Summary
Este protocolo descreve a conversão de fibroblastos de pele em míobios e sua diferenciação em miotubes. As linhas celulares são derivadas de pacientes com distúrbios neuromusculares e podem ser usadas para investigar mecanismos patológicos e testar estratégias terapêuticas.
Abstract
Investigações sobre a fisiopatologia e alvos terapêuticos em distrofias musculares têm sido dificultadas pela capacidade proliferativa limitada de míbios humanos. Vários modelos de camundongos foram criados, mas ou eles não representam verdadeiramente a fisiopatologia humana da doença ou não são representativos do amplo espectro de mutações encontradas em humanos. A imortalização dos mizadolas primários humanos é uma alternativa a essa limitação; no entanto, ainda depende de biópsias musculares, que são invasivas e não estão facilmente disponíveis. Em contraste, as biópsias de pele são mais fáceis de obter e menos invasivas aos pacientes. Os fibroblastos derivados de biópsias de pele podem ser imortalizados e transdiferenciados em míferas, fornecendo uma fonte de células com excelente potencial miogênico. Aqui, descrevemos um método de reprogramação rápida e direta do fibroblasto em uma linhagem miogênica. Os fibroblastos são transduzidos com dois lentivírus: hTERT para imortalizar a cultura primária e um MYODindutível tet , que após a adição de doxiciclina, induz a conversão de fibroblastos em míbios e, em seguida, miotubes maduros, que expressam marcadores de diferenciação tardia. Este protocolo de transdiferenciação rápida representa uma poderosa ferramenta para investigar mecanismos patológicos e investigar bioterapias inovadoras baseadas em genes ou farmacológicas para distúrbios neuromusculares.
Introduction
Modelos celulares obtidos diretamente dos tecidos humanos são úteis para modelar muitas doenças genéticas humanas, com a vantagem de ter o contexto genômico original e, em muitos casos, reproduzir as mesmas marcas moleculares e celulares observadas nos pacientes. No campo das doenças neuromusculares, as biópsias musculares têm sido uma grande fonte de míbios humanos e têm ajudado na elucidação de mecanismos patológicos. Além disso, são uma ferramenta importante para testes in vivo de drogas e terapias genéticas. Por um lado, a derivação de míobios de fragmentos musculares é relativamente fácil. Por outro lado, a cultura e a manutenção dos myoblasts primários são desafiadoras, devido à sua taxa limitada de proliferação e senescência replicativa in vitro1. Uma alternativa para essas limitações é imortalizar mioblasts com a inserção da telomerase humana (hTERT) e/ou kinase dependente de cíclina 4(CDK4) genes2,3, com preservação das características do músculo esquelético4. No entanto, a obtenção de míbios primários ainda depende da biópsia muscular, procedimento cirúrgico com desvantagens para os pacientes, que, em muitos casos, têm seus músculos em degeneração avançada. Assim, o músculo desses pacientes é composto por uma proporção significativa de tecido fibroso e/ou adiposo e produz menos células musculares, exigindo a purificação das células anteriormente à imortalização.
Em contraste com as biópsias musculares, as biópsias da pele são mais acessíveis e são menos prejudiciais aos pacientes. Os fibroblastos primários podem ser derivados de fragmentos de pele in vitro. Embora os fibroblastos não sejam afetados principalmente por mutações que causam distúrbios neuromusculares, eles podem ser transdiferenciados em míobios. Isso pode ser alcançado pela inserção do gene Myod, um fator de transcrição regulatória miogênica5. Neste manuscrito, descrevemos o protocolo para obter míbios transdiferenciados, desde o estabelecimento de culturas de fibroblastos até a obtenção de miótubos diferenciados (um resumo representativo do método é retratado na Figura 1).
O teste pré-clínico de estratégias terapêuticas depende de modelos celulares e animais portadores de mutações semelhantes às mutações encontradas em pacientes humanos. Embora o desenvolvimento de modelos animais tenha se tornado mais viável com o avanço de tecnologias de edição de genes como o CRISPR/Cas96,ainda é desafiador e caro. Assim, as linhas celulares derivadas do paciente são uma opção acessível para ter modelos, abrangendo o grande espectro de mutações de doenças como distrofia muscular de Duchenne (DMD). A obtenção e criação de modelos celulares são cruciais para o desenvolvimento de terapias personalizadas para tais patologias.
Entre as terapias personalizadas que têm sido investigadas, as estratégias de pular exon é uma das promissoras para diferentes distrofias musculares7,8. Esta estratégia consiste em produzir uma proteína mais curta, mas funcional. Isso é feito escondendo a definição do exon para o emendamento, excluindo assim o exon mutado do mensageiro final. Esta é uma tecnologia muito promissora que foi aprovada pela FDA para DMD. Assim, também descrevemos neste protocolo, métodos para transfetar mioblasts com duas tecnologias diferentes de exon ignorando: oligonucleotídeos antissamerados (AON) e vírus associado ao U7snRNA-adeno(AAV). A transfecção AON é uma boa ferramenta para a triagem inicial de várias sequências projetadas para promover o exon skipping9. No entanto, a atividade das AONs é transitória. Para obter uma expressão sustentada de sequências antissamparadas, também exploramos pequenas RNAs nucleares (snRNAs) combinadas com AAV, permitindo a localização nuclear e a inclusão no maquináriode emendas 10. U7 é um snRNA envolvido no processamento de mRNA de histona que pode ser projetado para ligar proteínas que irão redirecioná-lo para o emendatório e entregar sequências antissameradas11. O uso de U7 snRNAs modificados em combinação com vetores AAV supera limitações de AONs resultando em uma expressão contínua das AONs e melhor transdução de tecidos de interesse12. Usamos células derivadas de pacientes DMD para este protocolo para ilustrar a estratégia de exon-skipping.
