Summary
We beschrijven de productie van gemengde culturen van astrocyten en oligodendrocytenvoorlopercellen afgeleid van foetale of volwassen neurale stamcellen die differentiëren in volwassen oligodendrocyten, en in vitro modellering van schadelijke stimuli. De koppeling met een celgebaseerde high-content screeningtechniek bouwt een betrouwbaar en robuust screeningsysteem voor geneesmiddelen op.
Abstract
De belangrijkste hindernis bij het ontwikkelen van screeningstechnieken voor geneesmiddelen voor het beoordelen van de werkzaamheid van therapeutische strategieën bij complexe ziekten is het vinden van een evenwicht tussen in vitro vereenvoudiging en het opnieuw creëren van de complexe in vivo omgeving, samen met het belangrijkste doel, gedeeld door alle screeningstrategieën, het verkrijgen van robuuste en betrouwbare gegevens, zeer voorspellend voor in vivo vertaling.
Op het gebied van demyeliniserende ziekten zijn de meeste screeningstrategieën voor geneesmiddelen gebaseerd op onsterfelijke cellijnen of zuivere culturen van geïsoleerde primaire oligodendrocytenvoorlopercellen (OPC's) van pasgeboren dieren, wat leidt tot sterke vooroordelen als gevolg van het ontbreken van leeftijdsgerelateerde verschillen en van een echte pathologische aandoening of complexiteit.
Hier tonen we de opstelling van een in vitro systeem gericht op het modelleren van de fysiologische differentiatie / rijping van neurale stamcel (NSC) -afgeleide OPC's, gemakkelijk te manipuleren om pathologische aandoeningen na te bootsen die typerend zijn voor demyeliniserende ziekten. Bovendien omvat de methode isolatie van foetale en volwassen hersenen, waardoor een systeem ontstaat dat dynamisch differentieert van OPC's naar volwassen oligodendrocyten (OK's) in een spontane co-cultuur die ook astrocyten omvat. Dit model lijkt fysiologisch op het schildklierhormoon-gemedieerde myelinisatie- en myelineherstelproces, waardoor pathologische interferents kunnen worden toegevoegd die ziektemechanismen modelleren. We laten zien hoe we de twee belangrijkste componenten van demyeliniserende ziekten (d.w.z. hypoxie / ischemie en ontsteking) kunnen nabootsen, hun effect op ontwikkelingsmyelinisatie en volwassen myelineherstel kunnen recreëren en rekening houden met alle celcomponenten van het systeem, terwijl we ons concentreren op het differentiëren van OPC's.
Dit spontane gemengde model, in combinatie met celgebaseerde screeningtechnologieën met een hoog gehalte, maakt de ontwikkeling mogelijk van een robuust en betrouwbaar screeningsysteem voor geneesmiddelen voor therapeutische strategieën gericht op het bestrijden van de pathologische processen die betrokken zijn bij demyelinisatie en het induceren van remyelinisatie.
Introduction
In het centrale zenuwstelsel (CZS) zijn myelinevormende cellen (oligodendrocyten, OK's) en hun voorlopers (oligodendrocytenvoorlopercellen, OPC's) verantwoordelijk voor ontwikkelingsmyelinisatie, een proces dat optreedt tijdens de peri- en postnatale periodes, en voor myeline-omzet en -herstel (remyelinisatie) op volwassen leeftijd1. Deze cellen zijn zeer gespecialiseerd en interageren anatomisch en functioneel met alle andere gliale en neuronale componenten, waardoor ze een fundamenteel onderdeel zijn van de structuur en functie van het CZS.
Demyeliniserende gebeurtenissen zijn betrokken bij verschillende CZS-verwondingen en -ziekten2en werken voornamelijk in op opc's en OK's door middel van multifactoriële mechanismen, zowel tijdens de ontwikkeling als tijdens de volwassenheid. De ongedifferentieerde voorlopers worden aangedreven door differentiërende factoren, voornamelijk schildklierhormoon (TH), in een gesynchroniseerd proces3 dat ertoe leidt dat de OPC specifieke stimuli herkent en erop reageert die proliferatie veroorzaken, migratie naar het niet-gemyeliniseerde axon en differentiatie in volwassen OK's die op hun beurt de myelineschede ontwikkelen4. Al deze processen worden fijn aangestuurd en vinden plaats in een complexe omgeving.
Vanwege de complexe aard van myelinisatie, remyelinisatie en demyelinisatiegebeurtenissen, is er een grote behoefte aan een vereenvoudigde en betrouwbare in vitro methode om de onderliggende mechanismen te bestuderen en nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen, gericht op de belangrijkste cellulaire speler: de OPC5.
Om een in vitro systeem betrouwbaar te laten zijn, moet rekening worden gehouden met een aantal factoren: de complexiteit van de cellulaire omgeving, leeftijdsgebonden celintrinsieke verschillen, fysiologische TH-gemedieerde differentiatie, pathologische mechanismen en de robuustheid van de gegevens6. Inderdaad, de onvervulde behoefte in het veld is een model dat de complexiteit van de in vivo toestand nabootst, niet met succes bereikt door het gebruik van geïsoleerde zuivere OPC-culturen. Bovendien hebben de twee belangrijkste componenten van demyeliniserende gebeurtenissen, ontsteking en hypoxie / ischemie (HI), direct betrekking op andere celcomponenten die indirect de fysiologische differentiatie en rijping van OPC's kunnen beïnvloeden, een aspect dat niet kan worden bestudeerd in overgesimplificeerde in vitro modellen.
