使用して減圧下で溶媒を除去します。
- 手順 2.1.7 ~ 2.1.9 で前述したように、残りの固体残渣を高真空で乾燥させます。
3. モル吸収吸収の取得とUV/VispKアナログ のための研究 16-25
- アナログ 16-25のUV/Vis分光光測定用の複合ストックソリューションを作成します。
- 選択したジピロンアナログ(16-25)の10μmolを計量し、10 mLの体積フラスコに加えます。
- DMSOを体積フラスコの10.0 mLマークに追加します。
注:化合物が完全に溶解しない場合は、ヒートガンを使用してフラスコを加熱し、化合物を完全に溶解するために必要に応じてフラスコを攪拌します。
- リン酸緩衝生理食塩(PBS)溶液を様々なpHレベルで作ります。アナログは、pHの範囲が約4〜15のPBSバッファーで特徴付けられていた。
- 1 L体積円筒を使用して、100 mLのPBS(x100)を900mLの脱イオン水に希釈して、PBSストック溶液を1Lで作ります。
- 調製したPBSストック溶液(ステップ3.2.1)50mLを100 mLビーカーに移し、磁気攪拌棒を加えます。次に、較正されたpHメーターを使用してpHの変化を監視し、水性1.0 M NaOH(pH>7.0でバッファを得る)または1.0 M HCl(pH<7.0でバッファを得る)のいずれかでPBSバッファを滴定します。
注: 明確に定義された滴定曲線をもたらすデータを取得するには、予想される変曲点の± 0.5 以内に 0.1 pH 単位単位の pH バッファーを生成し、予想される変曲点の外側の 0.5 単位を生成することをお勧めします。
- PBS(pH 7.0)および1.0 M NaOH(pH 14.0)溶液でアナログ 16-25 のモル吸収スペクトルを取得します。
- クリーンで乾燥したクオーツキュベットを使用して「ブランク」を準備し、100- 1000 μLマイクロピペットを使用して、PBSストック溶液(pH 7.0)または水性1.0 M NaOHのいずれかをキュベットに追加します。
注:キュベット溶液に気泡がないことを確認し、キュベットの外側のほこりや破片に起因する光の散乱を防ぐために、キュベットの側面をキムワイプで徹底的に拭き取ることは、ブランクソリューションデータ取得プロセスの完全性にとって重要です。泡が持続する場合は、硬い表面に置かれたペーパータオルのキュベットを軽く繰り返しタップします。 - UV/Vis分光光度計を使用して、選択した溶液を200~800 nmの範囲でブランクにします。
- 2番目のクリーンで乾燥したクオーツキュベットに、PBS(pH 7.0)または1.0 M NaOH(pH 14)の2.00 mLに加え、その後にジピリノンアナログ(16-25)の10 μLを5〜50 μLピペットでストック溶液(ステップ3.1を参照)を加えます。キュベットにキャップを置き、キュベットを反転させることに加えてよく振ります。
注:キュベット溶液に気泡がないことを確認し、キュベットの外側のほこりや破片に起因する光の散乱を防ぐために、キュベットの側面をキムワイプで徹底的に拭き取ることは、サンプルソリューションデータ取得プロセスの完全性にとって重要です。泡が持続する場合は、硬い表面に置かれたペーパータオルのキュベットを軽く繰り返しタップします。 - UV/Vis分光光度計を使用して、200-800 nmの範囲のジピリニオンアナログ溶液の吸収スペクトルを取得します。
- 同じキュベットに、ジピロンアナログストック溶液を10μL追加し、ステップ3.3.3と3.3.4を繰り返します。
- ステップ3.3.5を繰り返して、少なくとも5つの励起波長データポイントを取得するために、合計50μLのジピリロンアナログストック溶液がキュベットに追加されます。16 - 25 のすべてのストック溶液がPBS(pH 7.0)と1.0 M NaOHの両方で得られるまで、ステップ3.3.1-3.3.6を繰り返します。
- クリーンで乾燥したクオーツキュベットを使用して「ブランク」を準備し、100- 1000 μLマイクロピペットを使用して、PBSストック溶液(pH 7.0)または水性1.0 M NaOHのいずれかをキュベットに追加します。
- ベストフィット線形回帰分析を使用して、PBS(pH 7.0)で 16~25、1.0 M NaOHのモル吸合率値を取得します。
- GraphPad Prism 7 などのグラフプログラムを使用して、測定された吸光度(y軸)をジピリロンアナログ濃度(x軸)に対してプロットします。5 つのプロットされた点に対して、最適な線形回帰分析を作成します。線形関係を観察し、統計分析はR2 値≥0.98を示す必要があります。
- PBS(pH 7.0)および1.0 M NaOHのアナログ 16~25 に対して、ステップ3.4.1を繰り返します。
- PBS(pH 7.0)の 16~25 のモル吸収率と、最良適合線形曲線からの外挿された傾斜角値を使用して1.0 M NaOHを計算します。
- UV/Vis 分光光度法を 使用して pK の値 を 16 ~ 25 の分析結果を決定する
- クリーンで乾燥したクオーツキュベットに、100 ~1000 μL マイクロピペットを使用して、選択したpHレベル(ステップ3.2で作成)でPBSバッファーの1,900 μLを転送します。
注:私たちは、いくつかのバッファに白い沈殿物が形成される可能性があることにストレージを使用して気づきました。バッファーが完全に均質であり、沈殿物が見える場合は、重力濾過を使用して、使用直前に任意の沈殿物を除去します。ステップ 3.3.1 以降の注を参照してください。 - UV/Vis分光光度計を使用して、選択したPBS緩衝液を200~800 nmの範囲にブランクします。