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Protocol
Todos os experimentos e biópsias foram realizados seguindo as normas éticas das instituições envolvidas sob a aprovação do Conselho Nacional de Revisão Institucional do Hospital Infantil.
1. Iniciação da cultura dos fibroblastos dérmicos
- Criação da cultura dos fibroblastos
- Alíquota de 10 mL de meio fibroblasto(Tabela 1)em tubos cônicos de 15 mL. A biópsia da pele deve ser colocada e transportada neste meio. A biópsia pode ser armazenada a 4 °C até ser processada, preferencialmente no mesmo dia.
NOTA: Use a biópsia da pele dentro de 24-36 horas para evitar o crescimento potencial da contaminação. - Aspire a mídia do tubo e enxágue a biópsia com 10 mL 1X PBS (temperatura ambiente) três vezes. Após a terceira lavagem, deixe o PBS no tubo.
- Despeje o PBS e a pele em um prato de 10 cm2.
- Usando bisturis estéreis, corte a biópsia em fragmentos tão pequenos quanto possível.
- Usando uma pipeta, transfira um fragmento de pele individual e solte-o em um prato limpo de 10 cm2. Coloque de 10 a 12 fragmentos por prato.
- Aspire o excesso de PBS ao redor de cada fragmento. Tenha cuidado para não aspirar o fragmento.
- Cubra os pratos parcialmente com a tampa e deixe os fragmentos de pele secarem por 5-20 min. Não permita que os fragmentos sequem excessivamente.
- Uma vez que os fragmentos estejam secos, incline o prato a 45 graus e adicione lentamente 12 mL de fibroblasto médio ao canto. Abaixe o prato, distribuindo cuidadosamente a mídia para que os fragmentos não levantem pela mídia.
- Coloque os pratos na incubadora (37 °C, 5% CO2). Substitua a mídia em 5-7 dias, e uma vez por semana depois.
- Observe os fibroblastos emergindo do fragmento(Figura 2) e, uma vez confluente, passar as células para 75 cm2 frascos. Retire o meio, enxágue as células com PBS e adicione 1 mL 0,25 % trypsin. Incubar a 37 °C por 5 min ou até que todas as células sejam levantadas. Adicione 10 mL de crescimento do fibroblasto para inibir a trippsina e transfira as células para um novo frasco.
NOTA: Para a nomenclatura do número de passagem, p1 é estabelecido quando os primeiros fibroblastos que emergiram da biópsia da pele são transferidos para um novo frasco para proliferação.
- Alíquota de 10 mL de meio fibroblasto(Tabela 1)em tubos cônicos de 15 mL. A biópsia da pele deve ser colocada e transportada neste meio. A biópsia pode ser armazenada a 4 °C até ser processada, preferencialmente no mesmo dia.
- Criopreservação de linhas primárias de fibroblasto
- Uma vez que o frasco de 75 cm2 seja confluente, enxágüe-o com 10 mL 1X PBS e aspire PBS.
- Adicione 3 mL de 0,25 % trypsin à superfície celular. Coloque o frasco na incubadora por 5 minutos. Verifique os frascos sob o microscópio para ver se as células estão levantadas. Se não, coloque o frasco de volta na incubadora por mais 5 minutos.
- Uma vez que as células são separadas, adicione 7 mL de mídia fibroblasto ao frasco e pipeta para cima e para baixo para resuspend as células. Colete as células em um tubo cônico de 50 mL.
- Prepare 100 μL aliquot de azul trypan, e remova 100 μL da amostra que está sendo criopreservada, misture com o azul trypan. Carregue a mistura no hemócito para contar. Conte as células em quatro campos diferentes do hemótmetro sob o microscópio. Para calcular o número total de células, use a fórmula: (células contadas/100) * volume de cultura.
- Gire os tubos cônicos a 300 x g por 10 minutos em temperatura ambiente ou 4 °C.
- Aspire fora do médio e resuspengue as células no volume adequado de meio de congelamento: 1 mL por cada 1 milhão de células/frasco. Pipeta para cima e para baixo para homogeneizar e distribuir 1 mL para cada criovial rotulado.
- Coloque os frascos na caixa de congelamento e deixe os frascos congelarem a uma taxa de 1 °C/min a -80 °C durante a noite.
- No dia seguinte, transfira os frascos para um tanque de nitrogênio líquido ou um congelador de -150 °C.
2. Estabelecimento da linha celular FibroMyoblasts (FM)
- Os fibroblastos primários de sementes a aproximadamente 30% da confluência em dois poços de uma placa de 12 poços (2 x 104 células/bem) a fim de ter cerca de 50% de confluência no dia seguinte.