Uitgaande van een sterk voorspellend cultuursysteem, is de volgende en meer algemene uitdaging de productie van robuuste en betrouwbare gegevens. In deze context is celgebaseerde high-content screening (HCS) de meest geschikte techniek7, omdat ons doel ten eerste is om de hele cultuur in een automatische workflow te analyseren, waarbij de vertekening van het kiezen van representatieve velden wordt vermeden, en ten tweede om de automatische en gelijktijdige generatie van op beeldvorming gebaseerde gegevens met een hoog gehalte te verkrijgen8.
Aangezien de belangrijkste behoefte is om de beste balans te bereiken tussen in vitro vereenvoudiging en in vivo-nabootsende complexiteit, presenteren we hier een zeer reproduceerbare methode voor het verkrijgen van OPC's afgeleid van neurale stamcellen (NSC's) geïsoleerd uit de foetale voorhersenen en de volwassen subventrikelzone (SVZ). Dit in vitro model omvat het gehele OPC-differentiatieproces, van multipotent NSC tot volwassen/myeliniserend OL, op een fysiologische TH-afhankelijke manier. De resulterende cultuur is een dynamisch differentiërend/rijpend systeem dat resulteert in een spontane co-cultuur die voornamelijk bestaat uit differentiërende OPC's en astrocyten, met een laag percentage neuronen. Deze primaire cultuur bootst de complexe in vivo omgeving beter na, terwijl de stamcelafleiding eenvoudige manipulaties mogelijk maakt om de gewenste cellijnverrijking te verkrijgen.
In tegenstelling tot andere screeningstrategieën voor geneesmiddelen met behulp van cellijnen of zuivere culturen van primaire OPC's, maakt de hier beschreven methode de studie mogelijk van het effect van pathologische interferenten of therapeutische moleculen in een complexe omgeving, zonder de focus op het gewenste celtype te verliezen. De beschreven HCS-workflow maakt een analyse van de levensvatbaarheid van cellen en afstammingsspecificaties mogelijk, evenals afstammingsspecifieke celdood en morfologische parameters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprotocollen die hierin worden beschreven, zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Raad van de Europese Gemeenschap (86/609/EEG) en voldoen aan de richtlijnen die zijn gepubliceerd in de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. Oplossingen en reagentia
- Bereid standaard medium voor: DMEM / F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg penicilline/streptomycine (1% p/s); 1x B27; 1x N-2.
- Neurosfeermedium bereiden: voeg 10 ng / ml bFGF toe; 10 ng/ml EFG naar standaardmedium.
- Oligosfeer/OPC-medium bereiden: voeg 10 ng/ml bFGF toe; 10 ng/ml PDGF-AA tot standaard medium.
- Oligodendroctye differentiatiemedium bereiden: voeg 50 nM T3 toe; 10 ng/ml CNTF; 1x N-acetyl-L-cysteïne (NAC) tot standaard medium.
- Bereid niet-enzymatische dissociatiebuffer voor: voeg 1% P/S toe aan de niet-enzymatische dissociatiebuffer en houd ijskoud.
- Bereid sucrose-oplossing: HBSS, 0,3 g/ml sucrose.
- BSA-wasoplossing bereiden: EBSS, 40 mg/ml BSA, 0,02 ml/l HEPES.
- Bereid enzymatische dissociatiebuffer voor: HBSS, 5,4 mg / ml D-glucose, 15 mmol / L HEPES, 1,33 mg / ml trypsine, 0, 7 mg / ml hyaluronidase, 80 U / ml DNase.
- Bereid cytokinemix voor: TGF-β1, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 en IFN-γ (elk 20 ng / ml).
- Cytokinemixmiddel bereiden: 0,04% van de voorraad (10% glycerol/100 nM glycine/25 nM Tris, pH 7,3).
- Bereid zuurstof-glucosedeprivatiemedium voor: standaardmedium met DMEM zonder glucose. Afhankelijk van de strengheid van de gewenste glucosedeprivatieconditie, is het mogelijk om ook B27 en / of N2 uit het medium te verwijderen om glucosegerelateerde verbindingen (bijv. D-Galactose in B27) te vermijden.
2. Dissectie en NSC isolatie
OPMERKING: Foetale en volwassen NSC's werden geïsoleerd uit E13,5 foetale voorhersenen of 2,5 maanden oude volwassen subventrikelzone (SVZ), volgens het Ahlenius- en Kokaia-protocol9 met wijzigingen.
- Foetale NSC-culturen
OPMERKING: Bereid voordat u met de dissecties begint, buisjes van 1,5 ml met elk 150 μL niet-enzymatische dissociatiebuffer; maak petrischaaltjes schoon en voeg ijskoude HBSS toe.- Verzamel de embryo's op E13.5 - 14.5 van getimede zwangere muizen en plaats ze in een petrischaal met koude HBSS.
- Onthoofd de embryo's met een tang.
- Plaats de hoofden van de embryo's in een schone petrischaal met ijskoude PBS en verwijder de huid van de schedel met een tang, met behulp van een vergrootglas of een stereoscoop.
- Zodra de hersenen zichtbaar zijn en van de huid zijn ontdaan, knijp je het uit door druk uit te oefenen aan de zijkanten met een tang.
- Verwijder het cerebellum, houd alleen de voorhersenen en verwijder de hersenvliezen met een tang.
- Plaats het geïsoleerde weefsel in de niet-enzymatische dissociatiebuffer en herhaal de dissectiestappen met de andere embryo's. Steek het weefsel van 2-3 dieren in elke buis met de buffer.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten onder continu schudden.
- Voeg na de incubatie 850 μL standaardmedium toe en meng door pipetteren totdat de suspensie vrij is van klonten.
- Als niet-gedissocieerd weefsel nog steeds zichtbaar is, wacht dan 2 minuten bij RT totdat het zich op de bodem van de buis afzet.