- 2番目のクリーンで乾燥したクオーツキュベットに、選択したPBSバッファーの1,900 μLを移し、5-50 μLマイクロピペットを使用して、選択したアナログストック溶液の100 μLを加えます。キュベットにキャップを置き、キュベットを反転させることに加えてよく振ります。
注: ステップ 3.3.3 以降の前の注を参照してください。 - UV/Vis分光光度計を使用して、200〜800nmの範囲のジピリニオンアナログの吸収スペクトルを取得します。
- ステップ 3.2 で生成された PBS バッファーのそれぞれで 、16 ~ 25 のステップ 3.5.1 ~ 3.5.4 を繰り返します。
- クリーンで乾燥したクオーツキュベットに、100 ~1000 μL マイクロピペットを使用して、選択したpHレベル(ステップ3.2で作成)でPBSバッファーの1,900 μLを転送します。
- ベストフィットシグモイド曲線フィッティング関数を 使用して 、16~25 のpK値を決定します。
- グラフプログラムを使用して、測定された吸光度対波長(nm)を 16~25 の様々なpHレベルでグラフ化する。
- 380-415 nmの間で、低いpHレベル(<7.0)の吸光度が小さく(0-0.1単位)、より大きなpH(>12.0)の吸光度がかなり大きい(0.8-1.0単位)の波長を選択してください。選択した波長とpHの吸光度をプロットします。
- シグモイド曲線関数を使用して、各アナログ 16〜25に対して最適なフィット曲線を生成する。曲線の半分の高さで外挿された pH を報告します。これは、報告された pK値です 。
量子収量獲得と蛍光研究
- ジピリロンアナログ 16 - 18 と 20 - 25のための蛍光研究ストックソリューションを作成します。
- ステップ3.1で作成したジピリノンアナログストック溶液を用いて、2〜20μLマイクロピペットを使用して1mL体積フラスコにストック液10μLを加えて、1mLマークにPBS(pH 7.0)バッファーを加えて、ストック液の希釈を行います。ボリュームフラスコにキャップを置き、フラスコを反転させて振ってよく混ぜます。この希釈ストック溶液は、蛍光スペクトルを生成するために使用され、蛍光ストック溶液と呼ばれます。
- アナログ 16 - 18 および20 - 25に対してステップ 4.1.1 を繰り返します。
- アナログ 16-18 および 20-25に対して、様々な濃度で蛍光発光スペクトルを取得する。 18以外のすべてのアナログについて、pH 7および14の溶液中の各アナログに対して、19.96、39.84、59.64、79.37、99.01 nMの濃度で5つのスペクトルを取得します。アナログ18の場合、49.75、99.01、147.8、196.1、および243.9 nMの濃度でpH 7の溶液中の5つのスペクトルを取得します。pH 14の溶液では、99.01、196.1、291.3、384.6、476.2 nMの濃度でアナログ18のための5つのスペクトルを取得します。
- 透明な四面クォーツキュベットに3.00 mLのPBS(pH 7.0)または1.0 NaOHを加え、100-1,000 μLマイクロピペットを3つの1,000 μL単位で加えます。
注: ステップ 3.3.1 以降の注を参照してください。 - フルオロメーターとフルオロメーターソフトウェアプログラムFluorEssenceを使用して、選択した溶液の発光スペクトルを取得し、これを溶液「ブランク」とラベル付けします。
- 同じキュベットに、0.5-10 μLマイクロピペットを使用して、選択したジピロンアナログ(Part 4.1)に6μLの蛍光ストック溶液を加えます。キャップをキュベットに置き、キュベットを反転させて軽く振ってよく混ぜます。
注: ステップ 3.3.3 以降の注を参照してください。 - フルオロメーターを用いて、λmax absを励起波長として使用して、選択した化合物溶液の発光スペクトルを取得する。励起強度は、励起波長を超えて15nmから始まる200nmの範囲にわたって測定した(通常、200nmの範囲は、蛍光強度がベースラインに戻るために必要である)。
- ステップ 4.2.3 ~ 4.2.4 を、合計 30 μL の蛍光ストック溶液をキュベットに添加するまで繰り返します。
- PBS(pH 7.0)および1.0 M NaOHのアナログ 16-25について、ステップ4.2.1~4.2.5 を繰り返します。
注:キュベット濃度はアナログ 18 のために変更され、データは、中性(プロトン化 18)溶液のための蛍光ストック溶液の5つの連続した10 μL増分を有するPBSの2.0 mLおよび基本(脱プロトナトリウム 18)溶液のための5つの20 μLの付加された化合物ストック溶液の2.0 μLの1.0 mLを使用して取得した。
- 透明な四面クォーツキュベットに3.00 mLのPBS(pH 7.0)または1.0 NaOHを加え、100-1,000 μLマイクロピペットを3つの1,000 μL単位で加えます。
- ウィリアムズ、A.T.らの方法を用いて量子収率を決定する
- スプレッドシートソフトウェアプログラム(すなわち、Microsoft Excel)を使用して、単一のディピリノンアナログ(PBS[pH 7.0]または1.0 M NaOHのいずれかで撮影)の発光スペクトルのデータ(発光強度データポイント)をさまざまな濃度レベルでインポートします。
- 「ブランク」溶液の発光スペクトルからデータポイントをインポートし(ステップ4.2.1 - 4.2.2)、発光強度データポイントから「ブランク」の発光強度データポイントを差し引き、対応する波長で、様々な濃度レベルで取得します。