- Para a transdução lentiviral, adicione 2 a 5 x 109 vg (partículas do genoma viral) de lentivírus hTERT-puromicina em 400 μL de meio fibroblasto. Para o segundo poço, adicione apenas 400 μL de meio fibroblasto. Adicione 1 mL de mídia no dia seguinte.
NOTA: Foram obtidos plasmídeos para produção de lentivírus do grupo que publicou o chaouch et al,artigo de 2009. Eles também são descritos individualmente em Aure et al, 200713 para plasmídeo hTERT e Barde et al, 200614 para o sistema Tet-on utilizado para o design de plasmídeo MyoD. Eles foram obtidos graças a um Acordo de Transferência de Material com Genethon, França (entre em contato com o Dr. Vincent Mouly para obter esses plasmídeos - vincent.mouly@upmc.fr). Resumidamente, o hTERT consiste na variante hTERT 1 conduzida por um promotor cmv, enquanto a puramicina é conduzida por um promotor pgk. O plasmídeo MyoD contém uma variante MyoD 1 impulsionada por um promotor CMV sob o controle do repressor rtTA2. Este plasmídeo também contém a seleção de higromicina expressa graças ao promotor SV40.
Os lentivírus foram produzidos utilizando-se a produção lentiviral regular (ver Wang e McManus JoVe protocolo15). Resumidamente, mdl-helper, Rev-Helper, SVS-G-helper foram transfectados através de precipitação de cloreto de cálcio também de plasmídeos hTERT ou MyoD. Depois das 48h, o supernaspeso foi coletado, e depois por mais três dias. Todos os supernantes foram então concentrados pela ultracentrifugação. A pelota foi então resuspended em buffer Tris-HCL+NaCl+EDTA. A estimativa de Titer foi avaliada pelo ensaio padrão lentivírus qPCR. - Um ou dois dias depois, transfira as células para uma placa de 6 poços e plante-as até atingir 60-70% de confluência.
- Suplemente o meio do fibroblasto com 1 μg/mL de puramicina e adicione 2 mL a cada poço.
- Mantenha as células em seleção até que todas as células do poço de controle estejam mortas (até 12 dias), mudando de mídia a cada 2-3 dias. Passar as células da placa de 6 poços em dois pratos de 10 cm2 para maior proliferação.
- Congelar frascos de fibroblastos após a seleção. Rotule como F(hTer).
- Fibroblastos expressos de sementes (F(hTer)) a cerca de 30% de confluência no meio fibroblasto, em dois poços de uma placa de 12 poços, para ter cerca de 50% de confluência no dia seguinte.
- Para a transdução de lentivírus, misture 2 a 5 x 109 vg de lentivírus MyoD-hygromiccinB em 400 μl de meio fibroblasto e adicione aos respectivos poços; ao terceiro poço adicione 400 μl de fibroblasto médio. Adicione 1 mL de meio no dia seguinte.
- Um ou dois dias depois, transfira as células para uma placa de 6 poços e cresça até 60-70% de confluência.
- Suplemente o meio de crescimento do fibroblasto com higromicina B (400 μg/mL) e adicione 2 mL a cada poço.
- Mantenha as células em seleção até que todas as células do poço de controle estejam mortas (até 12 dias), mudando de mídia a cada 2-3 dias.
- Congelar frascos de fibroblastos após a seleção. Rótulo como FM seguido do número/nome de identificação celular.
3. Protocolo de transdiferenciação
- A semente transduziu FM para 10 cm2 pratos com 30-40% de confluência. Em uma placa de 12 poços, sementes 6 x 104 células (isso depende da linha celular individual).
NOTA: Para a imunostenção, as células de sementes em tampas de vidro ou lâminas de câmara revestidas com Matrigel. Diluir o Matrigel à 1:10 em meio DMEM, adicione um volume suficiente para cobrir a superfície e deixe os slides sentarem-se à temperatura ambiente por uma hora. Aspire logo antes de semear as células. - Para indução de myoblasts, quando os fibroblastos atingiram 70% de confluência (Figura 3A),enxágue a superfície celular com PBS e adicione mídia de míbio fresco suplementada com doxiciclina fresca de 8 μg/mL.
NOTA: O sucesso da diferenciação está comprometido após 80% de confluência. - Depois de dois a três dias depois, as células são 90-95% confluentes e sua morfologia terá mudado(Figura 3B). Enxágüe a superfície celular com PBS e adicione uma nova mídia de diferenciação complementada com doxiciclina fresca de 8 μg/mL.
- Continue a mudar a mídia a cada 2-3 dias sem passar até que os miotubes sejam estabelecidos (confirme via morfologia) (Figura 3C).
- Sete a dez dias após o início da diferenciação do miotube, as células devem ser totalmente diferenciadas e podem começar a se desprender ou morrer. Antes que isso aconteça, colhe miotubes para análise suplementar.
NOTA: O curso de tempo da formação do miotube depende da linha celular. Mutações em proteínas relacionadas com músculos podem interferir no potencial miogênico. Quando os miotubes começam a parecer brilhantes e parecem brancos nas bordas é um sinal que eles estão começando a se desprender(Figura 4). - Para colher miotubes, coletar mídia e transferi-lo para um tubo cônico de 50 mL. O meio pode conter miotubes que se separaram.
