Summary
Hier beschrijven we een cardiale druk-volume lusanalyse onder toenemende doses intraveneus geïnfundeerd isoproterenol om de intrinsieke hartfunctie en de β-adrenerge reserve bij muizen te bepalen. We gebruiken een aangepaste open-borstbenadering voor de druk-volume lusmetingen, waarbij we ventilatie met positieve eind-expiratoire druk opnemen.
Abstract
Bepaling van de hartfunctie is een robuuste eindpuntanalyse in diermodellen van hart- en vaatziekten om de effecten van specifieke behandelingen op het hart te karakteriseren. Door de haalbaarheid van genetische manipulaties is de muis het meest voorkomende diermodel voor zoogdieren geworden om de hartfunctie te bestuderen en te zoeken naar nieuwe potentiële therapeutische doelen. Hier beschrijven we een protocol om de hartfunctie in vivo te bepalen met behulp van druk-volume lusmetingen en analyse tijdens basale omstandigheden en onder β-adrenerge stimulatie door intraveneuze infusie van toenemende concentraties isoproterenol. We bieden een verfijnd protocol inclusief beademingsondersteuning, rekening houdend met de positieve eind-expiratoire druk om negatieve effecten tijdens open borstmetingen te verbeteren, en krachtige analgesie (Buprenorfine) om oncontroleerbare myocardiale stress te voorkomen die wordt opgeroepen door pijn tijdens de procedure. Alles bij elkaar maakt de gedetailleerde beschrijving van de procedure en discussie over mogelijke valkuilen een sterk gestandaardiseerde en reproduceerbare druk-volume lusanalyse mogelijk, waardoor de uitsluiting van dieren uit het experimentele cohort wordt verminderd door mogelijke methodologische bias te voorkomen.
Introduction
Hart- en vaatziekten hebben meestal invloed op de hartfunctie. Dit probleem wijst op het belang bij het beoordelen van in vivo gedetailleerde hartfunctie in dierziektemodellen. Dierproeven worden omgeven door een raamwerk van de drie Rs (3V's) leidende principes (Reduce/Refine/Replace). In het geval van het begrijpen van complexe pathologieën met systemische reacties (d.w.z. hart- en vaatziekten) op het huidige ontwikkelingsniveau, is de belangrijkste optie om de beschikbare methoden te verfijnen. Raffinage zal ook leiden tot een vermindering van de vereiste dieraantallen vanwege minder variabiliteit, wat de kracht van de analyse en conclusies verbetert. Bovendien biedt de combinatie van cardiale contractiliteitsmetingen met diermodellen van hartaandoeningen, waaronder die geïnduceerd door neurohumorale stimulatie of door drukoverbelasting zoals aortabanding, die bijvoorbeeld veranderde catecholamine / β-adrenerge niveaus1,2,3,4nabootst, een krachtige methode voor preklinische studies. Rekening houdend met het feit dat de kathetergebaseerde methode de meest gebruikte benadering blijft voor een diepgaande beoordeling van cardiale contractiliteit5, wilden we hier een verfijnde meting van de in vivo hartfunctie bij muizen presenteren door druk-volume lus (PVL) metingen tijdens β-adrenerge stimulatie op basis van eerdere ervaring, waaronder de evaluatie van specifieke parameters van deze aanpak6, 7.
Voor het bepalen van cardiale hemodynamische parameters zijn benaderingen beschikbaar die beeldvorming of kathetergebaseerde technieken omvatten. Beide opties gaan gepaard met voor- en nadelen die zorgvuldig moeten worden overwogen voor de respectieve wetenschappelijke vraag. Beeldvormingsbenaderingen omvatten echocardiografie en magnetische resonantie beeldvorming (MRI); beide zijn met succes gebruikt bij muizen. Echocardiografische metingen brengen hoge initiële kosten met zich mee van een sonde met hoge snelheid die nodig is voor de hoge hartslag van de muizen; het is een relatief eenvoudige niet-invasieve benadering, maar het is variabel onder operators die idealiter zouden moeten worden ervaren bij het herkennen en visualiseren van cardiale structuren. Bovendien kunnen er geen drukmetingen rechtstreeks worden uitgevoerd en worden berekeningen verkregen uit combinatie van groottegroottes en debietmetingen. Aan de andere kant heeft het als voordeel dat er meerdere metingen kunnen worden uitgevoerd op hetzelfde dier en de hartfunctie kan worden gemonitord, bijvoorbeeld tijdens ziekteprogressie. Met betrekking tot de volumemeting is de MRI de gouden standaardprocedure, maar net als bij echocardiografie zijn er geen directe drukmetingen mogelijk en kunnen alleen preload-afhankelijke parameters worden verkregen8. Beperkende factoren zijn ook de beschikbaarheid, analyse-inspanning en operationele kosten. Hier zijn kathetergebaseerde methoden om de hartfunctie te meten een goed alternatief dat bovendien de directe monitoring van de intracardiale druk en de bepaling van belastingsonafhankelijke contractiliteitsparameters zoals preload recrupuleerbaar beroertewerk (PRSW) mogelijk maakt9. Ventriculaire volumes gemeten door een drukgeleidingskatheter (door geleidbaarheidsbepaling) zijn echter kleiner dan die van de MRI, maar groepsverschillen worden in hetzelfde bereik gehouden10. Om betrouwbare volumewaarden te bepalen is de bijbehorende kalibratie vereist, wat een kritieke stap is tijdens de PVL-metingen. Het combineert ex vivo metingen van bloedgeleiding in volume-gekalibreerde cuvetten (omzetting van geleiding in volume) met de in vivo analyse voor de parallelle geleiding van het myocard tijdens de bolusinjectie van de hypertone zoutoplossing11,12. Daarnaast zijn de positionering van de katheter in de ventrikel en de juiste oriëntatie van de elektroden langs de lengteas van de ventrikel van cruciaal belang voor het detectievermogen van het omringende elektrische veld dat door hen wordt geproduceerd. Nog steeds met de kleinere grootte van het muizenhart is het mogelijk om artefacten te vermijden die worden geproduceerd door veranderingen in de intraventriculaire oriëntatie van de katheter, zelfs in verwijde ventrikels5,10, maar artefacten kunnen evolueren onder β-adrenerge stimulatie6,13. Naast de geleidingsmethoden leek de ontwikkeling van een op toelating gebaseerde methode de kalibratiestappen te vermijden, maar hier worden de volumewaarden nogal overschat14,15.
Aangezien de muis een van de belangrijkste preklinische modellen is in cardiovasculair onderzoek en de β-adrenerge reserve van het hart van centraal belang is in de hartfysiologie en pathologie, presenteren we hier een verfijnd protocol om de in vivo hartfunctie bij muizen te bepalen door PVL-metingen tijdens β-adrenerge stimulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd en uitgevoerd volgens de voorschriften van de Regionale Raad van Karlsruhe en de Universiteit van Heidelberg (AZ 35-9185.82/A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) in overeenstemming met de richtlijnen van Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt. De gegevens in dit protocol zijn afgeleid van wilde type C57Bl6/N mannelijke muizen (17 ± 1,4 weken oud). Muizen werden gehouden onder gespecificeerde pathogeenvrije omstandigheden in de dierenfaciliteit (IBF) van de heidelbergse medische faculteit. Muizen werden gehuisvest in een licht-donkercyclus van 12 uur, met een relatieve vochtigheid tussen 56-60%, een 15-voudige luchtverversing per uur en een kamertemperatuur van 22 °C +/- 2 °C. Ze werden lang gehouden in conventionele kooien type II of type II, voorzien van dierlijk strooisel en tissuepapier als verrijking. Standaard geautoclaveerd voedsel en geautoclaveerd water waren beschikbaar om ad libitumte consumeren.