- 「空白」補正された発光強度データポイントをグラフプログラム(GraphPad Prism 7 など)に転送し、発光対波長をプロットします。ジピリロンアナログの様々な濃度レベルで得られた各曲線の曲線の下の領域を計算します。
- ウィリアムズ、A.T.らによって概説された技術に従って、ジピリロンアナログの様々な濃度レベルのそれぞれについて外挿吸光度値を計算する。これは、計算されたモル吸収率の値(ベストフィット線形回帰分析からステップ3.4を参照)とステップ4.2.3-4.2.5で使用されるジピリロンアナログの各濃度を掛けることによって達成されます。
- GraphPad Prism 7 などのグラフプログラムを使用して、最大の発光値に対応する発光波長について、各濃度曲線(ステップ 4.3.4)の下の計算領域に対して、アナログの外挿吸光度(x軸)のプロットを作成します。r2 ≥ 0.96 との線形関係を観察する必要があります。
- 0.5 M H2SO4 (ΦF = 0.55)18のキニーネの 3.1-3.4 および 4.1-4.3.5 に類似した手順を実行し、エタノール中のアントラセーン (ΦF = 0.27)18,19に準じて標準データを取得します。
- 以下の式のステップ 4.3.5 および 4.3.6 から得られた外挿傾斜を使用して、PBS (pH 7.0) および 1.0 M NaOH の 16 ~ 25 の量子収率値を取得します。
Φx =Φst(グラード×/グラードst)(η 2x/η2st)
ここでΦstは標準の量子収率を表し、Φxは未知の量子収率を表し、グラードは最良の線形適合の傾きであり、ηは使用される溶媒の屈折率である(屈折率はη=1.36エタノール、η=1.35(0.5 MH2SO4)を用いて計算した)。 - キニーネとアントラセネについて得られたΦxの平均として、PBS(pH 7.0)で16-18および20-25の量子収率を報告する。
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Representative Results
Claisen-Schmidt 凝縮反応は、プロトコルセクションで説明したワンポット手順を用いてジピリノンアナログ(16-25、図4)へのアクセスを提供した(ステップ1参照)。アナログ16-25は、すべてピロリノン9、ブロモイソインドロン10、またはイソインドロネ11を1H-イミダゾール-2-カルボキシアルデヒド(12)で凝縮して生成したH-イミダゾール-5-カルボキサンアルデヒド(13),1H-ピラゾール-3-カルボキサンデヒド (14), または 1H-ピラゾール-4-カルボキサンデヒド (15);この組み合わせは、制御化合物を含む10種類の類似体を生成し、19は、分子内水素結合を形成することができない(表1)。反応時間は通常、24時間の還流を完了するために必要としたが、20の場合は6時間しか必要とされなかったが、一方、23および24は30時間および27時間のわずかに長い時間がそれぞれ必要であった。製品の収率は、表1に示すように、41%から96%の範囲で、これはジピリノンに対する類似の縮合反応の伝統的な傾向に従っています。化合物17、18、20 - 22、24および25は、その高結晶性の性質のために、すべて単純な真空ろ過方法によって精製された。 化合物16、19、および23のみが精製のために必要なクロマトグラフィーを必要とする。
化合物16~25の光物理学的性質は、プロトコルセクションのステップ3~4を行うことから得られた、表2に要約されている。pKは、各化合物について12から >13.5までの範囲の値を測定し、各ジピロンアナログを完全に脱プロトア化するのに十分な基本的条件が必要であることを示唆している。各化合物のプロトン化状態と脱プロトン化状態において異なる光物性のため、スペクトルは16-25の中性(pH 7.0 PBS)および基本(1.0 M NaOH)溶液を用いて取得した。中性pH(プロトン化状態)において、化合物16〜25は、324nmから365nmの範囲のλ最大腹筋を有し、これはすべて脱プロトン状態と比較して10〜37nmの青色シフトである。モル吸収量は15,000から30,000の範囲ですが、所定のアナログのプロトン化および分解された状態の間で実質的に逸脱しているようには見えない。アナログ19は検出可能な蛍光を示さなかったが、16-18および20-25は、基本的なpHで409 - 457 nmおよび443 - 482 nmの基本的なpHで409 - 457 nmの範囲のλmax emを有する発光を放出した。最大プロトン化/脱プロトン化吸光度波長のそれと同様の赤シフト傾向が発光波長にも観察されます。ΦFは、中性および基本的な水溶液の両方で0.01から0.30の範囲で、同等のキサントホローよりもかなり低く、 しかし、化合物16、20、および25は、ローダミンB(ΦF = 0.23)、20アクリジンオレンジ(ΦF = 0.36)、21ピロニンY(Φ F = 0.22)、20およびほとんどのシアニンダイシリーズ(典型的にはΦ= 0.12-0.28)のような頻繁に使用されるフルオロフォアの類似領域に落ちる。 22
ジピリノン類似体16~25は、いずれも融点分析、IR分光法、1HNMRおよび13CNMR分光法、および高分解能質量分析法を用いて化学的に特徴付け、UV/Visおよび蛍光分光法実験に加えて表2に要約した。化学特性評価と元の1H NMRおよび13C NMRスペクトルは、元の文献源から見つけることができますが、利便性のために、最大の量子収率を有する化合物16、20、および23の特性評価は以下に報告されています。