- Enxágüe os miotubes com PBS de 5 mL e transfira PBS para o tubo de 50 mL.
- Adicione 3 mL de 0,25 % trypsin à superfície celular. Coloque o prato na incubadora por 5 minutos. Verifique o prato sob o microscópio para ver se as células são levantadas. Se não, coloque-o de volta na incubadora por mais 5 minutos.
- Uma vez que as células são separadas, adicione 7 mL de mídia fibroblasto ao prato e pipeta para cima e para baixo para resuspend as células. Colete as células ao tubo cônico de 50 mL.
- Centrifugar a 1.200 x g por 7 min a 4 °C.
- Aspire cuidadosamente o líquido, sem perturbar a pelota. Armazene as pelotas a -80 °C até que seja mais processamento.
4. Imunostaining de miotubes diferenciados
NOTA: Para imunossuiragem, cresça as células em tampas de vidro ou lâminas de câmara, como observado acima.
- Uma vez que os miotubes estejam totalmente diferenciados, aspire a mídia e enxágue cuidadosamente os slides com PBS. Aspirar PBS desligado.
- Adicione 4% de PFA fresco (500 μL por poço de uma placa de 12 poços) e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Aspirar PFA desligado.
- Enxágüe com 1 mL PBS.
- Incubar com 0,2 M de glicecina em temperatura ambiente, por 10 min. Aspirar glicina fora.
- Permeabilize com PBS 0,5% TritonX-100 (300 μL/bem de uma placa de 12 poços), por 10 minutos com agitação suave.
- Bloqueie com 300 μL/poço de solução de bloqueio, por 10 minutos com agitação suave.
- Incubar com anticorpo primário diluído 1:50 em 300 μL de solução de bloqueio, por 2 horas em temperatura ambiente, com agitação suave.
- Enxágüe três vezes com 1 mL/poço de PBS por 5 min, com agitação suave.
- Incubar com anticorpo secundário diluído 1:500 em 300 μL de solução de bloqueio, por 1 hora, em temperatura ambiente, com agitação suave. Cubra a placa com papel alumínio.
- Enxágüe três vezes com 1 mL/poço de PBS por 5 min, com agitação suave.
- Incubar com DAPI diluído em PBS por 10 minutos. Enxágüe três vezes com 1 mL/poço de PBS.
- Adicione uma gota de meio de montagem a um slide de vidro. Remova a mancha de cobertura com fórceps e coloque-a de frente para baixo na gota do meio de montagem.
- Inverta deslize sobre uma toalha de papel e pressione suavemente para remover bolhas e excesso de meio de montagem.
- Sele os slides com esmalte e guarde a 4 °C até a imagem.
5. Transfecção de oligonucleotídeos antissamerais
NOTA: O protocolo abaixo é para transfecção de uma placa de 6 poços. Ajuste os volumes de acordo para placas menores ou maiores. A transfecção é feita em myoblasts 100% confluentes quando as células estão prontas para a etapa de diferenciação.
- Aspire a mídia de crescimento myoblast e enxágue as células com 1 mL PBS.
- Adicione 500 μL/poço de mídia OptiMEM e incubar a 37 °C por 1 hora.
- Diluir o oligonucleotídeo antissamparado (AON) em 100 μL de OptiMEM à concentração final desejada (ou seja, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM). Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos.
NOTA: Este protocolo é otimizado para 2'omethyl-fosphorothioate AONs. - Misture a lipofectamina com OptiMEM (volume final de 100 μL) para dar uma razão final de 1:1 (DNA μg: lipofectamina μL). Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos.
- Combine a lipofectamina diluída com o AON diluído. Misture suavemente por pipetação e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente para permitir uma formação complexa. Evite bolhas de ar.
- Adicione 200 μL de lipofectamina e mistura AON aos respectivos poços. Incubar as células durante a noite a 37 °C, 5% de CO2.
- No dia seguinte, remova a mistura de transfecção e adicione 2 mL de mídia de diferenciação quente complementada com doxiciclina.
- Coletar células pelo menos três dias depois para extração de RNA ou sete a 21 dias em caso de análise proteica.
NOTA: Os dias de diferenciação necessários para detectar RNA e/ou expressão proteica podem variar de acordo com o gene de interesse ou a linha celular. No caso do DMD,é possível detectar seu mRNA dentro de três dias. A detecção de proteínas de distrofina requer pelo menos sete dias. Isso vai variar dependendo da linha celular. Altas concentrações de AON e reagente de transfecção podem impactar a transdiferenciação.
6. Transdução AAV1-U7
NOTA: Este protocolo foi otimizado para placas de 6 poços. Ajuste os volumes proporcionalmente à área de superfície da cultura. A transdução é feita em myoblasts 100% confluentes quando as células estão prontas para a etapa de diferenciação. AAV1 é o sorotipo AAV com a melhor capacidade de transdução de míbios cultivados.
- Aspire o meio de crescimento myoblast e enxágue as células com 1 mL PBS.
- Diluir 0,5-1 x 1011 partículas virais de AAV1-U7 em 700 μL de mídia de diferenciação quente complementada com doxiciclina.