1. Bereiding van instrumenten en geneesmiddelenoplossingen
- Centraal veneuze katheter: Snijd de microbuis (0,6 mm buitendiameter) in ~20 cm lange katheterbuizen. Gebruik een tang om het ene uiteinde van de buis op de punt van een 23-gauge canule te trekken. Snijd het andere uiteinde van de slang diagonaal af om een scherpe punt te creëren die de dijbeenader kan doorboren.
- Endotracheale buis: Knip voor een intubatiebuis een 20-gauge venapunctuur-canule van 3 cm lang om de spuitbevestiging te verwijderen.
- Als de intubatiebuis niet perfect op de ventilatoraansluiting past, wikkelt u parafilm over het uiteinde van de buis waar het ventilatieapparaat is aangesloten. De verbinding moet stabiel zijn en afgedicht door de verdikking(figuur 1A). Verkort de metalen geleidepen van de 20-gauge venapunctuur-canule tot 2,7 cm en gebruik deze als intubatiehulpmiddel. Verfijnde benaderingen voor intubatie inclusief lichte vezels om visualisatie van de luchtpijp te vergemakkelijken, worden ook goed beschreven, bijvoorbeeld door Das en medewerkers16.
- Anesthetisch mengsel gebruikt voor intubatie: Meng 200 μL heparine (1000 IE/ml) met 50 μL van 0,9% NaCl en 750 μL van 2 mg/ml etomidate uit een product op basis van olie-in-water emulsie. Gebruik 7 μL/g lichaamsgewicht voor elke muis (0,1 mg/kg LG Buprenorfine 10 mg/kg LICHAAMSGEWICHT etomidate).
- Spierverslapper: Los 100 mg Pancuronium-bromide op in 100 ml van 0,9% NaCl. Gebruik 1,0 μL/g lichaamsgewicht (1 mg/kg LG) voor elke muis.
- Isoproterenol-oplossingen: Los 100 mg isoproterenol op in 100 ml van 0,9% NaCl (1 μg/μL). Bereid de volgende verdunningen (tabel 1) en breng ze over in een spuit van 1 ml.
- Om verdunning 1 te verkrijgen, verdunt u de bouillon 1:1.8. Om verdunning 2 te verkrijgen, verdunt u de bouillon 1:6. Om verdunning 3 te verkrijgen, verdun verdunning 1 tot 1:10. Verkrijg ten slotte verdunning 4 door een verdunning van verdunning 1:10 2.
- 15% Hypertone NaCl (w/v): Los 1,5 g van 0,9% NaCl op in 10 ml dubbel gedestilleerd H2O. Filtreer de oplossing met een poriespuitfilter van 0,45 μm.
- Bereiding van 12,5% albumine-oplossing (w/v): Los 1,25 g runderserumalbumine op in 10 ml van 0,9% NaCl. Incubeer de oplossing bij 37 °C gedurende 30 minuten. Koel af tot kamertemperatuur en filtreer de oplossing met een 0,45 μm poriespuitfilter.
- Voorbereiding van de opstelling: Schakel eerst de verwarmingsplaat in en stel deze in op 39-40 °C. Plaats een spuit gevuld met zoutoplossing op het verwarmingskussen en breng de pvl-katheter (pressure-volume loop) over in de spuit. Incubeer de katheter minstens 30 minuten voor gebruik voor stabilisatie. De opstelling die we gebruiken bestaat uit een 1,4-F drukgeleidingskatheter, een besturingseenheid en de bijbehorende software, en het is grafisch beschreven in figuur 1B en referenties van de provider staan vermeld in de tabel met materialen.
2. Anesthesie
- Injecteer buprenorfine (0,1 mg/kg LG intraperitoneaal) 30 min voor intubatie.
- Plaats de muis in een acrylglaskamer die is voorverzadigd met 2,5% isofluraan en voorverwarmd met een verwarmingskussen op de basis van de kamer.
- Zodra de muis slaapt (gebrek aan reflex), injecteert u het anestheticummengsel (7 ml/kg LICHAAMSGEWICHT) met 10 mg/kg etomidate en heparine (1.200 IE/kg LICHAAMSGEWICHT) intraperitoneaal.
3. Ventilatie
- Breng het dier 3-4 minuten na de anesthesie-injectie over naar het intubatieplatform (figuur 1C). De muis hangt aan de tanden met het dorsale zicht naar de operator gericht.
- Til de tong voorzichtig op met een tang. Om de glottis te identificeren, tilt u de onderkaak van de muis iets op met een tweede tang.
- Steek de endotracheale buis(figuur 1A)voorzichtig in de luchtpijp en verwijder de geleidestaaf.
- Breng het dier over op de verwarmingsplaat, plaats het op de rug en sluit de intubatiebuis aan op het gasmasker van het kleine dier.
- Pas de ademhalingsfrequentie aan op 53,5 x (lichaamsgewicht in grammen)-0,26 [min-1],zoals beschreven door anderen12, en getijdenvolumes om inspiratoire drukken te pieken van 11 ± 1 cmH2O. Stel een PEEP van 2 cmH2O.
- Bevestig de ledematen van de muis zorgvuldig op de verwarmingsplaat met plakstrips en breng oogzalf aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen.
- Plaats een rectale temperatuurvoeler en houd de kerntemperatuur van het lichaam op 37 ± 0,2 °C.
- Installeer een 1-afleidings-ECG en controleer de hartslag online als indicator voor anesthesiediepte en stabiliteit.
- Bij afwezigheid van interdigitale reflexen, injecteer 1 mg/kg LG van de spierverslapper pancuronium-bromide intraperitoneaal. Dit voorkomt ademhalingsartefacten tijdens PVL-metingen.
4. Chirurgie
- Algemene aanbevelingen
- Ventileer tijdens de operatie met ~ 1,5-2% isofluraan verdampt met O2. De isofluraanconcentratie kan ook afhangen van variabelen zoals muizenstam, geslacht, leeftijd en gewicht van de dieren, maar deze moet individueel en experimenteel worden bepaald en de waarden hier zijn referentie voor de C57BL6 / N-muizenstam. Belangrijk is dat de ventilator is aangesloten op een afzuigsysteem om te voorkomen dat de operator isofluraan inademt.
- Gebruik een vergroting tussen 1,5-4x van de stereomicroscoop voor chirurgische ingrepen.
OPMERKING: Raadpleeg de institutionele/lokale richtlijnen voor de voorbereiding van het dier op niet-overlevingsoperaties.
- Femorale cannulatie
- Spoel de achterpoot af met 70% ethanol, snijd het linker liesgebied in en leg de linker femurader bloot.
- Blaas de epigastrische slagader en ader met een cautery.
- Ligate de femorale ader met een hechting geplaatst distale naar de katheter toegang.
- Breng een hechting onder de dijbeenader en bereid een knoop schedel van punctie plaats. Prik de dijbeenader door met de voorbereide microbuis (zie stap 1.1) die is bevestigd aan een spuit van 1 ml.
- Bind de knoop vast om de buis in het vat te bevestigen.
- Ga vochtverlies tegen door de infusie van 0,9% NaCl aangevuld met 12,5% albumine bij een infusiesnelheid van 15 μL/min met een automatische spuitpomp. Houd bovendien blootgesteld weefsel vochtig met voorverwarmd 0,9% NaCl.
- Thoracotomie
- Spoel de thorax af met 70% ethanol.