- Wanneer de dissociatie is voltooid, telt u de cellen en plaatst u ze in suspensie met een dichtheid van 10-50 cellen / μL in een T-25- of T-45-kolf met 10-30 ml neurosfeermedium, in een verticale positie gehouden om celadhesie te voorkomen.
-
Volwassen NSC-culturen
- Offer dieren door cervicale dislocatie.
- Verzamel hersenen van 4-5 muizen in een buis van 50 ml met ijskoude HBSS.
- Plaats de hersenen op een koud steriel oppervlak. Gebruik hiervoor een T-25 kolf gevuld met water en 's nachts op -20 °C geplaatst. Bedek op het moment van het experiment de kolf met steriele aluminiumfolie.
- Plaats de ventrale kant van de hersenen naar beneden, in rostro-caudale richting, en verwijder de reukbollen met een scheermesje.
- Snijd met een scheermesje 2-3 coronale plakjes van 1 mm dikte, van de cortex tot het optische chiasma.
- Plaats de plakjes op het koude oppervlak in een ventro-dorsale positie en identificeer het corpus callosum en de twee laterale ventrikels.
- Gebruik een vergrootglazen of een stereoscoop om de wanden van de laterale ventrikels te isoleren en zorg ervoor dat u geen stukjes van het corpus callosum draagt.
- Plaats het geïsoleerde weefsel in de enzymatische dissociatiebuffer (5-10 ml) en incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten.
- Meng de oplossing, pipetteer meerdere keren (minstens 50) en incubeer opnieuw bij 37 °C gedurende 10 minuten.
- Neutraliseer de trypsine door 5 ml standaard kweekmedium toe te voegen en filtreer de oplossing met een filter van 70 μm.
- Centrifugeer de gefilterde oplossing gedurende 5 minuten bij 400 x g.
- Resuspend de pellet in de sacharoseoplossing en centrifugeer gedurende 10 min bij 500 x g.
- Resuspend de pellet in BSA wasoplossing en centrifugeer gedurende 7 min bij 400 x g.
- Resuspend de pellet in het standaard kweekmedium, tel de cellen en voer de beplating uit zoals hierboven beschreven (in stap 2.1.10).
3. Primaire neurosferen
- Voeg elke 2 dagen de groeifactoren (bFGF/EGF) toe.
- Verander elke 4-6 dagen (afhankelijk van de celdichtheid) de helft van het medium als volgt:
- Breng de volledige celsuspensie over in een buis van 15 of 50 ml.
- Centrifugeer gedurende 5 min bij 400 x g.
- Verwijder de helft van het volume.
- Voeg dezelfde hoeveelheid vers medium toe, meng voorzichtig door te pipetteren en voeg groeifactoren toe.
4. Oligosferen
OPMERKING: Oligodendrocytendifferentiatie wordt uitgevoerd volgens het Chen-protocol10 met wijzigingen.
- Wanneer de neurosferen een diameter van 100-150 μm bereiken, zijn ze klaar om te worden gepasseerd. Breng hiervoor de volledige celsuspensie over naar een buis van 15 of 50 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g.
- Evalueer snel de diameter door foto's van de bollen te maken met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop en deze te openen met ImageJ-software.
- Klik op het menu Analyseren en selecteer in het venster Extra de optie Schaalbalk.
- Stel 150 μm in als Breedte in micron en vergelijk de schaalbalk met de bollen.
- Verwijder het volledige volume door inversie en resuspend de pellet in 180 μL vers standaard kweekmedium. Pipetteer 50 keer om de uitsplitsing van de bollen mogelijk te maken.
- Voeg 810 μL vers standaard kweekmedium toe, tel de cellen en plaats ze opnieuw zoals beschreven voor de neurosferen.
- Voeg elke 2 dagen bFGF/PDGF-AA 10 ng/ml toe.
- Verander elke 4-6 dagen (afhankelijk van de celdichtheid) de helft van het medium als volgt:
- Breng de volledige celsuspensie over in een buis van 15 of 50 ml.
- Centrifugeer gedurende 5 min bij 400 x g.
- Verwijder de helft van het volume.
- Voeg dezelfde hoeveelheid vers medium toe, meng voorzichtig door te pipetteren en voeg groeifactoren toe.
5. Plaatcoating
- Poly-D,L-ornithine/laminine coating: voeg ten minste 2 dagen voor het platen van de OPC's 50 μg/ml poly-D,L-ornithine oplossing, verdund in PBS, toe aan elke put (40 μL/put voor 96-well platen) en incubateer bij RT een nacht.
- Verwijder de volgende dag de vloeistof en was drie keer met gedestilleerd steriel water.
- Laat de borden een nacht drogen bij RT. Voeg de volgende dag een laminineoplossing verdund in PBS toe (5 μg/ml; 40 μl/putje voor 96-putplaten) en incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C.
6. Celzaaien
- Wanneer de oligosferen een diameter van 100-150 μm bereiken, zijn ze klaar om te worden gedissocieerd en gezaaid op de met poly-D, L-ornithine / laminine gecoate platen. Breng hiervoor de volledige celsuspensie over naar een buis van 15 of 50 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g (zoals aangegeven in stap 4.1)
- Verwijder het volledige volume door inversie en resuspend de pellet in 180 μL vers standaard kweekmedium. Pipetteer 50 keer om de uitsplitsing van de bollen mogelijk te maken.
- Voeg 810 μL vers standaard kweekmedium toe en tel de cellen.
- Verwijder de laminine-oplossing uit de putjes en plaats de cellen op 3.000 cel/cm2 dichtheid (100 μL/put voor 96-putplaten).
