Summary
Vi beskriver produktionen av blandade kulturer av astrocyter och oligodendrocyte föregångare celler härrör från fetala eller vuxna neurala stamceller differentiering i mogna oligodendrocyter och in vitro modellering av skadliga stimuli. Kopplingen med en cellbaserad screeningteknik med högt innehåll bygger ett tillförlitligt och robust system för läkemedelsscreening.
Abstract
Det största hindret för att utveckla metoder för läkemedelsscreening för att bedöma effektiviteten hos terapeutiska strategier vid komplexa sjukdomar är att hitta en balans mellan förenkling in vitro och återskapande av den komplexa in vivo-miljön, tillsammans med huvudsyftet, som delas av alla screeningstrategier, att erhålla robusta och tillförlitliga uppgifter, som är mycket prediktiva för in vivo-översättning.
När det gäller demyelinerande sjukdomar är majoriteten av strategierna för läkemedelsscreening baserade på odödliga cellinjer eller rena kulturer av isolerade primära oligodendrocytprekursorceller (OPCs) från nyfödda djur, vilket leder till starka fördomar på grund av bristen på åldersrelaterade skillnader och av något verkligt patologiskt tillstånd eller komplexitet.
Här visar vi installationen av ett in vitro-system som syftar till att modellera den fysiologiska differentiering/mognad av neurala stamceller (NSC) härledda OPCs, lätt manipulerade för att efterlikna patologiska tillstånd som är typiska för demyelinating sjukdomar. Dessutom omfattar metoden isolering från fetala och vuxna hjärnor, vilket ger ett system som dynamiskt skiljer sig från OPCs till mogna oligodendrocyter (OLs) i en spontan samkultur som också inkluderar astrocyter. Denna modell liknar fysiologiskt sköldkörtelhormon-medierad myelination och myelin reparationsprocessen, vilket möjliggör tillägg av patologiska störare som modellerar sjukdom mekanismer. Vi visar hur man efterliknar de två huvudkomponenterna i demyelinating sjukdomar (dvs. hypoxi / ischemi och inflammation), återskapar deras effekt på utvecklingsmyelination och vuxna myelin reparation och tar hänsyn till alla cellkomponenter i systemet hela tiden, samtidigt som man fokuserar på att differentiera OPCs.
Denna spontana blandade modell, i kombination med cellbaserad screeningteknik med högt innehåll, möjliggör utvecklingen av ett robust och tillförlitligt system för läkemedelsscreening för terapeutiska strategier som syftar till att bekämpa de patologiska processer som är involverade i demyelination och inducera remyelination.
Introduction
I centrala nervsystemet (CNS), myelinbildande celler (oligodendrocyter, OLs) och deras prekursorer (oligodendrocytprekursorceller, OPC) ansvarar för utvecklingsmyelination, en process som uppstår under peri- och postnatala perioder, och för myelinomsättning och reparation (remyelination) i vuxen ålder1. Dessa celler är högspecialiserade, interagerar anatomiskt och funktionellt med alla andra glia- och neuronala komponenter, vilket gör dem till en grundläggande del av CNS struktur och funktion.
Demyelinating händelser är involverade i olika CNS skador och sjukdomar2, och verkar främst på OPCs och OLs genom multifaktoriella mekanismer, både under utveckling och vuxen ålder. De odifferentierade prekursorerna drivs av differentierande faktorer, främst sköldkörtelhormon (TH), i en synkroniserad process3 som leder OPC att känna igen och svara på specifika stimuli som inducerar spridning, migrering till den icke-myelinerade axonen och differentiering till mogna OLs som i sin tur utvecklar myelskidern4. Alla dessa processer är fint kontrollerade och förekommer i en komplex miljö.
På grund av myelinationens komplexa natur, remyelination och demyelinationshändelser finns det ett stort behov av en förenklad och pålitlig in vitro-metod för att studera de underliggande mekanismerna och utveckla nya terapeutiska strategier, med fokus på den viktigaste cellulära aktören: OPC5.
För att ett in vitro-system ska vara tillförlitligt måste ett antal faktorer beaktas: cellmiljöns komplexitet, åldersrelaterade cell inneboende skillnader, fysiologisk TH-medierad differentiering, patologiska mekanismer och robustheten hos data6. Det ouppfyllda behovet på området är faktiskt en modell som efterliknar komplexiteten i in vivo-tillståndet, som inte framgångsrikt uppnås genom användning av isolerade rena OPC-kulturer. Dessutom involverar de två huvudkomponenterna i demyelinating händelser, inflammation och hypoxi/ischemi (HI), direkt andra cellkomponenter som indirekt kan påverka fysiologisk differentiering och mognad av OPC, en aspekt som inte kan studeras i alltför förenklade in vitro-modeller.
Med utgångspunkt i ett mycket prediktivt kultursystem är den efterföljande och mer allmänna utmaningen att producera robusta och tillförlitliga data. I detta sammanhang är cellbaserad höginnehållsscreening (HCS) den mest lämpliga tekniken7, eftersom vårt mål för det första är att analysera hela kulturen i ett automatiskt arbetsflöde, undvika partiskheten att välja representativa fält, och för det andra att få automatisk och samtidig generering av bildbaserade höginnehållsdata8.