- Snijd de huid net onder het xyfusproces en scheid de borstspieren botweg van de borstwand met een tang of een cautery.
- Til het xyfusproces op met een tang en snijd vervolgens door de borstwand die aan beide zijden zijdelings beweegt met een cautery totdat het diafragma van onderaf volledig zichtbaar is.
- Snijd het diafragma van onderaf in en stel de harttop bloot. Verwijder vervolgens voorzichtig het hartzakje met een tang.
- Voer een beperkte costotomie uit aan de linkerkant zoals eerder beschreven6.
- Passeer een hechting onder de inferieure cavalader om in latere stadia een voorspanningsreductie uit te voeren.
- Prik voorzichtig de harttop met een 25-gauge canule (maximaal 4 mm). Verwijder de canule en breng de PV-katheter in totdat alle elektroden zich in de ventrikel bevinden.
- Pas de positie van de katheter aan met zachte bewegingen en draaiingen totdat rechthoekige lussen zijn verkregen(figuur 2A).
- Houd altijd al het blootgestelde weefsel vochtig met voorverwarmd 0,9% NaCl.
5. Metingen
- Algemene aanbevelingen
- Ventileer tijdens metingen met ~1,5-2% isofluraan verdampt met 100% O2.
- Voer 2 nulmetingen en 2 vena cava occlusies uit bij elke stap van het dosisresponsprotocol.
OPMERKING: Het is belangrijk dat na de eerste en tweede vena cava occlusie zowel de druk- als de volumewaarden terugkeren naar steady-state waarden zoals vóór de eerste occlusie. Deze observatie is nodig om een verschuiving in de katheterpositie te herkennen als gevolg van seriële verminderingen van het intraventriculaire volume. Als een verschuiving in de katheterpositie het geval zou zijn, zouden vooral volumewaarden worden verschoven.
- Voer een online analyse uit van parameters (hartslag, slagvolume, dP/dtmax)en wacht tot de steady-state hartfunctie is verkregen. Voor het verwachte parameterbereik met de hier gebruikte instelling in C57Bl6/N-muizen raadpleegt u de gepubliceerde resultaten6.
- Stop het beademingsapparaat op eind-expiratoire positie en noteer basislijnparameters. Verminder na 3 tot 5 seconden de cardiale voorbelasting door de hechtdraad onder de inferieure cavalader met een tang op te tillen om preload onafhankelijke parameters te verkrijgen(figuur 2B). Zet de ventilator aan. Wacht ten minste 30 seconden op de tweede occlusie totdat de hemodynamische parameters zijn gestabiliseerd.
- Na het verkrijgen van de metingen onder basale omstandigheden gaat u over tot de dosis-respons van isoproterenol door over te schakelen naar de bereide spuiten. Hier blijft de infusiesnelheid ongewijzigd om aanpassingen van de cardiale voorspanning te voorkomen. Zorg ervoor dat u geen luchtbellen infundeert bij het vervangen van de spuit.
- Wacht ten minste 2 minuten totdat een nieuwe steady-state hartfunctie is verkregen en stop het beademingsapparaat opnieuw op eind-expiratoire positie en noteer basislijnparameters. Verminder na 3 tot 5 seconden de cardiale voorspanning door de hechtdraad onder de inferieure cavalader op te tillen om preload onafhankelijke parameters te verkrijgen.
- Wacht minstens 30 seconden op de tweede occlusie. Schakel daarna over op de bereide spuit met de volgende isoproterenolconcentratie en herhaal de registraties van baseline- en preload-onafhankelijke parameters.
OPMERKING: Artefacten zoals de end-systolische druk-spike (ESPS, Figuur 2C) kunnen optreden tijdens de verhoging van de dosering van isoproterenol, die het gevolg is van katheterbeknelling. Artefacten die optreden vóór het begin van basale parameters kunnen eenvoudig worden gecorrigeerd door de katheter opnieuw te positioneren.
6. Kalibratie
OPMERKING: Kalibratieprocedures kunnen variëren afhankelijk van het gebruikte PVL-systeem.
- Kalibratie met parallelle geleiding
- Sluit een spuit met een 15% NaCl-oplossing aan op de heupcanule na de laatste meting van de dosis-respons van isoproterenol. Infundeer voorzichtig 5 μL van de hypertone oplossing die in de buis achterblijft totdat PVL iets naar rechts verschuift tijdens online visualisatie. Wacht dan tot de lussen weer stabiel zijn.
- Stop het gasmasker bij de eindbeginning en injecteer één bolus van 10 μL van 15% NaCl binnen 2 tot 3 seconden. Controleer of PVL grotendeels verbreden en naar rechts worden verschoven tijdens online visualisatie.
- Geleiding-naar-volume kalibratie
- Wacht 5 minuten, niet minder, zodat de hypertone zoutoplossing bolus volledig wordt verdund. Verwijder daarna de katheter en zuig ten minste 600 μL bloed uit de linker ventrikel van het kloppende hart met behulp van een spuit van 1 ml en een canule van 21 gauge. Op dit moment wordt het dier geëuthanaseerd onder diepe anesthesie en analgesie door massale bloedingen, door de beademing te stoppen en het hart te verwijderen.
- Breng het bloed over in het voorverwarmde (in een waterbad bij 37 °C) kalibratiecuvet met cilinders met een bekend volume. Plaats de PV-katheter centraal in elke cilinder en noteer de geleiding. Door voor elk dier een standaardcurve te berekenen, kunnen de geleidingseenheden worden omgezet in absolute volumewaarden.
7. Analyse
- Na succesvolle PVL-metingen onder basale omstandigheden en isoproterenolstimulatie, visualiseer, digitaliseer, bereken en extraheer parameters die kenmerkend zijn voor de hartfunctie (zoals PRSW, dP / dt, einddiastolische druk en volume, eind-systolische druk en volume, relaxatieconstante Tau, onder andere) met behulp van een geschikte PVL-analysesoftware. Verdere statistische analyse en grafische weergaven kunnen worden uitgevoerd met standaard analysesoftware.
- Analyse van preload onafhankelijke parameters
OPMERKING: Voor deze stap is het cruciaal om de procedure te standaardiseren.- Selecteer de eerste 5-6 PVL's met afnemende voorspanning gedurende alle metingen voor de analyse van preload onafhankelijke parameters(Figuur 2D). Een constant aantal PVL's geselecteerd voor analyse tijdens preloadreductie zal de variabiliteit tussen metingen van de verkregen parameters verminderen.
- Bereken de gemiddelde waarde van de twee metingen bij elke stap van het protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De drukvolumelusmeting (PVL) is een krachtig hulpmiddel om de cardiale farmacodynamiek van geneesmiddelen te analyseren en het hartfenotype van genetisch gemodificeerde muismodellen onder normale en pathologische omstandigheden te onderzoeken. Het protocol maakt de beoordeling van cardiale β-adrenerge reserve in het volwassen muismodel mogelijk. Hier beschrijven we een open-thoraxmethode onder isofluraan-anesthesie in combinatie met buprenorfine (pijnstillend) en pancuronium (spierverslapper), die zich richt op de cardiale respons op β-adrenerge stimulatie door isoproterenolconcentraties te infunderen via een femorale aderkatheter. Sommige representatieve gegevens die in dit protocol worden weergegeven, zijn afgeleid van volwassen mannelijke muizen van het wilde type C57Bl6/N(figuur 3 en tabel 2). Als indicator van de variabiliteit van enkele belangrijke parameters gemeten door onze PVL-analyse hebben we een vermogensanalyse uitgevoerd (α foutkans van 0,05 en vermogen van 0,8) met behulp van de resultaten van de WT-groep en de gratis beschikbare G * Power-software17. In tabel 3 zijn de berekende effectgroottes en vereiste steekproefgroottes voor hartslag, PRSW, slagvolume, de relaxatieconstante Tau, dP/dtmax en dP/dtmin, uitgaande van veranderingen tussen 10% en 30% voor elke parameter onder 0, 0,825 en 8,25 ng/min isoproterenol weergegeven.