7. OPC differentiatie inductie
- Verwijder na 3 dagen het volledige medium en voeg hetzelfde volume oligodendrocytendifferentiatiemedium toe.
- Ververs de helft van het medium om de 4 dagen en voeg elke 2 dagen een verse differentiatiemix (T3/CNTF/NAC) toe.
8. Inductie van ontstekingsgemedieerd differentiatieblok
- Voeg na neurosfeerdissociatie en oligosfeerproductie (sectie 4) het cytokinemengsel toe aan het kweekmedium en houd oligosferen blootgesteld aan cytokines gedurende de hele bolvormingsstap.
OPMERKING: Het volume is afhankelijk van het aantal cellen, omdat voor de bolletjes die cellen vormen worden gezaaid bij 10-50 cellen / μL. - Als het medium moet worden vervangen, verander dan het volledige volume en voeg het cytokinemengsel nogmaals toe.
9. Inductie van zuurstof-glucose deprivatie celdood
- Bij -1 DIV (2 dagen na celzaaien in multiwell platen), verwijder het medium en bewaar het in een nieuwe multiwell plaat.
- Voeg de helft van het volume (50 μL voor 96-well platen) ogd-medium (OGD-groep) of vers medium (controlegroep) toe. De halve hoeveelheid volume wordt gebruikt om de uitwisseling van zuurstof tussen de vloeistof en de lucht te verminderen.
- Plaats de OGD-groepsculturen in een luchtdichte hypoxiekamer verzadigd met 95% N2 en 5% CO2. Om verzadiging van de kamer te bereiken, laat u het gasmengsel gedurende 6 minuten bij 25 l/min stromen voordat u de kamerleidingen sluit.
- Incubeer de hypoxische kamer in de incubator gedurende 3 uur. De controlegroep en de platen met het medium die bij stap 9.1 zijn verwijderd en bewaard, moeten ook in de incubator worden achtergelaten.
- Verwijder het glucosevrije (OGD-groep) of het nieuwe medium (controlegroep) en voeg het medium toe dat bij stap 9.1 is verwijderd en bewaard.
10. Immunocytochemie
- Fixeer de cellen op het gewenste tijdstip met koude 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij RT.
- Was tweemaal met PBS (10 min incubatie voor elke wasbeurt bij RT).
- Incubeer 1 uur bij RT met de blokkerende oplossing (PBS Triton 0,3% met 1% BSA en 1% ezel/geit normaal serum).
- Incubeer met primair antilichaammengsel (tabel 1), verdund in PBS-triton 0,3%, 's nachts bij 4 °C.
- Was tweemaal met PBS (10 min incubatie voor elke wasbeurt bij RT).
- Incubeer met secundair antilichaam(tabel 1)oplossing verdund in PBS triton 0,3% met toevoeging van Hoechst 33258 gedurende 30 min bij 37 °C.
- Was tweemaal met PBS (10 min incubatie voor elke wasbeurt bij RT).
11. HCS-analyse van de levensvatbaarheid van cellen, afstammingssamenstelling en afstammingsspecifieke celdood
OPMERKING: De representatieve afbeeldingen en workflow van HCS worden weergegeven in figuur 2A,B.
- Selecteer het compartimentanalyse-algoritme in het hoofdmenu van de software (HCS Studio v 6.6.0) en selecteer Scannen in het hoofdmenu Test/Scanplaat ontwikkelen.
- Selecteer in het iDev-venster De optie Nieuw en selecteer vervolgens Algemeen hulpmiddel voor intensiteitsmeting in de sjabloon Test ontwikkelen.
- Klik op Maken aan de rechterkant van het menu en selecteer het 10x-doel.
- Hiermee wordt het menu Acquisitie configureren geopend. Selecteer in dit venster de volgende parameters: (a) aantal kanalen: de eerste voor de Nucleaire kleuring van Hoechst (BGRFR_386) en één voor elke afstammingsspecifieke marker die in de reactie wordt gebruikt (b) selecteer softwarefocus op kanaal 1 en autofocusinterval als 1 (c) selecteer het plaatmodel in de lijst.
- Bekijk in het acquisitiemenu de kwaliteit van de kleuring in verschillende putten en verschillende velden en selecteer handmatig de belichtingstijd door Vaste belichtingstijd in het menu te selecteren.
- Zodra de acquisitieparameters zijn ingesteld, selecteert u Mini Scan bovenaan het menu en selecteert u tien velden per put in twee putten per experimentele toestand. Dit maakt het mogelijk om alle analyseparameters in een subset van velden voor de hele plaat in te stellen.
- Wanneer de miniscan is voltooid, klikt u op de parameter Assay configureren om het algoritme van de analyse te configureren.
- Klik op Groepen configureren aan de rechterkant van het venster en sleep de putjes van de miniscan. Klik op de knop Toevoegen in de subsectie Groepen om de verschillende groepen te configureren.
- Volg de workflow aan de linkerkant van het venster stap voor stap om het hele algoritme te ontwikkelen. Selecteer eerst Afbeelding verwerken voor elk kanaal en klik op Achtergrond verwijderen en op het gewenste niveau.
- Identificeer en selecteer eerst de kernen door nucleaire kleuring. Klik op Primair object identificeren - Kanaal 1 om de echte kernen te selecteren en te voorkomen dat artefacten en puin worden geanalyseerd. Zoom hiervoor in op een representatief beeld van nucleaire kleuring en controleer of de kernen goed zijn omgeven door de omtrek die door de software is gebouwd. Het is mogelijk om de drempelwaarde te wijzigen en segmentatie-algoritmen toe te passen om afzonderlijke kernen beter te identificeren.