(Z)-5-(1H-イミダゾール-2-イチレン)-3-エチル-4-メチル-1,5-ジヒドロ-2H-ピロール-2-1(16)。 160°Cで分解します。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.3 (brs, 1H), 9.87 (s, 1H), 7.13 (アプリ, 2H), 5.93 (s, 1H), 2.23 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 2.00 (s, 3H), 0.98 (t J, 3H), Hz); 13C NMR (101 MHz, DMSO- d6) δ 170.7, 144.8, 140.0, 139.6, 133.9, 130.2, 117.6, 94.1, 16.7, 13.6, 9.33;IR (薄膜) 3742, 3148, 3063, 2924, 2353, 1651, 1543, 1450, 771, 717 cm-1;HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd for C11H13N3ONa 226.0956,226.0956 が見つかりました。
(Z)-5-(1H-ピラゾール-4-イチレン)-3-エチル-4-メチル-1,5-ジヒドロ-2H-ピロール-2-1(19)。202 °Cで分解します。1H NMR (400 MHz、 CDCl3の 20% CD3OD) δ 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d)δ 7.74 (s, 2H), 6.01 (s, 1H), 2.27 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 2.02 (s, 3H), 1.02 (s, 3H), 1.02 (s, 3H), 1.02 (s, 3H), 1.02 (s, 3H);13C{1H} NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173.7, 141.9, 136.0, 133.0, 116.1, 105.0, 100.8, 16.9, 13.4, 9.61;IR(薄膜)3163,3117,3048,2963,2362,1674,1558,1512,1396,1257,1157,948,871,794,702 cm-1;HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd for C11H13N3ONa 226.0956,226.0955 が見つかりました。
(Z)-3-(1H-イミダゾール-2-イチレン)-5-ブロモイソインドリン1-1(20)。 213 °Cで分解します。 1H NMR (400 MHz、DMSO-d6) δ 7.97 (s, 1H), 7.59 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.0, 1H), 7.06 (s, 2H), 6.57 (s, 1H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 167.7, 146.6, 140.2, 134.5, 131.7, 129.1, 125.8, 125.03, 124.99, 123.6, 96.5;IR (薄膜) 3742, 3240, 2314, 1682, 1543, 1520, 1435, 1312, 1080, 826, 694 cm-1;HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd for C12H8BrN3ONa 311.9749,311.9752 が見つかりました。
(Z)-3-(1H-イミダゾール-2-イリメレン)イソインドリン-1-1-1(23)。 228°Cで分解します。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.34 (s, 1H), 10.74 (s, 1H)、7.90(d、J = 7.5 Hz、1H)、7.74(d、J = 7.6 Hz、1H)、7.63(dd、J=7.6、7.2 Hz、1H)、7.50(dd、J = 7.6、7.3 Hz、1H)、7.17(s、1H)、6.46H) 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 167.3, 144.9, 137.3, 135.1, 132.8, 129.9, 129.3, 123.6, 121.0, 117.6, 92.9;IR (薄膜) 3741, 3201, 3086, 2361, 2322, 1682, 1543, 1520, 1119, 748, 687 cm-1;HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd for C12H9N3ONa 234.0643、234.0641 を発見しました。
| エントリ | ピロリニロン/イソインドロン | アルデヒド | 収量 (%)b | 時間 (h) | 積 |
| 1 | 9 | 12 | 80 | 24 | 16 |
| 2 | 9 | 13 | 41 | 24 | 17 |
| 3 | 9 | 14 | 79 | 24 | 18 |
| 4 | 9 | 15 | 61 | 24 | 19 |
| 5 | 10 | 12 | 96 | 6 | 20 |
| 6 | 10 | 13 | 70 | 24 | 21 |
| 7 | 10 | 14 | 66 | 24 | 22 |
| 8 | 11 | 12 | 49 | 30 | 23 |
| 9 | 11 | 13 | 49 | 27 | 24 |
| 10 | 11 | 14 | 94 | 24 | 25 |