Med tanke på att det största behovet är att uppnå den bästa balansen mellan in vitro-förenkling och in vivo-mimicking komplexitet, presenterar vi här en mycket reproducerbar metod för att erhålla OPCs som härrör från neurala stamceller (NSCs) isolerade från fetala förhjärnan och den vuxna sub-ventrikulära zonen (SVZ). Denna in vitro-modell omfattar hela OPC-differentieringsprocessen, från multipotent NSC till mogna/myelinerande OL, på ett fysiologiskt TH-beroende sätt. Den resulterande kulturen är ett dynamiskt differentierande/mognande system som resulterar i en spontan samkultur som huvudsakligen består av att differentiera OPCs och astrocyter, med en låg andel neuroner. Denna primära kultur efterliknar bättre den komplexa in vivo-miljön, medan dess stamcellsavledning gör det möjligt att utföra enkla manipuleringar för att erhålla den önskade celllinjeberikningen.
I motsats till andra strategier för läkemedelsscreening med hjälp av cellinjer eller rena kulturer av primära OPCs, tillåter metoden som beskrivs här studien av effekten av patologiska interferents eller terapeutiska molekyler i en komplex miljö, utan att förlora fokus på önskad celltyp. DET beskrivna HCS-arbetsflödet tillåter en analys av cellens livskraft och härstamningsspecifikation, samt härstamningsspecifika celldöds- och morfologiska parametrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprotokoll som beskrivs häri har utförts i enlighet med Europeiska gemenskapens rådsdirektiv (86/609/EEG) och följer riktlinjerna i NIH-guiden för vård och användning av laboratoriedjur.
1. Lösningar och reagenser
- Förbered standardmedium: DMEM/F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg Penicillin/Streptomycin (1% P/S); 1x B27; 1x N-2.
- Förbered neurosfärmedium: tillsätt 10 ng/mL bFGF; 10 ng/ml EGF till standardmedium.
- Förbered oligosfär/OPC-medium: tillsätt 10 ng/mL bFGF; 10 ng/mL PDGF-AA till standardmedium.
- Förbered oligodendroctye differentieringsmedium: tillsätt 50 nM T3; 10 ng/ml CNTF; 1x N-acetyl-L-cystein (NAC) till standardmedium.
- Förbered icke-enzymatisk dissociationsbuffert: tillsätt 1% P/S till icke-enzymatisk dissociationsbuffert och håll iskall.
- Förbered sackaroslösning: HBSS, 0,3 g/ml sackaros.
- Förbered BSA tvättlösning: EBSS, 40 mg/mL BSA, 0,02 ml/l HEPES.
- Förbered enzymatisk dissociationsbuffert: HBSS, 5,4 mg/mL D-glukos, 15 mmol/L HEPES, 1,33 mg/mL Trypsin, 0,7 mg/mL Hyaluronidase, 80 U/mL DNase.
- Förbered cytokinblandning: TGF-β1, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 och IFN-γ (20 ng/mL vardera).
- Förbered cytokinblandningsfordon: 0,04% av beståndet (10% glycerol/100 nM glycin/25 nM Tris, pH 7,3).
- Förbered syre-glukos deprivation medium: standard medium med DMEM w/o glukos. Beroende på stringensen av det önskade glukosbristtillståndet är det möjligt att ta bort även B27 och/eller N2 från mediet för att undvika glukosrelaterade föreningar (t.ex. D-Galactose i B27).
2. Dissekering och NSC-isolering
OBS: Fetala och vuxna NSCs isolerades från E13.5 fetala forebrain eller 2,5 månader gamla vuxna sub-ventrikulärt zonen (SVZ), efter Ahlenius och Kokaia protokoll9 med ändringar.
- Fetala NSC-kulturer
OBS: Innan dissekeringarna påbörjas, bered 1,5 ml rör som innehåller 150 μL icke-enzymatisk dissociationsbuffert vardera. rengör Petri-rätter och tillsätt iskall HBSS.- Samla embryona på E13,5 - 14,5 från tidsbetidade gravida möss och placera i en Petri-maträtt som innehåller kall HBSS.
- Halshugga embryona med tång.
- Placera embryonas huvuden i en ren Petri-skål som innehåller iskall PBS och ta bort huden från skallen med tång, med hjälp av förstoringsglas eller ett stereoskop.
- När hjärnan är synlig och rensad från huden, pressa ut den genom att trycka på sidorna med tång.
- Ta bort lillhjärnan, behåll endast förhjärnan och ta bort hjärnhinnorna med tång.
- Placera den isolerade vävnaden i den icke-enzymatiska dissociationsbufferten och upprepa dissekeringsstegen med de andra embryona. För in vävnaden från 2–3 djur i varje rör som innehåller bufferten.
- Inkubera vid 37 °C i 15 min under kontinuerlig skakning.
- Tillsätt 850 μL standardmedium efter inkubation och blanda genom pipettering tills suspensionen är fri från klumpar.
- Om icke-dissocierad vävnad fortfarande är synlig, vänta i 2 min på RT tills den deponeras längst ner i röret.