- Zodra de kernen correct zijn gedefinieerd, klikt u op de volgende stap: Primair object valideren. Selecteer Object.BorderObject.Ch1 om de analyse van kernen aan de rand van elke veldafbeelding te voorkomen. Selecteer Object.Area.Ch1 en verwijder, door de "lage" en "hoge" balken op de histogrammen te verplaatsen, al het geïdentificeerde puin of grote objecten die overeenkomen met aggregaten of artefacten.
- Controleer alle mini-scan representatieve afbeeldingen van alle experimentele omstandigheden om er zeker van te zijn dat de geselecteerde parameters bij alle parameters passen.
- Klik op Vlekken identificeren voor elk kanaal dat overeenkomt met de specifieke afstammingsmarkeringen en selecteer de ringwaarden: Breedte = 3 en Afstand = 0. Dit zal de identificatie van de cytoplasmatische fluorescentie mogelijk maken. Afhankelijk van de celdichtheid kunnen deze waarden worden aangepast. De software voorkomt automatisch overlapping tussen aangrenzende ringen.
- Selecteer Referentieniveaus in de workflow om de analyse samen te stellen. De instelling van de referentieniveaus zal het mogelijk maken om automatisch gecondenseerde kernen te tellen, op basis van de nucleaire grootte en nucleaire kleuringsintensiteit, en van specifieke markerpositieve cellen, op basis van de cytoplasmatische fluorescentie geïdentificeerd door de Ring.
- Klik eerst op Object.Area.Ch1. Selecteer in de mini-scanafbeeldingen een gecondenseerde kern en verplaats de "LOW" -balk op de histogrammen om alle kernen onder deze grootte als "gecondenseerd" te selecteren.
- Klik op Object.AvgIntensity.Ch1. Selecteer in de mini-scanafbeeldingen een gecondenseerde kern en verplaats de "HIGH" -balk op de histogrammen om alle kernen boven deze fluorescentie-intensiteit als "gecondenseerd" te selecteren.
- Klik op Object.RingAvgIntensity voor elk kanaal van afstammingsspecifieke markeringen. Selecteer in uw mini-scanafbeeldingen een positieve cel en verplaats de "HIGH" -balk op de histogrammen om alle cellen boven deze fluorescentie-intensiteit als "positief" te selecteren.
- Controleer alle mini-scan representatieve afbeeldingen van alle experimentele omstandigheden om er zeker van te zijn dat de geselecteerde parameters bij alle parameters passen.
- Selecteer in het bovenste menu Population Characterization en selecteer Event Subpopulation.
- Als Type 1-gebeurtenis selecteert u ObjectAreaCh1 in de linkerlijst, klikt u vervolgens op de knop EN > en selecteert u ten slotte ObjectAvgIntensityCh1. Dit zal de identificatie van gecondenseerde kernen mogelijk maken, als een combinatie van laag gebied en hoge intensiteit.
- Schakel in hetzelfde venster alle scanlimieten uit.
- Klik op Selecteer functies om op te slaan in het bovenste menu om de parameters te kiezen die u in de analyse wilt houden.
- Selecteer Well Features en verplaats van de linkerlijst naar rechts alleen de gewenste parameters: (a) SelectedObjectCountPErValidField (b) %EventType1ObjectCount (c) %High_RingAvgIntensity (Voor elk kanaal van de specifieke afstammingsmarkeringen).
OPMERKING: Deze analyse geeft als uitlezing het totale aantal cellen, het percentage gecondenseerde kernen en het percentage afstammingsspecifieke positieve cellen voor elke geanalyseerde marker op het totale celnummer. Als het percentage van de verschillende afstammingslijnen alleen nodig is op levende cellen, is het mogelijk om de waarde "High_RingAvgIntensity" voor het kanaal (absoluut aantal positieve cellen) te behouden en het percentage op het totale celaantal opnieuw te berekenen na het aftrekken van het percentage dode cellen.- Als alternatief is het mogelijk om de dode cellen uit de analyse te verwijderen en dezelfde parameters in te stellen die worden gebruikt om gecondenseerde kernen te identificeren (stappen 11.14-11.15) op de validatie van kernen (stap 11.11).
- Selecteer Scanplaat in het hoofdmenu en klik op het bordsymbool in het submenu Scaninstelling in het bovenste gedeelte om de te analyseren put te identificeren.
- Schrijf de naam van het experiment en de beschrijving en zodra alle instellingen zijn voltooid, drukt u op het afspeelsymbool.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eerste fase van de kweek kan variëren in duur, afhankelijk van de zaaidichtheid en of de bollen van foetale of volwassen oorsprong zijn. Bovendien vertonen oligosferen een verminderde populatieverdubbeling in vergelijking met neurosferen(figuur 1B). Bovendien is de productie van bollen uit volwassen weefsel langzamer en kan het 2-3 weken duren om oligosferen te genereren in vergelijking met foetale die 1-2 weken kunnen duren, afhankelijk van de zaaidichtheid.
Eenmaal gezaaid, kan de volledige differentiatiefase van de culturen worden gevolgd met behulp van afstammingsspecifieke antilichamen. Aangezien het doel van dit protocol is om de laatste fase van de differentiatie te bestuderen, wordt de cultuursamenstelling bij 0 DIV's niet gepresenteerd. Tijdens de eerste kweekfase zullen cellen echter nog steeds nestin-positief zijn, wat neurale voorlopers vertegenwoordigt, en de meerderheid van de cellen zijn ook NG2-positief (OPC's)11. CNPase-positieve cellen, overeenkomend met het preOL-stadium, zullen 3-6 dagen na T3-gemedieerde differentiatie-inductie detecteerbaar zijn, terwijl MBP-positieve cellen tussen 6 en 12 DIV's verschijnen (volwassen OK's; zie figuur 2C voor de samenstelling van de culturen aan het einde van de differentiatiefase).