表 1.16-25の合成のための条件と反応収量
EtOH の5 mLで1 mmolスケールで行われる反応。 b 孤立した収量。
| 化合物 | 腹筋λ最大 (nm) | ε (M-1 cm-1) | 蛍光。λ最大 (nm) | Φb | pKa |
| 16 | 351 (384) | 24500 (22800) | 451 (482) | 0.30 (0.30) | 12.7 |
| 17 | 338 (380) | 18600 (18600) | 442 (462) | 0.01 (0.03) | 12.8 |
| 18 | 324 (349) | 29800 (25700) | 455 (465) | 0.01 (0.02) | 13 |
| 19 | 326 (358) | 29900 (21300) | –a | –a | 12.9 |
| 20 | 365 (378) | 15000 (15500) | 457 (475) | 0.22 (0.20) | 12.5 |
| 21 | 355 (380) | 15100 (16800) | 409 (443) | 0.03 (0.01) | 12.9 |
| 22 | 341 (363) | 19800 (23100) | 427 (452) | 0.02 (0.01) | >13.5 |
| 23 | 360 (373) | 29000 (21300) | 449 (474) | 0.25 (0.26) | 12 |
| 24 | 351 (373) | 17200 (19400) | 432 (454) | 0.07 (0.05) | 12.8 |
| 25 | 340 (357) | 20200 (23500) | 410 (449) | 0.02 (0.02) | >13.5 |
表 2.pH 7.0 PBSバッファーおよび1 M NaOHにおける光物理特性およびpKa値は6-14および22(括弧内に示される)である。
蛍光は19で検出できませんでした。bキニーネ (Q = 0.55)15とアントラセーン (Q = 0.27)15,16が標準として使用されました。
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図2:この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
Claisen-Schmidt 凝縮アプローチは、ピラゾール、イミダゾール、イソインドロロンジピリノンフルオロフォアを比較的操作的に単純化したプロトコルを介して生成するかなり堅牢な方法を提供します。蛍光ジピロンアナログの合成がこの研究の焦点であったが、同様の条件はジピリノン23、24、25およびピロールフラン付加物のような他の二環性メチン結合リング系にアクセスするために適用することができることに留意すべきである26だけでなく、3H-ピラゾール-3-ワンフラン付加管27、イソインドロンピロール付加体28、および2 H -Indol-2-1-ピリンジン付加体29は潜在的な医薬品としての約束を保持する。一般に、説明した手順は中程度から高い収率で反応生成物を提供するが、反応の進行の継続的なモニタリングは成功の結果のために不可欠であることに注意することが重要である。我々の予備試験の中には、過剰な反応時間の加熱が、反応の完了を大きく超えて(5-24時間)、その後の精製工程を複雑にする分解生成物につながったことが判明した。このため、TLC分析は、1時間、3時間、6時間、12時間、24時間のタイムマークで行い、反応の進行を監視し、反応速度の感覚を得るとともに、生成物分解速度を得ることを強く推奨します。
ジピリニオンアナログ16~25は、プロトン化/中性状態において、一般的に使用される有機溶媒の溶解性の範囲を有し、光物理学、生物学的、および分析特性を研究する際に問題となり得る。一般に、16~25は水、アルコール系溶剤(メタノール/エタノール)、CH2Cl2に対する溶解度が変化していたが、いずれもDMF、DMSO、アセトニトリルなどの極性不プロトニア系溶媒に対する溶解性が良好であった。 その結果、UV/Vis(プロトコルのステップ3.1)および蛍光試験(プロトコルのステップ4.1)およびほとんどのNMR試験のためのすべてのストックソリューションは、DMSOまたはDMSO-d6を使用して行われました。ほとんどの化合物は、DMSOで完全に可溶化するために穏やかな加熱(ヒートガンを使用)を必要としましたが、一度溶解すると、16-25は可溶性のままで、沈殿することなく水溶液中で希釈することさえできます。イオン状態の極性が高いため、塩基性溶液中のアナログ16~25は水溶性が高いが、有機溶媒への溶解性は少ない。
Claisen-Schmidt 凝縮反応は、メチン結合二環芳香族化合物の範囲へのアクセスを提供するが、ジピリノン類似体を超えて、この方法を通じて生成される分子の種類を制限することができる。反応の基本的な要件として、共に、発知可能な求核剤(ピロリノンまたはイソインドロンなど)と非生起性アルデヒドの両方が反応して結露を可能にする必要があります。この基本的な要件を満たさないと、リングシステムや競合するサイド製品の生成を相互にリンクできなくなる可能性があります。また、エキノール酸求核剤を生成する際には、水酸化物との反応を受けやすい機能基(エステル、ニトリル、ハロゲン化物など)との非互換性を生じさせる可能性のある、かなり基本的な条件が用いられています。このような場合、水酸化物を窒素塩基または炭酸塩で置換することが可能であり、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデ-7-エネ(DBU)30、トリエチルアミン31、ピプリジン32、ヒュニッヒ基底33、およびNa2CO334で達成されたように。類似の反応を行うために、我々は単にその可用性と相対的な費用のために水酸化ナトリウムを使用することを選択しました。これらの制約は、特定の化合物にアクセスしたり、他の化合物へのアクセスを完全に防ぐために手順を変更する必要があるかもしれませんが、プロトコルで概説されている方法は、手続き的に簡単で費用対効果の高い単一ステップ反応を通じて、多数のシステムに芳香環を結合する手段を提供することができます。ジピリノン類似体16~25の場合、クレイゼン・シュミット凝縮は、これまでに記載されたpH依存性フルオロフォアへの最もアクセスしやすい経路の1つを可能にした。