- När dissociationen är klar, räkna cellerna och plätera dem i suspension med en densitet av 10–50 celler/μL i en T-25- eller T-45-kolv som innehåller 10–30 ml neurosfärmedium, som hålls i vertikalt läge för att undvika cell vidhäftning.
-
Vuxna NSC-kulturer
- Offra djur genom livmoderhalscancer förskjutning.
- Samla hjärnor från 4-5 möss i ett 50 ml-rör som innehåller iskall HBSS.
- Placera hjärnan på en kall steril yta. Använd för detta ändamål en T-25-kolv fylld med vatten och placerad vid -20 °C över natten. Vid tidpunkten för experimentet, täck kolven med steril aluminiumfolie.
- Placera hjärnans ventrala sida nedåt, i rostro-caudal riktning, och ta bort luktlökarna med hjälp av ett rakblad.
- Skär 2–3 koronalskivor med 1 mm tjocklek, från cortex till optisk chiasma med hjälp av ett rakblad.
- Placera skivorna på den kalla ytan i ett ventro-dorsal-läge och identifiera corpus callosum och de två laterala ventriklarna.
- Använd förstoringsglas eller ett stereoskop, isolera väggarna i de laterala ventriklarna och var försiktig så att du inte bär bitar av corpus callosum.
- Placera den isolerade vävnaden i den enzymatiska dissociationsbufferten (5–10 ml) och inkubera vid 37 °C i 15 minuter.
- Blanda lösningen, pipettera flera gånger (minst 50) och inkubera igen vid 37 °C i 10 min.
- Neutralisera trypsin genom att tillsätta 5 ml standardkulturmedium och filtrera lösningen med ett 70 μm filter.
- Centrifugera den filtrerade lösningen i 5 min vid 400 x g.
- Återanvänd pelleten i sackaroslösningen och centrifugera i 10 min vid 500 x g.
- Återanvänd pelleten i BSA tvättlösning och centrifugera i 7 min vid 400 x g.
- Återanvänd pelleten i standardkulturmediet, räkna cellerna och utför plätering enligt beskrivningen ovan (i steg 2.1.10).
3. Primära neurosfärer
- Lägg till tillväxtfaktorerna (bFGF/EGF) varannan dag.
- Var 4–6:e dag (beroende på celltäthet) ändrar hälften av mediet enligt följande:
- Överför hela cellfjädringen till ett 15 eller 50 ml rör.
- Centrifugera i 5 min vid 400 x g.
- Ta bort hälften av volymen.
- Tillsätt samma mängd färskt medium, blanda försiktigt genom pipettering och lägg till tillväxtfaktorer.
4. Oligospheres
OBS: Oligodendrocytdifferentiering utförs enligt Chen protokoll10 med modifieringar.
- När neurosfärerna når en diameter på 100-150 μm är de redo att passeras. För att göra det, överför hela cellfjädringen till ett 15 eller 50 ml rör och centrifugera i 5 min vid 400 x g.
- Utvärdera snabbt diametern genom att ta bilder av sfärerna med hjälp av ett inverterat överfört ljusmikroskop och öppna dem med ImageJ-programvara.
- Klicka på Menyn Analysera och välj Skalningsfälti fönstret Verktyg .
- Ställ in 150 μm som bredd i mikron och jämför skalstången med sfärerna.
- Ta bort hela volymen genom inversion och återanvänd pelleten i 180 μL färskt standardkulturmedium. Pipettering 50 gånger för att möjliggöra uppdelning av sfärerna.
- Tillsätt 810 μL färskt standardkulturmedium, räkna cellerna och plätera om dem enligt beskrivningen för neurosfärerna.
- Tillsätt bFGF/PDGF-AA 10 ng/mL varannan dag.
- Var 4–6:e dag (beroende på celltäthet) ändrar hälften av mediet enligt följande:
- Överför hela cellfjädringen till ett 15 eller 50 ml rör.
- Centrifugera i 5 min vid 400 x g.
- Ta bort hälften av volymen.
- Tillsätt samma mängd färskt medium, blanda försiktigt genom pipettering och lägg till tillväxtfaktorer.
5. Plåtbeläggning
- Poly-D,L-ornitin/lamininbeläggning: minst 2 dagar före plätering av OPC: erna, tillsätt 50 μg/ml poly-D, L-ornitinlösning, utspädd i PBS, till varje brunn (40 μL/brunn för 96-brunnsplattor) och inkubera vid RT över natten.
- Följande dag, ta bort vätskan och tvätta tre gånger med destillerat sterilt vatten.
- Låt plattorna torka på RT över natten. Tillsätt följande dag en lamininlösning utspädd i PBS (5 μg/mL; 40 μL/brunn för 96-brunnsplattor) och inkubera i 2 timmar vid 37 °C.
6. Cellsådd
- När oligosfärerna når en diameter på 100–150 μm är de redo att separeras och sås på de poly-D,L-ornitin/lamininbelagda plattorna. För att göra det, överför hela cellfjädringen till ett 15 eller 50 ml rör och centrifugera i 5 min vid 400 x g (enligt punkt 4.1)
- Ta bort hela volymen genom inversion och återanvänd pelleten i 180 μL färskt standardkulturmedium. Pipettering 50 gånger för att möjliggöra uppdelning av sfärerna.