Grafische analyse van druk-volume relaties wordt gedaan door volume (μL) uit te zetten op de Y- en druk (mmHg) op de X-as. Als de katheter correct in de ventrikel is geplaatst, wordt een volledige hartcyclus weergegeven door een rechthoekige PVL (figuur 2A en figuur 3A). Kortom, systole begint met een fase van isovolumetrische contractie (gekenmerkt door dP / dtmax), waarbij beide hartkleppen gesloten zijn (rechter verticale rand). Wanneer de ventriculaire druk de aortadruk overschrijdt, opent de aortaklep en wordt bloed in de aorta gepompt tijdens de ejectiefase (bovenste horizontale). Vervolgens, wanneer de aortadruk de ventriculaire druk overschrijdt, sluit de aortaklep en begint de diastole. Tijdens de isovolumetrische relaxatie (gekenmerkt door de parameters dP/dtmin en Tau) daalt de ventriculaire druk totdat de atriale druk de ventriculaire druk overschrijdt en de mitralisklep opengaat (linker verticale rand). Nu vindt passieve diastolische vulling, gekenmerkt door eind-diastolische druk-volumerelatie (EDPVR), plaats totdat de volgende hartcyclus begint (onderste horizontaal) (Figuur 2A-B).
PVL-analyse biedt gedetailleerde inzichten in de hartfunctie, omdat het in staat is om de hartfunctie onafhankelijk van de cardiale preload te bepalen. Zo is het beschreven als de gouden standaard voor het bepalen van de hartfunctie in experimentele opstellingen5. In het beschreven protocol met C57Bl6/N-muizen evalueerden we de respons op isoproterenol geproduceerd op algemene parameters van de hartfunctie zoals hartslag, cardiale output, beroertevolume en beroertewerk. Een significant effect van isoproterenol op elke parameter wordt waargenomen in de dosisrespons onder verschillende isoproterenolconcentraties (figuur 3B). Parameters van cardiale contractiliteit zoals PRSW en dP/dtmax toonden de verwachte toename van de dosis-respons onder isoproterenolinfusie(figuur 3A-B). Aan de andere kant werd een vermindering van diastolische parameters (constante van relaxatie Tau en dP/dtmin) met toenemende isoproterenolconcentraties geregistreerd (figuur 3C) zoals te verwachten was van een positief lusitroop effect geproduceerd door catecholaminen in het gezonde hart. Verdere parameters uit figuur 3 (d.w.z. eind-systolische druk en volume, einddiastolische druk en volume, maximale druk, onder andere) worden ook verkregen uit PVL-analyse en kunnen ook worden geanalyseerd afhankelijk van de wetenschappelijke vraag, het genetische of ziektemodel en de verkregen waarnemingen. Aanvullende en gedetailleerde waarden voor de meest voorkomende parameters van de hartfunctie in PVL bij elke stap tijdens incrementele β-adrenerge stimulatie, inclusief het tijdstip van kalibratie voor parallelle geleiding met hypertone zoutoplossing die de cardiale volumeparameters sterk beïnvloedt, maar ook cardiale inotropie en ontspanning, zijn eerder gemeld1,6.
Figuur 1. Anesthesie en druk-volume lus setup. (A) 20-gauge venapunctuur-canule aangepast voor muisintubatie. (B) Diagram met de organisatie en verbinding van de verschillende componenten van de gebruikte druk-volume meetopstelling, met inbegrip van de stroomrichting van het anestheticum. (C) Intubatieplatform gebruikt om de muizen op te hangen voor een snelle en veilige intubatie. Schroeven (i) aan beide zijden aan het einde van de hangende draad (ii) zijn inbegrepen om de dreiging aan te spannen, afhankelijk van het gewicht van de muis. De pijl geeft een aansluitmogelijkheid aan voor blootstelling aan isofluraan. Temp.: Temperatuur; ECG: Elektrocardiogram; MinPexp: Minimale expiratoire druk; MaxPexp: Maximale expiratoire druk; PV: Druk-volume. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Representatieve druk-volume analyse. (A) Voorbeeldige druk-volume-opnames waarbij parameters geanalyseerd tijdens basale meting worden getoond en de belangrijkste gebeurtenissen tijdens de hartcyclus worden afgebeeld. (B) Parameters ESPVR, EDPVR en PRSW worden weergegeven tijdens de preload-reductie. (C) End-systolische drukpieken tijdens basale metingen (bovenste paneel) of tijdens de occlusiemanoeuvre (onderste paneel), beide onder isoproterenolstimulatie worden gepresenteerd. LV: Linkerventrikel; dP/dtmin: Minimum dP/dt; dP/dtmax: Maximale dP/dt; Ves: End-systolisch volume; Ved: Einddiastolisch volume; ESPVR: Eind-systolische druk-volume relatie; PRSW: Preload rekruteerbare slag werk; EDPVR: Eind-diastolische druk-volume relatie. Figuur is aangepast van de aanvulling van ons vorige werk 20196. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Analyse van PVL-metingen in C57BL6/N muizen. (A) Representatieve PVL's tijdens inferieure cavalader occlusie van C57BL6/N controlemuizen en onderworpen aan toenemende isoproterenolconcentraties. (B) De algemene hartfunctie tijdens basale aandoeningen en tijdens isoproterenol wordt beschreven door de analyse van de hartslag, de cardiale output, het slagvolume en het beroertewerk. (C) Aanvullende parameters werden geanalyseerd om cardiale contractiliteit en diastolische functie zoals PRSW, de constante van relaxatie Tau (Weiss-vergelijking18) en de maximale en minimale dP / dt te beoordelen. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie. BPM: Beats per minuut; PRSW: Preload rekruteerbare slag werk; n: aantal muizen. **p < 0,01: p-waarden van de gepaarde Student's t-test tegen de basale conditie (isoproterenol = 0 ng/min). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Isoproterenol | Concentratie (pg/μL) | Infusiesnelheid (μL/min) | Doses (ng/min) |
| Voorraad | 1000 | ||
| Verdunning 1 | 550 | 15 | 8.25 |
| Verdunning 2 | 165 | 15 | 2.475 |
| Verdunning 3 | 55 | 15 | 0.825 |
| Verdunning 4 | 16.5 | 15 | 0.2475 |
Tabel 1. Verdunning van isoproterenol voor het verhogen van β-adrenerge stimulatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.