Claisen-Schmidt 凝縮反応は、異なる二環系および三環式フルオロフォア系の範囲を作り出す重要な反応となる可能性を有する。この反応は3H,5H-ジピロロ[1,2-c:2',1'f]ピリミジン-3-1(1)、キサントホロー(2)、ピロロインドリンジネジの開発に不可欠であったが 1つのアナログ(3、図1)、および最近ではジピリノンアナログ16-25は、クラゼン・シュミット凝縮と分子設計を組み合わせることで、光異性体のプロセスを制限することによって、完全に新しい蛍光系の範囲を生成することが可能である。今回の研究に特化して、ジピロンアナログの将来の設計は、より強い分子内水素結合能力と低いpK値を有する蛍光化合物を生成するために、この概説された手順を使用して開発される可能性が高い。これらの強化されたpH依存プローブは、より広い範囲の細胞内事象に対するpH変動の視覚化を可能にしながら、より高い量子収量を有すると予想される。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
Z.R.W.とN..B.は、NIH(2P20 GM103440-14A1)の寛大な資金に感謝し、ユングジェ・コーとネバダ大学ラスベガスは 1Hと 13C NMRの買収を支援しました。さらに、NSCビジュアルメディアの学生、アーノルド・プラセンシア=フローレス、オーブリー・ジェイコブス、アリスター・クーパーの皆さんに、この原稿の撮影部分の撮影とアニメーションのプロセスに協力してくださったことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-ethyl-4-methyl-3-pyrrolin-2-one | Combi-Blocks | [766-36-9] | Yellow solid reagent |
| isoindolin-1-one | ArkPharm | [480-91-1] | Off-white solid reagent |
| 5-bromoisoindolin-1-one | Combi-Blocks | [552330-86-6] | Pink solid reagent |
| 2-formylimidazole | Combi-Blocks | [10111-08-7 ] | Off-white solid reagent |
| Imidazole-4-carbaldehyde | ArkPharm | [3034-50-2] | Solid reagent |
| 1-H-pyrazole-4-carbaldehyde | Oakwood Chemicals | [35344-95-7] | Solid reagent |
| 1-H-pyrazole-5-carbaldehyde | Matrix Scientific | [3920-50-1] | Solid reagent |
| Solid KOH Pellets | BeanTown Chemicals | [1310-58-3] | White solid pellets |
| Siliflash Silica Gel | Scilicycle | R12030B | Fine white powder |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (x10) | Growcells | MRGF-6235 | Colorless translucent liquid |
| Beckman Coulter DU-800 UV/Vis Spectrophotometer and Software | Beckman Coulter | N/A | Spectroscopy Instrument and Software |
| Fluoromax-4 Spectrofluorometer | Horiba Scientific | N/A | Spectroscopy Instrument |
| FluorEssence Fluoremetry Software V3.5 | Horiba Scientific | N/A | Spectroscopy Software |
| Finnpipette II Micropipette (sizes: 100-1,000, 20-200, and 0.5-10 µL) | Fischerbrand | N/A | Equipment |
| Wilmad-LabGlass Rotary Evaporator (Model: WG-EV311-V-PLUS) | SP Scienceware | N/A | Equipment |
| DuoSeal Vacuum Pump (Model Number: 1405) | Welch | N/A | Equipment |
| GraphPad Prism 4 | GraphPad | N/A | Data Analysis Software |