De HCS-analyse maakt de detectie van elke afzonderlijke cel in de cultuur mogelijk door middel van de nucleaire kleuring en de analyse van de fluorescentie-intensiteit in de resterende kanalen (figuur 2A, B). De samenstelling van de cultuur aan het einde van de differentiatiefase (12 DIV's) verschilt afhankelijk van of de culturen van foetale of volwassen oorsprong zijn, waarbij foetale culturen beter reageren op T3-gemedieerde differentiatie en een hoger percentage volwassen OK's bereiken12.
Gedurende het hele kweekproces zijn ongeveer 40% -50% van de cellen astrocyten (GFAP-positieve cellen), terwijl een klein percentage (minder dan 0% -10%) neuronen zijn (bèta-III-tubuline-positieve cellen; Figuur 2C). De cultuursamenstelling kan variëren van 10% tussen verschillende kweekpreparaten. Volwassen en foetale culturen verschillen voor de opbrengst van volwassen OK-productie aan het einde van de differentiatiefase, waarbij foetale cellen een hoog percentage volwassen OK's, een laag percentage precursoren en ongeveer 30% -40% astrocyten vertonen. Aan de andere kant presenteren volwassen culturen meer astrocyten (ongeveer 45% -55%) en minder gedifferentieerde cellen na 12 DIV's van differentiatie-inductie.
Om de software in staat te stellen de cellen te herkennen en een goede onbevooroordeelde analyse van de kweeksamenstelling te bieden, is het belangrijk dat de zaaidichtheid correct is, waardoor overlapping tussen aangrenzende cellen wordt vermeden. Wanneer NSC-afgeleide OPC's met een hoge dichtheid worden gezaaid, hebben ze de neiging om zeer snel te aggregeren, wat ertoe leidt dat het hele oppervlak van de put na een paar dagen door astrocyten wordt bezet. Bovendien zullen volwassen OK's met hun karakteristieke spinnetvorm niet zichtbaar zijn vanwege de beperkte ruimte (figuur 3A, B).
Het ontstekingsgemedieerde differentiatieblok is reproduceerbaar door deze in vitro test en genereert een sterke afname van pre-OLL's en volwassen OK's gedetecteerd door CNPase en MBP-kleuring in zowel foetale als volwassen culturen. Een toename van het aantal OPC's komt ook voor in volwassen culturen (figuur 4A,B). De cytokinemixsamenstelling werd gekozen uit in vivo experimenten in een rattenmodel van multiple sclerose13en werd getest als een in vitro model voor het ontstekingsgemedieerde differentiatieblok dat bij deze ziekte voorkomt.
Terwijl foetale en volwassen OPC's dezelfde kwetsbaarheid voor inflammatoire cytokineblootstelling vertonen, zijn alleen foetale afgeleide culturen gevoelig voor OGD-toxiciteit (Figuur 5A, B), met een toename van celdood en differentiatiestoornissen als gevolg van hun verschillende metabole profiel14.
Figuur 1: Neurale stamcel-afgeleide oligodendrocytenvoorloper celkweekopstelling en differentiatieprotocol. A)Schema van de experimentele procedure. BRepresentatieve beelden van neurosferen bij 2, 5 en 7 DIV's, en grafiek die de populatieverdubbeling van neurosferen en oligosferen laat zien. Schaalbalk: 100 μm. (C) Representatieve beelden van gezaaide oligosfeer-afgeleide OPC's die de verschillende stadia van differentiatie laten zien, van nestine- en NG2-positieve cellen bij 0 DIV (neurale precursor / OPCs), via CNPase-positieve cellen bij 6 DIVs (preOL's) en CNPase / MBP dubbele positieve cellen aan het einde van de differentiatiefase (12 DIVs; volwassen OK's). GFAP-positieve cellen (astrocyten) en een klein percentage bèta-III-tubulinepositieve cellen (neuronen) zijn aanwezig in de hele cultuur. Schaalbalken: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Celgebaseerde high-content screening analyseworkflows en verwachte differentiatie-uitlezing. (A) Representatieve beelden van HCS-verwerving van een hele put (96-well plaat) en een geïsoleerd enkel veld verkregen met een 10x doelstelling van een 12 DIVs cultuur van NSC-afgeleide OPC's. (B)HCS-analyseworkflowstappen, waaronder visualisatie, identificatie en constructie van kernen (objecten) om de cytoplasmatische kleuring en markeridentificatie te identificeren. (C) Grafiek met de verwachte cultuursamenstelling aan het einde van de differentiatiefase (12 DIV's). Markers voor OPC's (PDGFαR, NG2), pre-OL's (CNPase, APC), volwassen OK's (MBP), astrocyten (GFAP) en neuronen (β-III-tubuline) worden getoond voor zowel foetale als volwassen culturen. Afgeronde percentages voor elke celmarker zijn opgenomen in de grafiek, merk op dat dit een representatief experiment is en dat percentages ongeveer 5% -10% kunnen verschillen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve screeningbeelden met een hoog gehalte van een cultuur met hoge dichtheid. (A) Representatief beeld van een put (96-well plaat) beeld verkregen door 10x objectief en gemarkeerd voor MBP-expressie aan het einde van de differentiatiefase (12 DIVs). (B) Representatief geëxtraheerd veldbeeld dat de aanwezigheid van geaggregeerde cellen en overlappende kernen benadrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Verwacht effect van cytokinebehandeling op foetale en volwassen OPC-culturen. (A) Grafiek met het percentage variatie van foetale en volwassen afgeleide OPC-culturen in