| Isoproterenol (ng/min) | |||||
| 0 | 0.2475 | 0.825 | 2.475 | 8.25 | |
| Globale parameters en volumes | |||||
| Hartslag (bpm) | 470 ± 19,6 | 490 ± 19,3 | 542 ± 20,6 | 605 ± 20,5 | 638 ± 20,5 |
| Slagvolume (μl) | 16,2 ± 2,6 | 17,6 ± 2,1 | 20,3 ± 2,8 | 22,3 ± 2,2 | 23,9 ± 2,5 |
| Cardiale output (μl/min) | 7627 ± 1210 | 8609 ± 1097 | 11000 ± 1616 | 13502 ± 1494 | 15291 ± 1761 |
| End-systolisch volume (μl) | 13 ± 3,1 | 10,5 ± 3,5 | 4,81 ± 2,3 | 1,94 ± 1,9 | 1,5 ± 1,7 |
| Einddiastolisch volume (μl) | 27,4 ± 3 | 26,6 ± 3,0 | 24,1 ± 3,1 | 23,8 ± 2,6 | 24,8 ± 2,7 |
| Gemiddelde druk (mmHg) | 27,4 ± 2,2 | 28,6 ± 2,2 | 29,2 ± 1,9 | 29,7 ± 1,9 | 30,5 ± 1,9 |
| Arteriële Elastantie (mmHg/μl) | 4,44 ± 0,6 | 4,18 ± 0,7 | 3,46 ± 0,5 | 2,78 ± 0,9 | 2,91 ± 1 |
| Systolische parameters | |||||
| Rekruteerbare slagwerk vooraf laden | 67,8 ± 7,62 | 76,3 ± 9,85 | 96,1 ± 14,62 | 108 ± 14,56 | 113 ± 13.02 |
| Espvr | 4,96 ± 1,29 | 5,15 ± 1,16 | 7,2 ± 2,28 | 17,3 ± 42,04 | 40 ± 107,55 |
| Ejectiefractie (%) | 52,59 ± 9,57 | 60,9 ± 9,94 | 80,23 ± 8,65 | 92,16 ± 7,2 | 94,18 ± 6,15 |
| Slagwerk (mmHg x μl) | 1007 ± 244,26 | 1153 ± 193 | 1399 ± 261 | 1582 ± 234 | 1720 ± 216 |
| Maximale dP/dt (mmHg/s) | 6128,7 ± 1398,39 | 7087 ± 1401 | 8982,4 ± 1481 | 11422 ± 1477 | 13256 ± 1165 |
| Minimaal dV/dt (μl/s) | - 523 ± 105,58 | - 613 ± 102 | - 835 ± 151 | - 1103 ± 165 | - 1273 ± 177 |
| Eind-systolische druk (mmHg) | 70,8 ± 6,98 | 72,5 ± 7,42 | 69 ± 6,28 | 61,2 ± 17,36 | 68,2 ± 19,72 |
| Maximaal vermogen (mmHg x μl/s) | 3009 ± 955,31 | 3541 ± 1188 | 4185 ± 1058 | 4272 ± 959 | 4918 ± 1418 |
| Diastolische parameters | |||||
| Edpvr | 1 ± 0,93 | 1,23 ± 0,88 | 1,5 ± 0,86 | 1,87 ± 0,92 | 1,96 ± 0,99 |
| Tau (ms, Weiss' vergelijking) | 6,14 ± 0,64 | 5,67 ± 0,44 | 4,92 ± 0,44 | 4,83 ± 0,55 | 4,96 ± 0,65 |
| Minimale dP/dt (mmHg/s) | - 7272 ± 1403 | - 8119 ± 1295 | - 8998 ± 1240 | - 8618 ± 1129 | - 8648 ± 1468 |
| Einddiastolische druk (mmHg) | 5,29 ± 1,01 | 5,74 ± 1,07 | 5,6 ± 1,51 | 5,37 ± 1,13 | 5,76 ± 1,15 |
| Maximaal dV/dt (μl/s) | 765 ± 174 | 817 ± 178 | 972 ± 156 | 1158 ± 163 | 1264 ± 153 |
Tabel 2. Analyse van PVL-metingen in C57BL6/N muizen. PVL-parameters van de hartfunctie tijdens basale omstandigheden en tijdens isoproterenolinfusie. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie van 18 mannelijke volwassen muizen. PV: Drukvolume; BPM: Beats per minuut; ESPVR: Helling van end-systolische PV-relatie, onvoldoende berekening bij lage intraventriculaire volumes (2,475 en 8,25 ng/min Isoproterenol); EDPVR: End-diastolische PV-Relatie, exponentiële regressie (alfacoëfficiënt). Klik hier om deze tabel te downloaden.
| Delta (%) | Effectgrootte | Steekproefgrootte per groep | ||||
| Isoproterenol ng/min | Isoproterenol ng/min | |||||
| 0 | 0.825 | 8.25 | 0 | 0.825 | 8.25 | |
| Hartslag | ||||||
| 10 | 2.4 | 2.6 | 3.1 | 4 | 4 | 3 |
| 15 | 3.6 | 3.9 | 4.6 | 3 | 3 | 3 |
| 20 | 4.8 | 5.3 | 6.2 | 3 | 3 | 3 |
| 25 | 6.0 | 6.6 | 7.8 | 3 | 3 | 3 |
| 30 | 7.2 | 7.9 | 9.3 | 3 | 3 | 3 |
| Slagvolume | ||||||
| 10 | 0.6 | 0.7 | 1.0 | 42 | 30 | 18 |
| 15 | 0.9 | 1.1 | 1.5 | 20 | 15 | 9 |
| 20 | 1.2 | 1.5 | 2.0 | 12 | 9 | 6 |
| 25 | 1.5 | 1.8 | 2.4 | 8 | 6 | 4 |
| 30 | 1.8 | 2.2 | 2.9 | 6 | 5 | 4 |
| Rekruteerbare slagwerk vooraf laden | ||||||
| 10 | 0.9 | 0.7 | 0.9 | 21 | 38 | 22 |
| 15 | 1.3 | 1.0 | 1.3 | 10 | 18 | 11 |
| 20 | 1.8 | 1.3 | 1.7 | 7 | 11 | 7 |
| 25 | 2.2 | 1.6 | 2.2 | 5 | 7 | 5 |
| 30 | 2.7 | 2.0 | 2.6 | 4 | 6 | 4 |
| dP/dtmax | ||||||
| 10 | 0.4 | 0.6 | 1.1 | 83 | 44 | 14 |
| 15 | 0.7 | 0.9 | 1.7 | 38 | 20 | 7 |
| 20 | 0.9 | 1.2 | 2.3 | 22 | 12 | 5 |
| 25 | 1.1 | 1.5 | 2.8 | 15 | 8 | 4 |
| 30 | 1.3 | 1.8 | 3.4 | 11 | 6 | 3 |
| Tau | ||||||
| 10 | 1.0 | 1.1 | 0.8 | 19 | 14 | 28 |
| 15 | 1.4 | 1.7 | 1.2 | 9 | 7 | 13 |
| 20 | 1.9 | 2.2 | 1.5 | 6 | 5 | 8 |
| 25 | 2.4 | 2.8 | 1.9 | 4 | 4 | 6 |
| 30 | 2.9 | 3.4 | 2.3 | 4 | 3 | 5 |
| dP/dtmin | ||||||
| 10 | 0.5 | 0.7 | 0.6 | 60 | 31 | 47 |
| 15 | 0.8 | 1.1 | 0.9 | 27 | 15 | 22 |
| 20 | 1.0 | 1.4 | 1.2 | 16 | 9 | 13 |
| 25 | 1.3 | 1.8 | 1.5 | 11 | 6 | 9 |
| 30 | 1.6 | 2.2 | 1.8 | 8 | 5 | 7 |
| Eind-systolische druk-volume relatie | ||||||
| 10 | 0.4 | 0.3 | 0.04 | >100 | >100 | >100 |
| 15 | 0.6 | 0.5 | 0.06 | 48 | 73 | >100 |
| 20 | 0.8 | 0.6 | 0.07 | 28 | 41 | >100 |
| 25 | 1.0 | 0.8 | 0.09 | 19 | 27 | >100 |
| 30 | 1.2 | 1.0 | 0.11 | 13 | 19 | >100 |
| Einddiastolisch volume | ||||||
| 10 | 0.9 | 0.8 | 0.9 | 20 | 27 | 20 |
| 15 | 1.4 | 1.2 | 1.4 | 10 | 13 | 10 |
| 20 | 1.8 | 1.6 | 1.8 | 6 | 8 | 6 |
| 25 | 2.3 | 2.0 | 2.3 | 5 | 6 | 5 |
| 30 | 2.8 | 2.4 | 2.8 | 4 | 5 | 4 |