| SympHony pH Meter (Model: Sb70P) | VWR | N/A | Equipment |
References
- Abbandonato, G., et al. Cis-trans photoisomerization properties of GFP chromophore analogs. European Biophysics Journal. 40 (11), 1205-1214 (2011).
- Funakoshi, H., et al. Spectroscopic studies on merocyanine photoisomers. IV. Catalytic isomerization of photoisomers of merocyanine derivatives in protic solvents. Nippon Kagaku Kaishi. (9), 1516-1522 (1989).
- Puzicha, G., Shrout, D. P., Lightner, D. A. Synthesis and properties of homomologated and contracted dipyrrinone analogs of xanthobilirubic acid. Journal of Heterocyclic Chemistry. 27 (7), 2117-2123 (1990).
- Bonnett, R., Hamzetash, D., Asuncion Valles, M. Propentdyopents [5-(2-oxo-2H-pyrrol-5-ylmethylene)pyrrol-2(5H)-ones] and related compounds. Part 2. The Z E photoisomerization of pyrromethenone systems. Journal of the Chemical Society, Perkins Transactions. 1 (6), 1383-1388 (1987).
- Tikhomirova, K., Anisimov, A., Khoroshutin, A. Biscyclohexane-Annulated Diethyl Dipyrrindicarboxylates: Observation of a Dipyrrin Form with Absent Visible Absorption. European Journal of Organic Chemistry. 2012 (11), 2201-2207 (2012).
- Brower, J. O., Lightner, D. A. Synthesis and spectroscopic properties of a new class of strongly fluorescent dipyrrinones. Journal of Organic Chemistry. 67 (8), 2713-2716 (2002).
- Woydziak, Z. R., Boiadjiev, S. E., Norona, W. S., McDonagh, A. F., Lightner, D. A. Synthesis and Hepatic Transport of Strongly Fluorescent Cholephilic Dipyrrinones. Journal of Organic Chemistry. 70 (21), 8417-8423 (2005).
- Jarvis, T., et al. Pyrrole β-amides: Synthesis and characterization of a dipyrrinone carboxylic acid and an N-Confused fluorescent dipyrrinone. Tetrahedron. 74 (14), 1698-1704 (2018).
- Bodio, E., Denat, F., Goze, C. BODIPYS and aza-BODIPY derivatives as promising fluorophores for in vivo molecular imaging and theranostic applications. Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. 23, 1159-1183 (2019).
- Acharya, A., et al. Photoinduced Chemistry in Fluorescent Proteins: Curse or Blessing. Chemical Reviews. 117 (2), 758-795 (2017).
- Romei, M. G., Lin, C. -Y., Mathews, I. I., Boxer, S. G. Electrostatic control of photoisomerization pathways in proteins. Science. 367 (6473), 76-79 (2020).
- Benson, N., Suleiman, O., Odoh, S. O., Woydziak, Z. Ryrazole, Imidazole, and Isoindolone Dipyrrinone Analogues: pH-Dependent Fluorophores That Red-Shift Emission Frequencies in a Basic Solution. Journal of Organic Chemistry. 84 (18), 11856-11862 (2019).