- Tillsätt 810 μL färskt standardkulturmedium och räkna cellerna.
- Ta bort lamininlösningen från brunnarna och platta cellerna med 3 000 cell/cm2 densitet (100 μL/brunn för 96-brunnsplattor).
7. OPC differentieringsinduktion
- Efter 3 dagar, ta bort hela mediet och tillsätt samma volym av oligodendrocytdifferentieringsmedium.
- Byt hälften av mediet var 4:e dag och tillsätt ny differentieringsblandning (T3/CNTF/NAC) varannan dag.
8. Induktion av inflammationsmedierad differentieringsblock
- Efter neurosfär dissociation och oligosphere produktion (avsnitt 4), tillsätt cytokinblandningen till odlingsmediet och hålla oligospheres utsatta för cytokiner för hela sfärerna bildandet steg.
OBS: Volymen beror på antalet celler, eftersom för de sfärer som bildar celler sås vid 10–50 celler/μL. - Om mediet behöver bytas, ändra hela volymen och tillsätt cytokinblandningen en gång till.
9. Induktion av syre-glukos deprivation celldöd
- Vid -1 DIV (2 dagar efter cellsådd i flerbrunnplattor), ta bort mediet och bevara det i en ny multiwellplatta.
- Tillsätt hälften av volymen (50 μL för 96-brunnsplattor) av OGD-medium (OGD-gruppen) eller färskt medium (kontrollgrupp). Den halva volymen används för att minska utbytet av syre mellan vätskan och luften.
- Placera OGD-gruppkulturerna i en lufttät hypoxikammare mättad med 95% N2 och 5% CO2. För att uppnå kammarens mättnad, låt gasblandningen flöda i 6 min vid 25 l/min innan du stänger kammarkörerna.
- Inkubera hypoxkammaren i inkubatorn i 3 timmar. Kontrollgruppen och plattorna som innehåller mediet som avlägsnats och bevarats i steg 9.1 bör också lämnas kvar i inkubatorn.
- Ta bort den glukosfria (OGD-gruppen) eller det nya mediet (kontrollgruppen) och tillsätt mediet borttaget och bevarat i steg 9.1.
10. Immunocytokemi
- Vid önskad tidpunkt, fixa cellerna med kall 4% paraformaldehyd i 20 min vid RT.
- Tvätta två gånger med PBS (10 min inkubation för varje tvätt vid RT).
- Inkubera 1 h vid RT med blockeringslösningen (PBS Triton 0,3% innehållande 1% BSA och 1% åsna/get normalt serum).
- Inkubera med primär antikroppsblandning(tabell 1), utspädd i PBS triton 0,3%, över natten vid 4 °C.
- Tvätta två gånger med PBS (10 min inkubation för varje tvätt vid RT).
- Inkubera med sekundär antikropp(tabell 1) lösning utspädd i PBS triton 0,3% tillsätt Hoechst 33258 i 30 min vid 37 °C.
- Tvätta två gånger med PBS (10 min inkubation för varje tvätt vid RT).
11. HCS-analys av cellens livskraft, härstamningssammansättning och härstamningsspecifik celldöd
OBS: HCS representativa bilder och arbetsflöde visas i figur 2A,B.
- Välj algoritmen Kupéanalys på programvarans huvudmeny (HCS Studio v 6.6.0) och välj Skanna på huvudmenyn Utveckla analys/skanningsplatta.
- I iDev-fönstret väljer du Nytt och väljer sedan Allmänt intensitetsmätningsverktyg i mallen Utveckla analys.
- Klicka på Skapa till höger på menyn och välj 10x-målet.
- Då öppnas menyn Konfigurera förvärv. I det här fönstret väljer du följande parametrar: a) antal kanaler: den första för Hoechst-färgningen (BGRFR_386) och en för varje härstamningsspecifik markör som används i reaktionen (b) välj programvarufokus på kanal 1 och autofokusintervall när 1 (c) väljer plåtmodellen från listan.
- I förvärvsmenyn tittar du på kvaliteten på färgningen i olika brunnar och olika fält och väljer exponeringstiden manuellt genom att välja Fast exponeringstid i menyn.
- När förvärvsparametrarna har ställts in väljer du Mini Scan högst upp på menyn och väljer tio fält per brunn i två brunnar per experimentellt tillstånd. Detta gör det möjligt att ställa in alla analysparametern i en delmängd av fälten för hela plattan.
- När minisökningen är klar klickar du på parametern Konfigurera analys för att konfigurera analysalgoritmen.
- Klicka på Konfigurera grupper till höger i fönstret och dra och släpp brunnarna i miniscanningen. Klicka på knappen Lägg till i underavsnittet Grupper för att konfigurera de olika grupperna.
- Följ arbetsflödet till vänster i fönstret steg för steg för att utveckla hela algoritmen. Välj först Processbild för varje kanal och klicka på Bakgrundsborttagning och på önskad nivå.
- Identifiera och välj först kärnorna genom kärnfärgning. Klicka på Identifiera primärt objekt – Kanal 1 för att välja de riktiga kärnorna och undvika att analysera artefakter och skräp. För detta ändamål, zooma in en representativ bild av kärnfärgning och kontrollera om kärnorna är väl omgivna av omkretsen som byggts av programvaran. Det är möjligt att ändra tröskelvärdet och tillämpa segmenteringsalgoritmer för att bättre identifiera enskilda kärnor.