NOTA: Usamos qPCR para determinar a concentração viral. A quantidade de vírus a ser usado pode variar dependendo do método de quantificação e deve ser determinada anteriormente usando um ensaio de repórter. - Adicione a mistura viral ao poço, soltando-a de forma homogênea.
- No dia seguinte, adicione 1,3 mL de mídia de diferenciação quente complementada com doxiciclina.
- Recolher as células pelo menos três dias depois para extração de RNA ou sete a 21 dias em caso de análise proteica.
7. Extração de RNA
NOTA: Todo o material utilizado durante esta etapa deve ser livre de RNase.
- Adicione 500 μL de TRIzol por pelota e pipeta para cima e para baixo várias vezes para garantir que as células sejam homogêneas.
- Transfira o lise celular em um tubo de 1,5 mL e incubado por 5 min a temperatura ambiente.
- Adicione 100 μL de clorofórmio e agite manualmente por 15 s. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Centrifugar a 12.000 x g para 15 min a 4 °C. Colete a fase aquosa (superior) e transfira-a para um novo tubo de 1,5 mL.
- Para 1 volume da fase aquosa, adicione 1 volume de etanol 100% e misture por pipetação.
NOTA: Recomendamos a purificação e concentração da coluna. - Transfira a amostra para uma coluna Zymo-Spin IC em um tubo de coleta e centrífuga a 12.000 x g para 30 s. Descarte o fluxo.
- Para a digestão DNase I na coluna, pré-lave a coluna com 400 μL RNA Wash Buffer. Centrifugar a 12.000 x g por 30 s. Descarte o fluxo.
- Prepare 40 μL de mistura de reação DNase por amostra. Misture 5 μL DNase I com 35 μL de buffer de digestão de DNA.
- Adicione a mistura diretamente à matriz da coluna. Incubar em temperatura ambiente por 15 minutos.
- Adicione 400 μL RNA Prep Buffer à coluna e centrífuga a 12.000 x g para 30 s. Descarte o fluxo.
- Adicione 700 μL RNA Wash Buffer à coluna e centrífuga a 12.000 x g para 30 s. Descarte o fluxo.
- Adicione 400 μL RNA Wash Buffer à coluna e centrífuga a 12.000 x g por 2 min para garantir a remoção completa do tampão de lavagem. Transfira cuidadosamente a coluna para um tubo de 1,5mL sem RNase.
- Adicione 15 μL de água sem nuclease diretamente à matriz da coluna. Incubar por 5 min e centrífuga a 12.000 x g por 1 minuto.
NOTA: Colete o RNA elucido e aplique-o novamente na coluna para aumentar o rendimento. Centrifugar a 12.000 x g por 1 minuto. - Coloque amostras no gelo e quantifique as amostras em uma nanodrop.
- Armazene amostras a -80 °C.
8. Análise RT-PCR
NOTA: Nesta etapa, apresentamos uma sugestão de reagentes para detectar a expressão de distrofina mRNA, mas pode ser facilmente adaptada a outros reagentes de escolha.
- Transcrição reversa
- Descongele todos os reagentes e mantenha-os no gelo.
- Prepare uma mistura com 4 μL de tampão de reação de 5x, 2 μL de dNTP Mix (10 mM), 1 μL de Inibidor RiboLock RNase e 1 μL de RevertAid RT.
- Misture o tubo suavemente e centrífuga brevemente.
- Em tubos PCR de 0,2 mL, adicione o volume adequado de RNA para ter 1 μg por reação. Adicione água sem nuclease q.s.p 12 μL. Inclua um tubo sem a transcriptase reversa como controle negativo e um tubo com água sem nuclease em vez de RNA.
- Distribua 8 μL de mistura de reação por tubo. O volume total é de 20 μL.
- Coloque tubos em um termociclador e incubar por 5 min a 25 °C seguido de 60 min a 42 °C. Pare a reação aquecendo a 70 °C por 5 minutos.
- Coloque os tubos no gelo ou a -20 °C para um armazenamento mais longo.
- PCR
NOTA: Projete primers em junções de exons de preferência.- Reagentes de vórtice e gire antes de usar.
- Prepare uma mistura mestre usando primer avançado de 0,5 μL (25 μM), 0,5 μL de primer reverso (25 μM), 12,5 μL 2x PCR Master Mix e 8,5 μL de água sem nuclease por amostra.
- Alíquota de 22 μL de mistura mestre em um tubo para cada amostra.
- Adicione 3 μL de cDNA (150 ng) ao seu respectivo tubo PCR. Adicione 3 μL de água sem nuclease ao tubo de controle negativo do PCR.
- Vórtice e gire os tubos PCR.
- Incubar os tubos em um termociclador a 95 °C por 3 min, 95 °C para 30 s, (Tm-5) °C para 30 s, 72 °C para (1 min/kb) 34 vezes, 72 °C por 5 min.
NOTA: A temperatura de ressarcial ideal pode ser determinada empiricamente. Para a mistura mestre sugerida, subtraia 5 °C da temperatura de fusão da cartilha. - Carregue 12 μL da reação pcr em um gel de agarose e congele as amostras a -20 °C.
9. Detecção de expressão de distrofina por Mancha Ocidental
NOTA: Este protocolo é otimizado para distrofina, uma grande proteína de membrana. Condições específicas podem ser necessárias para diferentes proteínas.