Tabel 3. Geschatte effectgrootte en vereiste steekproefgrootte voor geselecteerde parameters op basis van waarden waargenomen bij C57BL6 /N mannelijke muizen. Delta toont een hypothetisch verschil in de parameter tussen een controlegroep (d.w.z. wildtype). Effectgrootte en vereiste steekproefgrootte per groep worden berekend met behulp van controlegegevens (gemiddelde en standaardafwijking), alfafout (0,05) en vermogen (0,8) via G*Power 19. Vetgedrukte waarden (groene achtergronden in de online versie van de tabel) geven een voorgestelde drempelwaarde-effectgrootte (1≤) en steekproefgrootte aan voor elke parameter op elke dosis isoproterenol. dP/dtmin: Minimum dP/dt; dP/dtmax: Maximum dP/dt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier bieden we een protocol om de in vivo hartfunctie bij muizen te analyseren onder toenemende β-adrenerge stimulatie. De procedure kan worden gebruikt om zowel de uitgangsparameters van de hartfunctie als de adrenerge reserve (bijv. Inotropie en chronotropie) bij genetisch gemodificeerde muizen of bij interventies aan te pakken. Het meest prominente voordeel van druk-volume lus (PVL) metingen in vergelijking met andere middelen om de hartfunctie te bepalen, is de analyse van de intrinsieke, belastingsonafhankelijke hartfunctie. Alle andere methoden (bijv. MRI en echocardiografie) kunnen alleen belastingsafhankelijke parameters van de hartfunctie beoordelen en vooral cardiale contractiliteit kan niet betrouwbaar worden bepaald. Dit maakt PVL-metingen de gouden standaard voor eindpuntmetingen van diepteanalyse van de hartfunctie5. De eerder genoemde methoden maken echter sequentiële analyse van de hartfunctie mogelijk, waardoor ze op de voorgrond treden voor longitudinale observaties (bijvoorbeeld tijdens ziekteprogressie). Verder kunnen intraventriculaire volumes, en vervolgens slagvolume en andere afgeleide parameters, worden onderschat in PVL-metingen in vergelijking met MRI bij muizen20.
Er zijn vier kritieke stappen tijdens het protocol die cruciaal zijn om geldige PVL-gegevens te verkrijgen: 1) Intubatie, 2) plaatsing van de femorale aderkatheter, 3) plaatsing van de drukgeleidingskatheter en 4) het periprocedurale regime. Niet-invasieve intubatie van muizen vereist enige ervaring en is gecompliceerd bij het gebruik van isofluraan omdat het tijdsbestek voor intubatie smal is (20 - 40 s). Na intubatie moet de juiste plaatsing van de buis dus zorgvuldig worden gecontroleerd door de bewegingen van de muriene borstkas te onderzoeken bij het wijzigen van de ademhalingsfrequentie van de beademingsapparatuur. Om het venster voor intubatie te verbreden, beschreven we hier het gelijktijdige gebruik van de kortwerkende hypnotische etomidate. Verder zijn er lichtvezels beschikbaar om de visualisatie van de glottis tevergemakkelijken 16. Een goede plaatsing van de femorale aderkatheter is essentieel voor de toepassing van isoproterenol in latere stadia. Tijdens deze stap kan luchtembolie de dieren ernstig schaden en longembolie veroorzaken. De juiste plaatsing van de femorale katheter kan in eerste instantie worden gecontroleerd door een zorgvuldige aspiratie van veneus bloed. Wanneer de juiste plaatsing van de katheter in latere stadia onzeker is, kan het einddiastolische volume worden onderzocht, dat zou moeten toenemen als reactie op de geringste bolus bij het visualiseren van PVL online. In tegenstelling tot de meeste andere onderzoekers, beschrijven we hier cannulatie van de femorale ader, terwijl anderen meestal de halsader gebruikten als het doelvat voor centrale veneuze toegang12,21. Deze benadering heeft het voordeel dat het niet dicht bij de nervus vagus manipuleert, zoals wordt gedaan bij de benadering van de nabije borst wanneer de halsslagader wordt voorbereid, en dus gaan we ervan uit dat potentiële stimulatie van het parasympathische systeem door simpelweg de zenuw aan te raken / beschadigen wordt vermeden. Een juiste plaatsing van de PV-katheter in de ventrikel is cruciaal om zinvolle gegevens te verkrijgen, vooral met betrekking tot volumeparameters. Wanneer elektroden zich niet volledig in de ventrikel bevinden of de katheter niet goed langs de lengteas van de ventrikel is geplaatst, worden de volumeparameters sterk onderschat. Verder veroorzaakt contact tussen het endocardium en de drukomvormer eind-systolische drukpieken die niet mogen worden getolereerd tijdens basismetingen6. Ten slotte heeft het periprocedurale regime inclusief anesthesiediepte en vloeistofbeheer een aanzienlijke invloed op de betrouwbaarheid van PVL-gegevens bij muizen. Anesthetische onder- of overdosering kan beide de hemodynamische parameters ernstig beïnvloeden, meestal resulterend in een verminderde hartfunctie. Vochtverlies, dat meestal te wijten is aan bloedverlies en verdamping, moet worden tegengegaan met de constante infusie van geschikte oplossingen zoals 12,5% albumine opgelost in 0,9% NaCl, wat we aanbevelen. Omdat de aanpak zeer invasief is, is niet minder belangrijk de opname van een krachtig analgeticum zoals Buprenorfine om invloeden op cardiovasculaire functies te minimaliseren die worden opgeroepen door onvoldoende pijnvermijding. We injecteren het pijnstillende medicijn vóór intubatie. Het is belangrijk om de injectie ~ 30 minuten voordat de hele procedure wordt gestart uit te voeren, vooral als de operator ervaren is, en dus snel, om een goed analgetisch effect te bereiken dat pijn tijdens de onderzoeksfase vermijdt. Bovendien moeten bij het werken met zwaarlijvige modellen waarschijnlijk hogere doses worden overwogen vanwege de hoge lipofiliciteit van deze stof. Ten slotte kan dit protocol ook worden gewijzigd bij het bepalen van de respons op andere catecholaminerge stimuli zoals dobutamine of epinefrine; zoals bijvoorbeeld gedaan door Calligaris en collega's22 die de analyse in intraventriculaire druk tijdens dobutaminestimulatie beschreven.