- Xie, P., Gao, G., Liu, J., Jin, Q., Yang, G. A New Turn on Fluorescent Probe for Selective Detection of Cysteine/Homocysteine. Journal of Fluorescence. 25 (5), 1315-1321 (2015).
- Alty, I. G., et al. Intramolecular Hydrogen-Bonding Effects on the Fluorescence of PRODAN Derivatives. Journal of Physical Chemistry A. 120 (20), 3518-3523 (2016).
- Yang, Y., Li, D., Li, C., Liu, Y. F., Jiang, K. Hydrogen bond strengthening induces fluorescence quenching of PRODAN derivative by turning on twisted intramolecular charge transfer. Spectrochimica Acta, Part A. 187, 68-74 (2017).
- Zhang, L., Liu, J., Gao, J., Zhang, F., Ding, L. High solid fluorescence of a pyrazoline derivative through hydrogen bonding. Molecules. 22 (8), 1 (2017).
- Williams, A. T. R., Winfield, S. A., Miller, J. N. Relative fluorescence quantum yields using a computer-controlled luminescence spectrometer. Analyst. 108 (1290), 1067-1071 (1983).
- Eaton, D. F. Reference materials for fluorescence measurement. Pure and Applied Chemistry. 60 (7), 1107-1114 (1988).
- Dawson, W. R., Windsor, M. W.
- Zhang, X. -F., Zhang, J., Lu, X. The Fluorescence Properties of Three Rhodamine Dye Analogues: Acridine Red, Pyronin Y and Pyronin B. Journal of Fluorescence. 25 (4), 1151-1158 (2015).
- Zanker, V., Rammensee, H., Haibach, T. Measurements of the relative quantum yields of the fluorescence of acridine and fluorescein dyes. Zeitschrift für Angewandte Physik. 10, 357-361 (1958).
- Mujumdar, R. B., Ernst, L. A., Mujumdar, S. R., Lewis, C. J., Waggoner, A. S. Cyanine dye labeling reagents: Sulfoindocyanine succinimidyl esters. Bioconjugate Chemistry. 4 (2), 105-111 (1993).
- Battersby, A. R., Dutton, C. J., Fookes, C. J. R. Synthetic studies relevant to biosynthetic research on vitamin B12. Part 7. Synthesis of (±)-bonellin dimethyl ester. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions. 1 (6), 1569-1576 (1988).
- Pfeiffer, W. P., Lightner, D. A.
- Huggins, M. T., Musto, C., Munro, L., Catalano, V. J. Molecular recognition studies with a simple dipyrrinone. Tetrahedron. 63 (52), 12994-12999 (2007).
- Groselj, U., et al. Synthesis of Spiro-δ2-Pyrrolin-4-One Pseudo Enantiomers via an Organocatalyzed Sulfa-Michael/Aldol Domino Sequence. Advanced Synthesis & Catalyst. 361 (22), 5118-5126 (2019).
- El-Shwiniy, W. H., Shehab, W. S., Mohamed, S. F., Ibrahium, H. G. Synthesis and cytotoxic evaluation of some substituted pyrazole zirconium(IV) complexes and their biological assay. Applied Organometallic Chemistry. 32 (10), (2018).
- Murray, L., O'Farrell, A. -M., Abrams, T. Preparation of indolinone compounds for treatment of excessive osteolysis. US Patent. , US20040209937A1 (2004).
- Lozinskaya, N. A., et al. Synthesis and biological evaluation of 3-substituted 2-oxindole derivatives as new glycogen synthase kinase 3β inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 27 (9), 1804-1817 (2019).
- Montforts, F. P., Schwartz, U. M.
- Uddin, M. I., Thirumalairajan, S., Crawford, S. M., Cameron, T. S., Thompson, A. Improved synthetic route to C-ring ester-functionalized prodigiosenes. Synlett. (17), 2561-2564 (2010).
- Brower, J. O., Lightner, D. A., McDonagh, A. F. Aromatic congeners of bilirubin: synthesis, stereochemistry, glucuronidation and hepatic transport. Tetrahedron. 57 (37), 7813-7827 (2001).
- Clift, M. D., Thomson, R. J. Development of a Merged Conjugate Addition/Oxidative Coupling Sequence. Application to the Enantioselective Total Synthesis of Metacycloprodigiosin and Prodigiosin R1. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14579-14583 (2009).
- Brower, J. O., Lightner, D. A., McDonagh, A. F. Synthesis of a New Lipophilic Bilirubin. Conformation, Transhepatic Transport and Glucuronidation. Tetrahedron. 56 (40), 7869-7883 (2000).