vergelijking met standaardculturen, inclusief de kwantificering van OPC's (NG2), pre-OLs (CNPase) en volwassen OK's (MBP) aan het einde van de differentiatiefase (12 DIV's). B)Representatieve beelden van volwassen culturen aan het einde van de differentiatiefase (12 DIV's) behandeld met medium- of cytokinemix en gemarkeerd voor NG2 of CNPase/MBP. Schaalbalk: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Verwacht effect van OGD-blootstelling op foetale afgeleide OPC-culturen. (A) Grafiek met het percentage gecondenseerde kernen gekwantificeerd door celgebaseerde HCS in control (ctrl) en OGD-blootgestelde culturen. (B) Representatieve afbeeldingen van HCS-verwerkte objecten die de geïdentificeerde gecondenseerde kernen (witte pijlen) markeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Antistof | Soort | Verdunning | |
| anti-β-III-tubuline (R&D-systeem) | muis | 1:3000 | |
| anti-GFAP (Dako) | konijn | 1:1000 | |
| anti-NG2 (Millipore) | konijn | 1:350 | |
| anti-PDGFαR (Santa Cruz Biotechnologie) | konijn | 1:300 | |
| anti-CNPase (Millipore) | muis | 1:500 | |
| IgG2b anti-APC, kloon CC1 (Calbiochem) | muis | 1:100 | |
| Anti-MBP (Dako) | konijn | 1:250 | |
| Anti-nestine (Millipore) | muis | 1:500 | |
| Alexa Fluor 488-geconjugeerde antimuis (ThermoFisher Scientific) | ezel | 1:500 | |
| Alexa Fluor 647-geconjugeerde anti-muis IgG2b (ThermoFisher Scientific) | geit | 1:500 | |
| Alexa 568-geconjugeerd anti-konijn (ThermoFisher Scientific) | ezel | 1:500 | |
Tabel 1: Lijst van primaire en secundaire antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De complexe aard van myelinisatie/remyelinisatieprocessen en demyeliniserende gebeurtenissen maakt de ontwikkeling van voorspellende in vitro systemen uiterst uitdagend. De meest gebruikte screeningsystemen voor in vitro geneesmiddelen zijn meestal menselijke cellijnen of primaire zuivere OL-culturen, met toenemend gebruik van complexere coculturen of organotypische systemen15. Zelfs als dergelijke systemen worden gekoppeld aan technologieën met een hoog gehalte, blijven pure OL-culturen de voorkeursmethode bij de ontwikkeling van screeningplatforms16.
De hier beschreven spontane gemengde cultuur vertegenwoordigt een nuttig in vitro systeem, dat rekening houdt met alle belangrijke variabelen: fysiologische T3-gemedieerde OPC-differentiatie, pathologische interferents met het proces, andere cellulaire componenten en leeftijdsgerelateerde verschillen. De procedure bevat een aantal variabelen die voortvloeien uit de oorsprong van de cellen (leeftijd van het dier) en de vorming en manipulatie van sferoïden. In feite is een kritieke stap de celdichtheid van NSC's die zaaien na de isolatie van het weefsel, omdat in de optimale toestand een enkele bol moet worden afgeleid van een enkele prolifererende cel. Omdat we hebben gezien dat geïsoleerde NSC's de neiging hebben om te aggregeren en dat ze hun eigen uitgescheiden paracriene factoren nodig hebben, is het zaaien ervan in een bereik van 10-50 cellen / μL, in een t25- of t75-kolf, het beste compromis om celaggregatie te voorkomen, maar nog steeds cellen in staat te stellen te communiceren door afscheidingsfactoren.
De belangrijkste beperkingen van de techniek is het ontbreken van een functionele axonale myelinisatie en een directe interactie met neuronen, omdat de methode alleen rekening houdt met de OPC-differentiatie tot het stadium van volwassen OK's: CNPase / MBP-dubbele positieve cellen met een spinnennetmorfologie. Voor dit doel is primaire OPC's gekweekt op geïsoleerde dorsale wortelganglia nog steeds de belangrijkste methodologie17. De mogelijkheid om deze cellen op elke leeftijd van dieren te onderscheiden, is echter een fundamenteel punt in het translationele proces, omdat het de test van verbindingen en schadelijke stimuli op cellen geïsoleerd uit de leeftijd van interesse mogelijk maakt. Zoals hier beschreven, kunnen NSC's in feite worden geïsoleerd van zowel de foetale als de volwassen hersenen. Aangezien ontwikkelingsmyelinisatie en remyelinisatie op volwassen leeftijd hetzelfde doel delen, d.w.z. om het naakte axon te bereiken en de myelineschede te creëren, werd oorspronkelijk verondersteld dat de twee processen in elk aspect identiek waren, wat de zogenaamde recapitulatiehypothese genereerde18. Het is nu echter duidelijk dat de twee processen niet als gelijk kunnen worden beschouwd en dat celintrinsieke leeftijdsgerelateerde verschillen aanwezig zijn en in aanmerking moeten worden genomen bij het kiezen van het meest geschikte in vitro model voor de experimentele vraag19. Volwassen NSC's-afgeleide OPC's vertonen in feite sterke verschillen in fysiologische TH-gedreven differentiatie en kwetsbaarheid voor schadelijke stimuli14,20 en primaire OPC's21,22. Er is ook heterogeniteit van opc's en OK's in volwassen weefsels, van bijzonder belang voor pathologische aandoeningen23. Protocollen voor primaire OPC-isolatie van volwassen weefsels zijn beschikbaar24 en moeten worden overwogen wanneer de experimentele vraag wordt gericht op moleculen die op remyelinisatie op volwassen leeftijd werken.