- Extração de proteínas
- Após 7-21 dias de diferenciação, colete células com 5 mL de PBS com 100 μL 0,5 M EDTA e 50 μL inibidores de protease. Incubar a 37 °C até que as células se desprendem. Centrifugar a 1.200 x g por 5 min a 4 °C. Es clique para congelar a pelota mergulhando o tubo em nitrogênio líquido. Armazene a pelota a -80 °C ou prossiga para a etapa de lise.
- Prepare o tampão de lise adicionando 1% de digitonina, 1% inibidor de protease, 10% inibidor de fosfatase e tampão base ao volume total (60 μL por pelota de célula).
- Adicione 60 μL de tampão de lise à pelota celular, no gelo. Sonicate para 5 s. Deixe sentar no gelo por 8 s. Repita a sônicação e os passos de descanso duas vezes.
- Incubar amostras no gelo por 30 minutos.
- Centrifugar a 14.000 x g por 20 min a 4 °C.
- Transfira o supernatante para tubos limpos.
- Quantifique amostras por ensaio de ácido bicinchonínico (BCA), seguindo as instruções do fabricante.
- Misture a solução proteica com o volume apropriado do tampão Laemmli. Faça alíquotas de 100 μg. Se necessário, ajuste o volume para 25 μl com tampão de lise base. Armazene amostras a -80 °C.
- Mancha ocidental
- Descongelar amostras no gelo.
- Desnaturar as amostras a 100 °C por 5 minutos, depois esfriá-las no gelo, girar para baixo.
- Diluir o 20X Tris-acetato SDS em 200 mL dH2O e adicionar 500 μL antioxidante.
- Prepare o gel de poliacrilamida tris-acetato de 3-8% removendo o pente e enxaguando com dH2O. Monte o gel no aparelho de eletroforese. Encha a câmara interna com tampão de corrida.
- Carregar 5 μL de escada proteica e 25 μL de amostra no gel. Encha a câmara externa com tampão de corrida.
- Corra a 80 V por 1h a 4 °C. Em seguida, a 120 V por 2h a 4 °C.
- Prepare 3 L de tampão de transferência 1X com 150 mL de metanol de 20X, 150 mL de tampão de transferência de 20X e 2.700 mL de dH2O. Esfrie-o até 4 °C.
- Corte 4 pedaços de papel filtro e um pedaço de membrana nitrocelulose. Mergulhe o filtro de papel e a membrana em uma bandeja com tampão de transferência.
- Retire suavemente o gel da caixa e monte-o no aparelho de transferência com papel filtro, membrana e esponjas. O gel é colocado no lado negativo e a membrana no lado positivo.
- Executar transferência a 300 mA, mexendo, a 4 °C, durante a noite.
- Bloqueie a membrana em 10 mL de tampão de bloqueio por 1h com agitação suave, em temperatura ambiente.
- Prepare a solução de anticorpos primários com 10 mL de tampão de bloqueio e 50 μL de anticorpo distrofina (1:200).
- Descarte o tampão de bloqueio e adicione a solução de anticorpos primário. Incubar com agitação suave por pelo menos 2 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
- Enxágüe a membrana três vezes com 0,1% de Tween PBS, por 5 minutos com agitação suave.
- Prepare a solução de anticorpos secundários utilizando 10 mL de solução de bloqueio, 2 μL de anticorpo anti-coelho (1:5000) e 20 μL de 0,2% Tween.
- Adicione a solução de anticorpos secundários à membrana. Incubar por 1h com agitação suave, coberta com papel alumínio para proteger da luz.
- Descarte a solução de anticorpos e enxágue a membrana 3 vezes com 0,1% Tween PBS, por 5 minutos com agitação suave, protegido da luz.
- Exposição e imagem da membrana em um dispositivo de imagem.
- Manche a membrana para proteína total com revers 700 mancha total de proteína, seguindo as instruções do fabricante.
NOTA: A detecção de distrofina por manchas ocidentais depende da idade/mutação do paciente e da capacidade da célula de fundir e ficar presa tempo suficiente para acumular distrofina suficiente.
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Representative Results
Este protocolo mostra como estabelecer culturas de fibroblastos derivadas da pele humana e convertê-las em míbios e, em seguida, em mobotos diferenciados. Este tipo de linha celular é extremamente útil para o estudo de distúrbios neuromusculares e testes in vitro de terapias potenciais.
Uma representação esquemática da conversão do fibroblasto é mostrada na Figura 1. A Figura 2A mostra um fragmento de pele e os fibroblastos emergindo dela. Os fibroblastos devem ser passados para um novo prato quando a confluência é atingida(Figura 2B). A Figura 3A mostra a confluência ideal dos fibroblastos antes de mudar para o meio de crescimento myoblast suplementado com doxiciclina. As células devem ser cerca de 70% confluentes porque ainda proliferam durante o processo de conversão. Se as células estiverem acima de 80% de confluentes, a diferenciação pode ser comprometida. A conversão em myoblasts leva de dois a quatro dias, e é confirmada pela observação da morfologia. As células tornam-se alongadas e orientadas paralelamente, como mostra a Figura 3B. Após a adição do meio de diferenciação, os mioblasts param de se dividir e começam a se fundir para formar miótubos multinucleados(Figura 3C). Quando as bordas dos miotubes parecem brancas e brilhantes, elas estão prestes a se desprender(Figura 4). Neste ponto, coletar ou consertar as células.