- När kärnorna har definierats korrekt klickar du på följande steg: Validera primärt objekt. Välj Object.BorderObject.Ch1 om du vill undvika analys av kärnor vid kantlinjen för varje fältbild. Välj Object.Area.Ch1 och ta bort allt identifierat skräp eller stora objekt som motsvarar aggregat eller artefakter genom att flytta staplarna "låg" och "hög" på histogrammen.
- Kontrollera alla miniskannings representativa bilder av alla experimentella förhållanden för att vara säker på att de valda parametrarna passar med dem alla.
- Klicka på Identifiera fläckar för varje kanal som motsvarar de specifika härstamningsmarkörerna och välj ringvärdena: Bredd = 3 och Avstånd = 0. Detta gör det möjligt att identifiera cytoplasmatisk fluorescens. Enligt celltätheten kan dessa värden anpassas. Programvaran undviker automatiskt överlappning mellan intilliggande ringar.
- Välj Referensnivåer i arbetsflödet för att skapa analysen. Fastställandet av referensnivåerna kommer att göra det möjligt att automatiskt räkna kondenserade kärnor, baserat på kärnstorleken och den nukleära färgningsintensiteten, och av specifika markörpositiva celler, baserat på den cytoplasmatiska fluorescens som ringen har identifierat.
- Klicka först på Object.Area.Ch1. I mini-skanningsbilderna väljer du en kondenserad kärna och flyttar "LOW"-fältet på histogrammen för att välja som "kondenserad" alla kärnor under denna storlek.
- Klicka på Object.AvgIntensity.Ch1. I mini-skanningsbilderna väljer du en kondenserad kärna och flyttar "HIGH" -fältet på histogrammen för att välja som "kondenserad" alla kärnor ovanför denna fluorescensintensitet.
- Klicka på Object.RingAvgIntensity för varje kanal med härstamningsspecifika markörer. Välj i dina mini-skanningsbilder en positiv cell och flytta fältet "HIGH" på histogrammen för att välja som "positiv" alla celler ovanför denna fluorescensintensitet.
- Kontrollera alla miniskannings representativa bilder av alla experimentella förhållanden för att vara säker på att de valda parametrarna passar med dem alla.
- Välj Populationsteckentecken och välj Händelseunderpopulationpå den översta menyn och välj Händelseunderpopulation .
- Som typ 1-händelse väljer du ObjectAreaCh1 i den vänstra listan, klickar sedan på knappen OCH > och väljer slutligen ObjectAvgIntensityCh1. Detta gör det möjligt att identifiera kondenserade kärnor, som en kombination av låg yta och hög intensitet.
- Avmarkera alla skanningsgränser i samma fönster.
- Klicka på Välj funktioner som ska lagras på den översta menyn för att välja de parametrar som ska behållas i analysen.
- Välj Brunnsfunktioner och flytta från den vänstra listan till höger endast de önskade parametrarna: (a) SelectedObjectCountPErValidField (b) %EventType1ObjectCount (c) %High_RingAvgIntensity (För varje kanal för de specifika härstamningsmarkörerna).
OBS: Denna analys kommer att ge som avläsning det totala antalet celler, procentandelen kondenserade kärnor och procentandelen härstamningsspecifika positiva celler för varje analyserad markör på det totala cellnumret. Om procentandelen av de olika härstamningarna endast behövs på levande celler, är det möjligt att antingen behålla värdet "High_RingAvgIntensity" för kanalen (absolut antal positiva celler) och räkna om procentsatsen på totala cellnummer efter subtraktionen av procentandelen döda celler.- Alternativt är det möjligt att ta bort de döda cellerna från analysinställningen samma parametrar som används för att identifiera kondenserade kärnor (steg 11.14–11.15) på nukleivalidering (steg 11.11).
- Välj Scan Plate på huvudmenyn och klicka på plattsymbolen på skanningsinställningsundermenyn längst upp för att identifiera brunnen att analysera.
- Skriv namnet på experimentet och beskrivningen och när alla inställningar är klara trycker du på uppspelningssymbolen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den första fasen av kulturen kan variera i varaktighet, beroende på såddtäthet och om sfärerna är av fetalt eller vuxent ursprung. Dessutom uppvisar oligosfärer en minskad befolkningsdubbling jämfört med neurosfärer (figur 1B). Dessutom är sfärproduktionen från vuxen vävnad långsammare och det kan ta 2-3 veckor att generera oligospheres jämfört med fetala som kan ta 1-2 veckor, beroende på såddtätheten.
När hela differentieringsfasen av kulturerna har såtts kan den övervakas med hjälp av härstamningsspecifika antikroppar. Eftersom syftet med detta protokoll är att studera slutfasen av differentieringen, presenteras inte odlingssammansättningen vid 0 DIVs. Men under den första kulturfasen kommer cellerna fortfarande att vara nestinpositiva, som representerar neurala prekursorer, och majoriteten av cellerna är också NG2-positiva (OPCs)11. CNPase-positiva celler, motsvarande preOL-stadiet, kommer att kunna detekteras 3–6 dagar efter T3-medierad differentieringsinduktion, medan MBP-positiva celler kommer att visas mellan 6 och 12 DIVs (mogna OLs; se figur 2C för kultursammansättningen i slutet av differentieringsfasen).