De differentiatie van OPC's van NSC's maakt de in vitro weergave van het hele differentiatieproces mogelijk, van ongedifferentieerde voorloper tot volwassen OL. Dit proces lijkt op de in vivo toestand, waarbij TH de belangrijkste aanjager van het proces is, die werkt via specifieke nucleaire receptoren, en het maakt experimentele interferentie met dit mechanisme mogelijk om pathologische omstandigheden na te bootsen in een translationele weergave13.
Het laatste fundamentele kenmerk van het model is de constante aanwezigheid van astrocyten in de hele cultuur. Hoewel dit de cultuur moeilijker te analyseren maakt, vormt de complexe celsamenstelling een duidelijk voordeel. De manier waarop astrocyten bijdragen aan de reactie op schadelijke gebeurtenissen in gemengde neuronale culturen25 is algemeen bekend, en de afwezigheid van dit hoofdbestanddeel van het CZS maakt het in vitro systeem slecht voorspelbaar en vertaalbaar. Aan de andere kant hebben NSC-afgeleide culturen voor dit kenmerk het nadeel dat ze minder uniform zijn dan systemen van het type eencellige cel, en dit kan leiden tot een bevooroordeelde analyse. De celgebaseerde HCS-techniek maakt echter een analyse van de hele cultuur en van alle celpopulaties mogelijk, waarbij ook de randomisatie van representatieve velden voor analyse wordt verwijderd. Ervan uitgaande dat de celcultuur die voor het experiment wordt gebruikt van een betrouwbare zaaikwaliteit is, zal het HCS een volledig beeld geven van de experimentele omstandigheden, waarbij statistisch robuuste gegevens en een aantal automatische fluorescentie-gebaseerde analyses worden gegenereerd.
Concluderend beschrijft het huidige protocol de procedure voor de isolatie en differentiatie van NSC-afgeleide OPC's uit foetale en volwassen hersenen. Het hele protocol duurt ongeveer 30 dagen, afhankelijk van de leeftijd van de dieren en de experimentele doelen. In het bijzonder kan de vorming van bollen van volwassen oorsprong twee keer duren in vergelijking met foetale, met dezelfde zaaidichtheid. De tijd van 15 dagen (van -3 tot 12 DIV's) na het zaaien op 2D-oppervlak voor de differentiatie-inductie is echter een vaste tijd in alle omstandigheden. Het volledige protocol maakt de studie mogelijk van het volledige TH-gemedieerde differentiatieproces in een complexe cellulaire omgeving, interferentie door specifieke pathologische mechanismen (d.w.z. inflammatoire cytokines en HI) en het daaruit voortvloeiende testen van nieuwe strategieën gericht op het overwinnen van deze problemen. De koppeling van het cultuurmodel met de HCS-techniek zorgt voor een robuust en vertaalbaar screeningsplatform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Ondersteund door MIUR National Technology Clustersproject IRMI (CTN01_00177_888744), en Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.
Speciale dank aan Stichting IRET voor het hosten van het experimentele werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates - untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
References
- Michalski, J. P., Kothary, R.
- Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional considerations. Journal of Neuroscience Research. 94, 1411-1420 (2016).
- Raff, M. C., Lillien, L. E., Richardson, W. D., Burne, J. F., Noble, M. D. Platelet-derived growth factor from astrocytes drives the clock that times oligodendrocyte development in culture. Nature. 333, 562-565 (1988).
- Crawford, A. H., Chambers, C., Franklin, R. J. M. Remyelination: The true regeneration of the central nervous system. Journal of Comparative Pathology. 149, 242-254 (2013).
- Butt, A. M., Papanikolaou, M., Rivera, A.
- Baldassarro, V. A., Giardino, L., Calzà, L. Oligodendrocytes in a dish for the drug discovery pipeline: the risk of oversimplification. Neural Regeneration Research. 16, 291-293 (2021).
- Buchser, W. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. 1, Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. 1-80 (2014).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Ahlenius, H., Kokaia, Z. Isolation and generation of neurosphere cultures from embryonic and adult mouse brain. Methods in Molecular Biology. 633, Clifton, N.J. 241-252 (2010).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse Oligodendrocyte Precursor Cells. Nature Protocols. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure. Glia. 64, 1573-1589 (2016).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. Differential effects of glucose deprivation on the survival of fetal versus adult neural stem cells-derived Oligodendrocyte Precursor Cells. Glia. , 23750 (2019).
- Merrill, J. E. In vitro and in vivo pharmacological models to assess demyelination and remyelination. Neuropsychopharmacology. 34, 55-73 (2009).
- Lariosa-Willingham, K. D., et al. A high throughput drug screening assay to identify compounds that promote oligodendrocyte differentiation using acutely dissociated and purified oligodendrocyte precursor cells. BMC Research Notes. 9, 419 (2016).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 209, 219-226 (2012).
- Fancy, S. P. J., Chan, J. R., Baranzini, S. E., Franklin, R. J. M., Rowitch, D. H.
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS Myelin - from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18, 753-769 (2017).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation. Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).
- Leong, S. Y., et al. Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development. Neurology. 82, (2014).
- Bribián, A., et al. Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis. Journal of Clinical Medicine. 9, 1681 (2020).
- Jäkel, S., et al. Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis. Nature. 566, 543-547 (2019).
- Medina-Rodríguez, E. M., Arenzana, F. J., Bribián, A., de Castro, F. Protocol to isolate a large amount of functional oligodendrocyte precursor cells from the cerebral cortex of adult mice and humans. PloS One. 8, 81620 (2013).
- Baldassarro, V. A., et al. Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases. Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).