O sucesso de diferenciação variará entre diferentes linhas celulares/mutações. A imunossuagem de proteínas musculares expressas por miotubes maduros confirma o potencial miogênico dos fibroblastos convertidos (Figura 5). A análise de RNA-Seq comparando miotubes FM e músculo esquelético mostrou expressão de alto nível de transcrições dos genes da cadeia de miosina embrionária (MYH3) e neonatal (MYH8) e boa correlação geral com músculo(Figura 6). Transcrições para as proteínas sarcomericas gigantes titin (TTN), nebulina (NEB) e obscurina (OBSCN) também são expressas por miotubes FM, indicando a regulação dessas grandes transcrições envolvidas na miofibrillogênese. Assim, as células FM possuem um perfil de expressão específico dos músculos, demonstrando que são um substituto útil e confiável para linhas celulares derivadas musculares.
Para ilustrar o exon skipping, usamos este protocolo em uma das duplicações de exon mais frequentes no gene DMD. A duplicação do exon 2 leva à interrupção do quadro de leitura DMD, portanto, a restauração do quadro de leitura após o salto de exon deve levar à expressão da distrofina de comprimento completo. No entanto, também é possível que pular o exon 2 seja muito eficiente, resultando em uma transcrição fora do quadro. No entanto, neste caso, pular de ambas as cópias do exon 2 induz a utilização de um local de entrada interna alternativo ribossomo (IRES) presente no exon 5, produzindo assim distrofina N-truncada funcional que foi identificada em pacientes ainda ambulantes em seus 70s12. A Figura 7A mostra resultados representativos de RT-PCR de células FM com duplicação exon 2. As células FM foram tratadas com AON ou AAV1-U7 carregando uma sequência antissamerada para pular o exon 2. Na Figura 7B,um imunoblot mostra a detecção da distrofina n-truncada em células FM tratadas com AAV1-U7. O tratamento in vitro de células FM serve como prova de conceito para estratégias de exon-skipping.
Figura 1: Representação esquemática da conversão de fibroblastos em células miogênicas. Uma biópsia de pele é obtida de indivíduos humanos. Fragmentos de pele são colocados em pratos de cultura. Dentro de uma semana, os fibroblastos começam a surgir. Os fibroblastos são primeiro transduzidos com o gene hTERT, e depois com o gene Myod, usando vetores lentivirais. Após a seleção de antibióticos de células infectadas, a conversão em míobios é induzida pela adição de doxiciclina ao meio de crescimento myoblast. Dentro de dois a quatro dias, as células se tornam alongadas e orientadas paralelamente. Depois de mudar para meio de diferenciação, o mescla myoblast uns com os outros e forma miotubos multinucleados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fragmentos de biópsia da pele na cultura. (A) Primeiros fibroblastos emergindo de fragmento de pele. (B) Fibroblastos confluentes emergiram do fragmento da pele. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fibroblastos transdiferenciação. (A) Imagem representativa de 70% de fibroblastos confluentes. (B) Myoblasts convertidos têm morfologia alongada e são paralelamente organizados. (C) Os miótubos foram diferenciados por 7 dias. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem representativa de desvinculação de miotubes. As setas indicam as bordas brancas e brilhantes dos miotubes começando a se soltar. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imunofluorescência de miotubes diferenciados. Imunostaining de cadeia pesada de minosina em miotubes derivados de um indivíduo saudável (A) e pacientes com distúrbios neuromusculares(B e C). Em B são mostradas células da distrofia miotônica tipo 1 (DM1) carregando 230 repetições CTG, e em C são células DM1 com 900 repetições CTG. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Padrão transcriptome de miotubes FM em comparação com músculo esquelético. Padrão transcriptome de miotubes FM comparado com músculo esquelético. As leituras por milhão de leituras mapeadas para 12.134 transcrições são mostradas para bibliotecas Illumina RNA-Seq preparadas a partir de myotubes FM e uma biópsia muscular esquelética humana. Os níveis de transcrição entre as duas bibliotecas apresentaram uma correlação de Pearson de 0,71 e uma correlação de grau spearman de 0,73. As transcrições para as cadeias pesadas de minosina de desenvolvimento e as grandes proteínas sarcomericas são destacadas em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Representante RT-PCR e mancha ocidental mostrando exon DMD pulando em células FM. (A) Expressão DMD por RT-PCR. Os fibroblastos de um paciente que abrigava uma duplicação do dmd exon 2 foram convertidos em células FM. O RNA extraído da biópsia muscular foi usado como controle, mostrando que as células não tratadas fm expressam a mesma transcrição duplicada. As células FM tratadas com AON têm um salto parcial da duplicação do exon 2, enquanto as células tratadas AAV1-U7 mostraram predominância de transcrições com a duplicação do exon 2 ignorada. (B) Imunoblot representativo de células FM tratadas com AAV1-U7. A distrofina n-truncada menor foi detectada 14 dias após o tratamento (indicada pela seta). Dados publicados anteriormente em Wein et al. A tradução de um dMD exon 5 IRES resulta em uma isoforme de distrofina funcional que atenua a distrohinopatia em humanos e camundongos. Medicina da Natureza. 2014. Springer Nature Limited 2020. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Meio de crescimento do fibroblasto | DMEM com 20% de FBS, 1% antibiótico-antimicospótico |