Met betrekking tot de registratie en analyse van PVL-metingen zijn er verschillende stappen die moeten worden overwogen. Ten eerste is het van overweldigend belang om PVL-opnames consistent te analyseren in een experimentele dataset. Ademhalingsartefacten die evolueren als gevolg van wisselende pulmonale druk die resulteert in afwisselende cardiale voorspanning tijdens mechanische beademing, moeten worden vermeden door de ventilator tijdens de opnames uit te schakelen. Om ademhalingsartefacten verder te elimineren, raden we aan om de spierverslapper pancuronium te gebruiken om samentrekkingen van het diafragma te voorkomen die vaak worden gezien tijdens isofluraan-anesthesie. Bovendien maakt het mogelijk om de ventilatie bij het eindverval te stoppen en alle geselecteerde lussen te analyseren, in tegenstelling tot andere protocollen die aanbevelen om 8-10 lussen te selecteren en vervolgens 5-6 eind-expiratoire lussen te identificeren die vervolgens worden geanalyseerd23. Belangrijk is dat perioden van apneu kort moeten worden gehouden om hypoventilatie te voorkomen die resulteert in hypercapnie en respiratoire acidose. Om de oxygenatie te verbeteren en de vorming van atelectase te voorkomen, onderzochten we eerder het gebruik van PEEP-ventilatie tijdens PVL-metingen bij muizen6. Selecteer bij het selecteren van lussen voor de analyse van vooraf geladen onafhankelijke gegevens de eerste 5-6 lussen met een afnemend einddiastolisch volume en vermijd het opnemen van lussen waarbij alleen de druk afneemt, maar het volume constant is. Verder mogen extra beats niet in de analyse worden opgenomen, omdat ze de PVL-parameters cruciaal beïnvloeden. Opmerkelijk is dat aritmische slagen meestal optreden als gevolg van contact tussen de occlusienaad en het muizenhart. Kalibratie voor parallelle geleiding via infusie van hypertone zoutoplossing heeft een enorme impact op parameters van de hartfunctie en zou, naar ons begrip, moeten worden uitgevoerd aan het einde van een experiment6. Met name vanwege de impact op de hartfunctie wordt kalibratie voor parallelle geleiding slechts één keer uitgevoerd tijdens het protocol. De parallelle geleiding verandert echter enigszins tijdens het protocol, als gevolg van veranderingen in de vorm van de ventrikels bij adrenerge stimulatie. Er zijn toelatingssystemen voor PVL-beoordelingen bij muizen beschikbaar die geen zoutoplossingkalibraties nodig hebben en die de parallelle geleiding dynamisch kunnen berekenen tijdens PVL-opnames. De nauwkeurigheid van deze methode staat echter nog steeds ter discussie5,8,24,25.
We hebben op basis van onze observaties vastgesteld dat bij gebruik van dit protocol bij volwassen gezonde mannelijke muizen van het wilde type (d.w.z. C57Bl6 / N), de systolische druk in het bereik ligt van 70 mmHg tot 90 mmHg bij baseline en tussen 80 en 100 mmHg tijdens maximale stimulatie met de β-adrenoreceptor-agonist isoproterenol. Evenzo werd waargenomen dat het slagvolume bij baseline tussen 13 μL en 20 μL lag en tussen 20 μL en 35 μL tijdens maximale stimulatie. De hartslag was ongeveer 450 tot 520 slagen per minuut bij baseline en kan tijdens maximale stimulatie ruim boven de 650 slagen per minuut uitkomen. Wat de preload-onafhankelijke cardiale contractiliteit betreft, werd de meest robuuste parameter preload recruitable stroke work (PRSW) adequaat geacht tussen 60 mmHg tot 80 mmHg bij baseline en tussen 100 mmHg en 140 mmHg tijdens maximale stimulatie. Als de uitgangsparameters aanzienlijk afwijken van de parameters die gewoonlijk worden verkregen, of wanneer de hartfunctie ongepast reageert op β-adrenerge stimulatie, moeten complicaties (bijv. niet-waargenomen bloedverlies, daling/stijging van de lichaamstemperatuur of verdovingsover/onderdosis) in aanmerking worden genomen.
Bovendien kunnen sommige artefacten ontstaan tijdens PVL-metingen bij muizen. Het meest voorkomende artefact is de end-systolische druk-piek (ESPS, Figuur 2C), die het gevolg is van katheter beknelling en het is gemakkelijk te verhelpen door de katheter voorafgaand aan de basale metingen opnieuw te positioneren op 0 ng / min isoproterenol. Metingen mogen niet beginnen voordat ESPS'en zijn uitgeroeid bij baselineomstandigheden om zinvolle gegevens te verkrijgen, omdat ESPS verschillende parameters van de hartfunctie kan beïnvloeden6. Wanneer een ESPS echter optreedt tijdens incrementele stimulatie met isoproterenol als gevolg van veranderde ventriculaire morfologie in metingen die niet worden beïnvloed bij baseline, is dit niet te corrigeren, omdat herpositionering van de katheter de parallelle geleiding tijdens het dosisresponsprotocol zou veranderen. Men moet dit nauwkeurig onderzoeken, omdat, net als die bij baseline, is aangetoond dat deze ESPS'en de parameters van de hartfunctie aanzienlijk veranderen, niet alleen door een aanzienlijk verhoogde maximale druk13,26, maar ook door verminderde volumedetectie6.
Representatieve waarden voor hemodynamische parameters verkregen door PVL-metingen onder basislijnomstandigheden en tijdens incrementele stimulatie met isoproterenol bij muizen variëren sterk met verschillende methodologische benaderingen en in verschillende muizenstammen27,28. Daarnaast moet men zich ervan bewust zijn dat fenotypen van genetisch veranderde muizen ook beperkt kunnen zijn tot verschillende genetische achtergronden. Methodologisch zijn er twee belangrijke benaderingen voor het uitvoeren van druk-volumeanalyse bij muizen. Elke methode heeft zijn (dis)voordelen en de methode van keuze hangt vaak af van de ervaringen van het lab en zijn onderzoekers. We richten ons hier op de open-borstprocedure, waarbij de katheter via een punctie op de apex wordt geplaatst. Deze aanpak heeft de vooruitgang van katheterplaatsing onder zicht die een nauwkeurige katheterpositionering mogelijk maakt, een essentiële voorspeller voor de registratie van zinvolle gegevens over de hartfunctie bij muizen. Dit geldt met name voor de registratie van volumeparameters in het bereik van microliters. Een cruciaal aspect van deze benadering is daarentegen het verlies van fysiologische intra-thoracale druk, resulterend in instortende longen en atelectasevorming en een hoger verlies van lichaamsvocht. Door echter positieve end-expiratory pressure (PEEP) beademing te gebruiken, beschrijven we hier een strategie die heeft bewezen longschade tegen te gaan tijdens pvl met open borst bij muizen6. De tweede experimentele benadering is om de katheter via de halsslagader in te brengen en vervolgens retrograde door de aortaklep. Door deze techniek te gebruiken, kan de intra-thoracale druk vrij normaal worden gehouden, hoewel mechanische ventilatie nog steeds nodig is, wat dit voordeel verzwakt. Verder beperkt de gesloten borstbenadering de mogelijkheden van de onderzoekers voor nauwkeurige katheterpositionering. Bovendien hebben PV-katheters die bij muizen worden gebruikt diameters variërend van 1 tot 1,4 Frans (0,33 mm tot 0,47 mm), wat een aanzienlijke obstructie van het muriene uitstroomkanaal impliceert bij gebruik van de gesloten borstbenadering, omdat aorta's van volwassen muizen meestal diameters hebben tussen 0,8 mm en 1,2 mm29,30. Wat betreft het gebruik van PVL in hartfalenmodellen is de open-borstbenadering van bijzonder belang voor transversale aortavernauwingsmodellen, waarbij de vernauwing zich bevindt tussen de innominate slagader en de linker halsslagader. Hier kan de katheter niet via de halsslagader geplaatst worden. Aan de andere kant is de gesloten borstbenadering van belang voor onderzoekers die muriene modellen van verwijde ventrikels onderzoeken, zoals na de inductie van een hartinfarct, waarbij punctie van de top niet haalbaar is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er hoeft geen belangenconflict te worden aangegeven.