HCS-analysen gör det möjligt att upptäcka varje enskild cell i kulturen genom kärnfärgning och analys av fluorescensintensiteten i de återstående kanalerna (figur 2A,B). Sammansättningen av kulturen i slutet av differentieringsfasen (12 DIVs) varierar beroende på om kulturerna är av fetalt eller vuxent ursprung, med fetala kulturer mer mottagliga för T3-medierad differentiering och når en högre andel mogna OLs12.
Under hela odlingsprocessen är cirka 40-50% av cellerna astrocyter (GFAP-positiva celler), medan en liten andel (mindre än 0%-10%) är nervceller (beta-III-tubulinpositiva celler; Bild 2C). Kultursammansättningen kan variera med 10% mellan olika kulturförberedelser. Vuxna och fetala kulturer skiljer sig åt för utbytet av mogna OLs produktion i slutet av differentieringsfasen, med fetala celler som visar hög andel mogna OLs, låg andel prekursorer och cirka 30%-40% av astrocyter. Å andra sidan presenterar vuxna kulturer mer astrocyter (cirka 45%-55%) och mindre differentierade celler efter 12 DIVs av differentiering induktion.
För att programvaran ska känna igen cellerna och tillhandahålla en korrekt opartisk analys av odlingskompositionen är det viktigt att såddtätheten är korrekt och undviker överlappning mellan angränsande celler. När NSC-härledda OPCs sås vid hög densitet tenderar de att aggregera mycket snabbt, vilket leder till hela ytan av välbefinnandet som upptas av astrocyter efter några dagar. Dessutom kommer mogna OLs med sin karakteristiska spindelnätsform inte att vara synliga på grund av det begränsade utrymmet (figur 3A, B).
Inflammation-medierade differentiering blocket är reproducerbar av denna in vitro analys och genererar en stark minskning av preOLs och mogna OLs upptäckt av CNPase och MBP färgning i både fetala och vuxna kulturer. En ökning av antalet OPC förekommer också i vuxna kulturer(figur 4A, B). Cytokinblandningskompositionen valdes från in vivo-experiment i en råtta modell av multipel skleros13, och testades som en in vitro-modell för inflammation-medierad differentiering block förekommer i denna sjukdom.
Medan fetala och vuxna OPCs visar samma sårbarhet för inflammatorisk cytokinexponering, är endast fetala kulturer känsliga för OGD-toxicitet (figur 5A, B), som visar en ökning av celldöd och differentieringsförsämring på grund av deras olika metaboliska profil14.
Figur 1: Neurala stamcellsbaserade oligodendrocyte föregångare cell kultur setup och differentiering protokoll. a)Experimentförfarandets system. (B) Representativa bilder av neurosfärer vid 2, 5 och 7 DIVs, och diagram som visar populationen fördubbling av neurosfärer och oligosfärer. Skalstapel: 100 μm. (C) Representativa bilder av sådda oligospher-härledda OPC som visar de olika stadierna av differentiering, från nestin- och NG2-positiva celler vid 0 DIV (neurala prekursorer/OPC), genom CNPase-positiva celler vid 6 DIVs (preOC) och CNPase/MBP dubbelpositiva celler i slutet av differentieringsfasen (12 DIVs; mogna OLs). GFAP-positiva celler (astrocyter) och en liten andel beta-III-tubulin positiva celler (nervceller) finns i hela kulturen. Skalningsstaplar: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Cellbaserade arbetsflöden för screeninganalys med högt innehåll och förväntad differentieringsläsning. (A) Representativa bilder av HCS förvärv av en hel brunn (96-brunnsplatta) och ett isolerat enda fält som förvärvats med ett 10x-mål för en 12 DIV-kultur av NSC-härledda OPC. (B) Arbetsflödessteg för HCS-analys, inklusive visualisering av kärnor (objekt), identifiering och konstruktion av kärnring för att identifiera den cytoplasmiska färgningen och marköridentifiering. (C) Diagram som visar den förväntade odlingssammansättningen i slutet av differentieringsfasen (12 DIV). Markörer för OPC (PDGFαR, NG2), preOLs (CNPase, APC), mogna OLs (MBP), astrocyter (GFAP) och nervceller (β-III-tubulin) visas för både fetala och vuxna härledda kulturer. Avrundade procenttal för varje cellmarkör ingår i diagrammet, observera att detta är ett representativt experiment och procentsatser kan vara olika cirka 5%–10%. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativa bilder med hög innehållsscreening av en kultur med hög densitet. (A) Representativ bild av en brunnsbild (96-brunnsplatta) som förvärvats av 10x-målet och markerats för MBP-uttryck i slutet av differentieringsfasen (12 DIV). (B) Representativ extraherad fältbild som belyser förekomsten av aggregerade celler och överlappande kärnor. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Förväntad effekt av cytokinbehandling på opc-kulturer som härrör från foster och vuxna. (A) Diagram som visar procentandelen variationer av opc-kulturer som härrör från foster och vuxna jämfört med standardkulturer, inklusive kvantifiering av OPC (NG2), preOLs (CNPase) och mogna OLs (MBP) i slutet av differentieringsfasen (12 DIVs). (B) Representativa bilder av vuxna kulturer i slutet av differentieringsfasen (12 DIVs) som behandlats med fordons- eller cytokinblandning och märkta för NG2 eller CNPase/MBP. Skalningsfält: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Förväntad effekt av OGD-exponering på fetala OPC-kulturer. (A) Diagram som visar procentandelen kondenserade kärnor som kvantifieras av cellbaserade HCS i kontroll (ctrl) och OGD-exponerade kulturer. (B) Representativa bilder av HCS-bearbetade objekt som belyser de identifierade kondenserade kärnorna (vita pilar). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Antikropp | Art | Utspädning | |
| anti-β-III-tubulin (R&D-system) | mus | 1:3000 | |
| anti-GFAP (Dako) | kanin | 1:1000 | |
| anti-NG2 (Millipore) | kanin | 1:350 | |
| anti-PDGFαR (Santa Cruz Bioteknik) | kanin | 1:300 | |
| anti-CNPase (Millipore) | mus | 1:500 | |
| IgG2b anti-APC, klon CC1 (Calbiochem) | mus | 1:100 | |
| Anti-MBP (Dako) | kanin | 1:250 | |
| Anti-nestin (Millipore) | mus | 1:500 | |
| Alexa Fluor 488-konjugerad antimus (ThermoFisher Scientific) | åsna | 1:500 | |
| Alexa Fluor 647-konjugerad antimus IgG2b (ThermoFisher Scientific) | get | 1:500 | |
| Alexa 568-konjugerad antikanin (ThermoFisher Scientific) | åsna | 1:500 | |
Tabell 1: Förteckning över primära och sekundära antikroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Myelinationens/remyelinationsprocessernas komplexa karaktär och demyelinerande händelser gör utvecklingen av prediktiva in vitro-system extremt utmanande. De mest använda in vitro-drogscreeningssystemen är mestadels mänskliga cellinjer eller primära rena OL-kulturer, med ökad användning av mer komplexa samkulturer eller organotypiska system15. Även om sådana system är kopplade till höginnehållsteknik, förblir rena OL-kulturer den metod som väljs vid utveckling av screeningplattformar16.
Den spontana blandade kulturen som beskrivs här representerar ett användbart in vitro-system, som tar hänsyn till alla huvudvariabler: fysiologisk T3-medierad OPC-differentiering, patologiska störningar i processen, andra cellulära komponenter och åldersrelaterade skillnader. Förfarandet innehåller ett antal variabler som härrör från cellernas ursprung (djurets ålder) och sfäroidbildning och manipulering. Faktum är att ett kritiskt steg är celltätheten hos NSCs sådd efter isoleringen från vävnaden, för i det optimala tillståndet bör en enda sfär härledas från en enda prolifererande cell. Eftersom vi har sett att isolerade NSC tenderar att aggregera och att de behöver sina egna utsöndrade parakrrinfaktorer, sådd dem i en rad 10-50 celler/ μL, i en t25 eller t75 kolv, är den bästa kompromissen för att undvika cellaggregering men fortfarande tillåta celler att kommunicera genom att utsöndra faktorer.
Teknikens huvudsakliga begränsningar är bristen på en funktionell axonal myelination och en direkt interaktion med nervceller, eftersom metoden endast tar hänsyn till OPC-differentiering tills stadiet av mogna OLs: CNPase / MBP-dubbla positiva celler med en spindelnätmorfologi. För detta ändamål är primära OPC som odlas på isolerade dorsala rotligalier fortfarande den viktigaste metoden17. Möjligheten att skilja dessa celler från djur i alla åldrar är dock en grundläggande punkt i translationsprocessen, eftersom det tillåter test av föreningar och skadliga stimuli på celler som isolerats från intresseåldern. Som beskrivits här, i själva verket, NSCs kan isoleras från både fetala och vuxna hjärnan. Eftersom utvecklingsmyelination och remyelination i vuxen ålder delar samma mål, dvs. att nå den nakna axon och skapa myelhymfetamin, var det ursprungligen hypotesen att de två processerna var identiska i alla aspekter, vilket genererade den så kallade rekapitulationshypotesen18. Det står emellertid nu klart att de två processerna inte kan anses vara likvärdiga och att cell inneboende åldersrelaterade skillnader förekommer och bör beaktas vid valet av den lämpligaste in vitro-modellen för den experimentella frågan19. Vuxna NSCs-härledda OPCs visar faktiskt starka skillnader i fysiologisk TH-driven differentiering och sårbarhet för skadliga stimuli14,20 samt primära OPCs21,22. Det finns också heterogenitet hos OPC- och OLs-populationen i vuxna vävnader, av särskild betydelse för patologiska tillstånd23. Protokoll för primära OPCs isolering från vuxna vävnader är tillgängliga24 och bör övervägas när den experimentella frågan riktar sig till molekyler som verkar på remyelination i vuxen ålder.