| Meio de congelamento | 10% DMSO, 90% de meio de fibroblasto |
| Solução de estoque doxycycline 1000X | 8 mg de doxiciclina em 1 mL de água ultra-pura. Filtrar em 0,22 μm filtro de seringa. Alíquota em tubos PCR. Armazene a -20 °C, protegido contra a luz. |
| Myoblast meio | Meio de crescimento das células musculares esqueléticas (veja lista acima) com suplementos, doxycycline de 8 μg/mL. Por exemplo: 100 μL de solução de estoque 1000X em 100 mL. |
| Meio de diferenciação | Meio de diferenciação de células musculares esqueléticas com suplementos (ver lista acima), 8 μg/mL doxiciclina. Por exemplo: 100 μL de solução de estoque 1000X em 100 mL. |
| Solução de bloqueio para coloração IF | 10% soro de cabra (ou soro de animal no qual o anticorpo secundário foi criado) em 1X PBS |
| Tampão base para extração de proteínas | NaCl 150 mM, Tris 50 mM, 0,05 % NP-40. Ajuste o pH para 7,4. Armazenar a 4 °C. |
Tabela 1: Receitas médias
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Discussion
Para obter linhas de células FM com boa qualidade, algumas etapas são críticas. Quanto mais cedo a biópsia da pele for processada, maiores são as chances de obter fibroblastos saudáveis. O número de passagens de culturas de fibroblastos também é importante. As células primárias têm capacidade proliferativa limitada e, após muitas passagens, entram em senescência replicativa. Assim, é melhor ter um estoque de fibroblastos em um número de passagem baixo e transformar células na passagem mais antiga possível.
Outro passo importante também é ter produção viral que tenha máxima pureza e quantificação precisa. Por exemplo, a quantificação do genoma viral usando qPCR fornece medições razoáveis, mas a quantificação por ddPCR (DIGITAL droplet PCR) é mais precisa.
Além disso, a confluência adequada de fibroblastos para a conversão de míbola é crítica. Se as células estiverem abaixo de 70% ou acima de 80% confluentes, a diferenciação miogênica pode ser prejudicada. Se as células forem muito confluentes, haverá a superposição de camadas de miotubes, que interferem com a coloração e a imagem. A concentração de doxiciclina é crucial para a ativação correta e expressão sustentada do gene Myod. É muito crítico adicionar sempre a doxiciclina ao direito médio antes de fazer alterações de mídia, pois ela se degrada rapidamente após diluída em média e armazenada a 4 °C. O estoque deve ser armazenado a -20 °C a uma concentração de 1000X e protegido contra a luz. Não congele desemarça as alíquotas descongeladas. É muito importante seguir esses detalhes para garantir experimentos reprodutíveis e discriminar uma diferenciação prejudicada devido a uma mutação genética de questões técnicas. No entanto, dependendo da mutação ou do tipo de doença, uma boa diferenciação pode não ser possível. Para garantir resultados confiáveis, é muito importante replicar experimentos em números de passagem semelhantes.
Em nossa experiência, a capacidade de diferenciação persiste pelo menos até a passagem 25-27, especialmente em controles do tipo selvagem. O mesmo pode ser válido para algumas linhas celulares doentes, mas depende da linha celular. Algumas linhas de células DMD ainda mantêm o potencial miogênico acima de P20. Em oposição, uma linha celular miotônica tipo 1 (DM1) apresentou miogenicidade reduzida após P8. No entanto, no caso do DM1, isso não é surpreendente, pois foi demonstrado que mutações no DM1 indiretamente desempenham um papel na diferenciação muscular16. A retenção da capacidade de diferenciação miogênica deve ser tratada individualmente, mas geralmente, a maioria das linhas celulares a retêm até P20-25.
Em resumo, a conversão de fibroblastos em míobios é uma poderosa ferramenta para estudar e testar estratégias terapêuticas para distúrbios neuromusculares. Facilita o acesso a modelos de células humanas, evitando a complicada obtenção de biópsias musculares e reduzindo o inconveniente de uma biópsia muscular para os pacientes.
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Disclosures
O Hospital Infantil de Todo o País licenciou o programa de salto exon 2 descrito aqui na Audentes Therapeutics. K.M.F. e N.W. receberam pagamentos de royalties como resultado desta licença.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Vincent Mouly por compartilhar seu conhecimento no passado sobre o modelo. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA de Distúrbios Neurológicos e Derrame (R01 NS043264 (K.M.F., e R.B.W.), os Institutos Nacionais de Saúde dos EUA instituto nacional de artrite e doenças musculoesqueléticos e de pele (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., e N.W.). N.W. recebeu apoio de bolsas da Ohio State University/Nationwide Children's Hospital Muscle Group e da Philippe Foundation. Este trabalho também foi apoiado por fundos discricionários internos e parte do trabalho de salto exon 2 foi apoiado também pela CureDuchenne (K.M.F.) e Associação Francaise Contre Les Myopathies. Número do IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 e IBCSC#: IBS00000123.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
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