Acknowledgments
We zijn Manuela Ritzal, Hans-Peter Gensheimer, Christin Richter en het team van de Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung (IBF) van de Universiteit van Heidelberg dankbaar voor deskundige technische assistentie.
Dit werk werd ondersteund door het DZHK (Duits Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek), het BMBF (Duitse Ministerie van Onderwijs en Onderzoek), een Innovatiefonds van de deelstaat Baden-Württemberg en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Project-ID 239283807 - TRR 152, FOR 2289 en het Collaborative Research Center (SFB) 1118.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.4F SPR-839 catheter | Millar Instruments, USA | 840-8111 | |
| 1 ml syringes | Beckton Dickinson, USA | REF303172 | |
| Bio Amplifier | ADInstruments, USA | FE231 | |
| Bridge-Amplifier | ADInstruments, USA | FE221 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth, Germany | 8076.2 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Bayer, Germany | 4007221026402 | |
| Calibration cuvette | Millar, USA | 910-1049 | |
| Differential pressure transducer MPX | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 39912 | |
| Dumont Forceps #5/45 | Fine Science tools Inc. | 11251-35 | |
| Dumont Forceps #7B | Fine Science tools Inc. | 11270-20 | |
| Graefe Forceps | Fine Science tools Inc. | 11051-10 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Ver. 8.3.0 | |
| EcoLab-PE-Micotube | Smiths, USA | 004/310/168-1 | |
| Etomidate Lipuro | Braun, Germany | 2064006 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Heparin | Ratiopharm, Germany | R26881 | |
| Hot plate and control unit | Labotec, Germany | Hot Plate 062 | |
| Isofluran | Baxter, Germany | HDG9623 | |
| Isofluran Vaporizer | Abbot | Vapor 19.3 | |
| Isoprenalinhydrochloride | Sigma-Aldrich, USA | I5627 | |
| Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID | Smiths Medical International Ltd, UK | Ref. 800/100/100 | |
| MiniVent ventilator for mice | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 845 | |
| MPVS Ultra PVL System | Millar Instruments, USA | ||
| NaCl | AppliChem, Germany | A3597 | |
| NaCl 0.9% isotonic | Braun, Germany | 2350748 | |
| Pancuronium-bromide | Sigma-Aldrich, USA | BCBQ8230V | |
| Perfusor 11 Plus | Harvard Apparatus | Nr. 70-2209 | |
| Powerlab 4/35 control unit | ADInstruments, USA | PL3504 | |
| Rechargeable cautery-Set | Faromed, Germany | 09-605 | |
| Scissors | Fine Science tools Inc. | 140094-11 | |
| Software LabChart 7 Pro | ADInstruments, USA | LabChart 7.3 Pro | |
| Standard mouse food | LASvendi GmbH, Germany | Rod18 | |
| Stereo microscope | Zeiss, Germany | Stemi 508 | |
| Surgical suture 8/0 | Suprama, Germany | Ch.B.03120X | |
| Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge | Beckton Dickinson, USA | 393224 | |
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science tools Inc. | 00574-11 | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| Syringe filter (Filtropur S 0.45) | Sarstedt, Germany | Ref. 83.1826 |
References
- Bacmeister, L., et al. Inflammation and fibrosis in murine models of heart failure. Basic Research in Cardiology. 114 (3), 19 (2019).
- Hartupee, J., Mann, D. L. Neurohormonal activation in heart failure with reduced ejection fraction. Nature Reviews Cardiology. 14 (1), 30-38 (2017).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovascular Research. 39 (1), 60-76 (1998).
- Lefkowitz, R. J., Rockman, H. A., Koch, W. J. Catecholamines, cardiac beta-adrenergic receptors, and heart failure. Circulation. 101 (14), 1634-1637 (2000).
- Cingolani, O. H. K. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 2198-2206 (2011).
- Bacmeister, L., et al. Assessment of PEEP-Ventilation and the Time Point of Parallel-Conductance Determination for Pressure-Volume Analysis Under beta-Adrenergic Stimulation in Mice. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 36 (2019).
- Segin, S., et al. Cardiomyocyte-Specific Deletion of Orai1 Reveals Its Protective Role in Angiotensin-II-Induced Pathological Cardiac Remodeling. Cells. 9 (5), (2020).
- Clark, J. E., Marber, M. S. Advancements in pressure-volume catheter technology - stress remodelling after infarction. Experimental Physiology. 98 (3), 614-621 (2013).
- Glower, D. D., et al. Linearity of the Frank-Starling relationship in the intact heart: the concept of preload recruitable stroke work. Circulation. 71 (5), 994-1009 (1985).
- Winter, E. M., et al. Left ventricular function in the post-infarct failing mouse heart by magnetic resonance imaging and conductance catheter: a comparative analysis. Acta Physiologica. 194 (2), 111-122 (2008).
- Krenz, M. Conductance, admittance, and hypertonic saline: should we take ventricular volume measurements with a grain of salt. Journal of Applied Physiology. 107 (6), 1683-1684 (2009).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nature Protocols. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Wei, A. E., Maslov, M. Y., Pezone, M. J., Edelman, E. R., Lovich, M. A. Use of pressure-volume conductance catheters in real-time cardiovascular experimentation. Heart, Lung and Circulation. 23 (11), 1059-1069 (2014).
- van Hout, G. P., et al. Admittance-based Pressure-Volume Loops versus gold standard cardiac magnetic resonance imaging in a porcine model of myocardial infarction. Physiological Reports. 2 (4), 00287 (2014).
- Wei, C. L., Shih, M. H. Calibration Capacity of the Conductance-to-Volume Conversion Equations for the Mouse Conductance Catheter Measurement System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 56 (6), 1627-1634 (2009).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
- Weiss, J. L., Frederiksen, J. W., Weisfeldt, M. L. Hemodynamic determinants of the time-course of fall in canine left ventricular pressure. Journal of Clinical Investigation. 58 (3), 751-760 (1976).
- Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavioral Research Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
- Jacoby, C., et al. Direct comparison of magnetic resonance imaging and conductance microcatheter in the evaluation of left ventricular function in mice. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 87-95 (2006).
- Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Estimation of parallel conductance by dual-frequency conductance catheter in mice. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 443-450 (2000).
- Calligaris, S. D., Ricca, M., Conget, P. Cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50050 (2013).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e52942 (2015).
- Pearce, J. A., Porterfield, J. E., Larson, E. R., Valvano, J. W., Feldman, M. D. Accuracy considerations in catheter based estimation of left ventricular volume. Conference proceedings - IEEE engineering in medicine and biology society. 2010, 3556-3558 (2010).
- Nielsen, J. M., et al. Left ventricular volume measurement in mice by conductance catheter: evaluation and optimization of calibration. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (1), 534-540 (2007).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (111), e53810 (2016).
- Barnabei, M. S., Palpant, N. J., Metzger, J. M. Influence of genetic background on ex vivo and in vivo cardiac function in several commonly used inbred mouse strains. Physiological Genomics. 42 (2), 103-113 (2010).
- Oosterlinck, W., Vanderper, A., Flameng, W., Herijgers, P. Glucose tolerance and left ventricular pressure-volume relationships in frequently used mouse strains. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 281312 (2011).
- Guo, X., Kono, Y., Mattrey, R., Kassab, G. S. Morphometry and strain distribution of the C57BL/6 mouse aorta. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (5), 1829-1837 (2002).
- Weiss, R. M., Ohashi, M., Miller, J. D., Young, S. G., Heistad, D. D. Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice. Circulation. 114 (19), 2065-2069 (2006).