Differentieringen av OPC från nfc gör det möjligt att in vitro representera hela differentieringsprocessen, från odifferentierad föregångare till mogen OL. Denna process liknar in vivo-tillståndet, där TH är den viktigaste drivkraften för processen, som verkar genom specifika nukleära receptorer, och det tillåter experimentell interferens med denna mekanism för att efterlikna patologiska förhållanden i en translationell vy13.
Den slutliga grundläggande egenskapen hos modellen är den ständiga närvaron av astrocyter i hela kulturen. Även om detta gör kulturen svårare att analysera, utgör dess komplexa cellsammansättning en distinkt fördel. Det sätt på vilket astrocyter bidrar till svaret på skadliga händelser i blandade neuronala kulturer25 är allmänt känt, och frånvaron av denna huvudkomponent i CNS gör in vitro-systemet dåligt förutsägbart och översättningsbart. Å andra sidan, för denna egenskap, NSC-härledda kulturer har nackdelen att vara mindre enhetliga än encelliga typ system, och detta kan leda till en partisk analys. Den cellbaserade HCS-tekniken möjliggör dock en analys av hela kulturen och av alla cellpopulationer, vilket också tar bort randomiseringen av representativa fält för analys. Förutsatt att den cellkultur som används för experimentet har en tillförlitlig såddkvalitet kommer HCS att ge en fullständig bild av de experimentella förhållandena och generera statistiskt robusta data och ett antal automatiska fluorescensbaserade analyser.
Sammanfattningsvis beskriver det nuvarande protokollet förfarandet för isolering och differentiering av NSC-härledda OPCs från fetala och vuxna hjärnan. Hela protokollet tar cirka 30 dagar, beroende på djurens ålder och försöksmålen. I synnerhet kan sfärer som bildas från vuxen ursprung ta dubbelt tid jämfört med fetala, vid samma såddtäthet. Tiden på 15 dagar (från -3 till 12 DIVs) efter sådd på 2D-ytan för differentieringsinduktionen är dock en fast tid under alla förhållanden. Det fullständiga protokollet gör det möjligt att studera hela TH-medierade differentieringsprocessen i en komplex cellulär miljö, interferens genom specifika patologiska mekanismer (dvs. inflammatoriska cytokiner och HI) och därav följande testning av nya strategier som syftar till att övervinna dessa problem. Kopplingen av kulturmodellen med HCS-tekniken genererar en robust och översättningsbar screeningplattform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Med stöd av MIUR National Technology Clustersproject IRMI (CTN01_00177_888744) och Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014–2020.
Särskilt tack till IRET Foundation för att vara värd för det experimentella arbetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates - untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
References
- Michalski, J. P., Kothary, R.
- Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional considerations. Journal of Neuroscience Research. 94, 1411-1420 (2016).
- Raff, M. C., Lillien, L. E., Richardson, W. D., Burne, J. F., Noble, M. D. Platelet-derived growth factor from astrocytes drives the clock that times oligodendrocyte development in culture. Nature. 333, 562-565 (1988).
- Crawford, A. H., Chambers, C., Franklin, R. J. M. Remyelination: The true regeneration of the central nervous system. Journal of Comparative Pathology. 149, 242-254 (2013).
- Butt, A. M., Papanikolaou, M., Rivera, A.
- Baldassarro, V. A., Giardino, L., Calzà, L. Oligodendrocytes in a dish for the drug discovery pipeline: the risk of oversimplification. Neural Regeneration Research. 16, 291-293 (2021).
- Buchser, W. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. 1, Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. 1-80 (2014).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Ahlenius, H., Kokaia, Z. Isolation and generation of neurosphere cultures from embryonic and adult mouse brain. Methods in Molecular Biology. 633, Clifton, N.J. 241-252 (2010).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse Oligodendrocyte Precursor Cells. Nature Protocols. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure. Glia. 64, 1573-1589 (2016).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. Differential effects of glucose deprivation on the survival of fetal versus adult neural stem cells-derived Oligodendrocyte Precursor Cells. Glia. , 23750 (2019).
- Merrill, J. E. In vitro and in vivo pharmacological models to assess demyelination and remyelination. Neuropsychopharmacology. 34, 55-73 (2009).
- Lariosa-Willingham, K. D., et al. A high throughput drug screening assay to identify compounds that promote oligodendrocyte differentiation using acutely dissociated and purified oligodendrocyte precursor cells. BMC Research Notes. 9, 419 (2016).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 209, 219-226 (2012).
- Fancy, S. P. J., Chan, J. R., Baranzini, S. E., Franklin, R. J. M., Rowitch, D. H.
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS Myelin - from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18, 753-769 (2017).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation. Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).
- Leong, S. Y., et al. Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development. Neurology. 82, (2014).
- Bribián, A., et al. Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis. Journal of Clinical Medicine. 9, 1681 (2020).
- Jäkel, S., et al. Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis. Nature. 566, 543-547 (2019).
- Medina-Rodríguez, E. M., Arenzana, F. J., Bribián, A., de Castro, F. Protocol to isolate a large amount of functional oligodendrocyte precursor cells from the cerebral cortex of adult mice and humans. PloS One. 8, 81620 (2013).
- Baldassarro, V. A., et al. Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases. Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).
