Summary
Burada, farelerdeki içsel kardiyak fonksiyonu ve β-adrenerjik rezervi belirlemek için artan intravenöz aşılanmış izoproterenol dozları altında bir kardiyak basınç hacmi döngü analizi açıklıyoruz. Basınç hacmi döngüsü ölçümleri için, pozitif uç-ekspiratör basınçlı havalandırmayı dahil ettiğimiz modifiye edilmiş bir açık göğüs yaklaşımı kullanıyoruz.
Abstract
Kardiyak fonksiyonun belirlenmesi, belirli tedavilerin kalp üzerindeki etkilerini karakterize etmek için kardiyovasküler hastalıkların hayvan modellerinde sağlam bir uç nokta analizidir. Genetik manipülasyonların fizibilitesi nedeniyle fare, kardiyak fonksiyonu incelemek ve yeni potansiyel terapötik hedefler aramak için en yaygın memeli hayvan modeli haline gelmiştir. Burada, bazal koşullar sırasında basınç hacmi döngüsü ölçümleri ve analizleri kullanılarak ve artan izoproterenol konsantrasyonlarının intravenöz infüzyonu ile β-adrenerjik stimülasyon altında kardiyak fonksiyon in vivo'yu belirlemek için bir protokol açıklıyoruz. Açık göğüs ölçümleri sırasında olumsuz etkileri iyileştirmek için pozitif uç-ekspiratuar basıncı dikkate alarak havalandırma desteği ve işlem sırasında ağrının uyandırdığı kontrol edilemeyen miyokard stresini önlemek için güçlü analjezi (Buprenorfin) dahil olmak üzere rafine bir protokol sunuyoruz. Prosedürün ayrıntılı açıklaması ve olası tuzaklar hakkındaki tartışma, son derece standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir basınç hacmi döngü analizi sağlar ve olası metodolojik önyargıyı önleyerek hayvanların deneysel kohorttan dışlanmasını azaltır.
Introduction
Kardiyovasküler hastalıklar tipik olarak kardiyak fonksiyonu etkiler. Bu konu, hayvan hastalıkları modellerinde in vivo detaylı kardiyak fonksiyonun değerlendirilmesinde önemine işaret eder. Hayvan deneyleri, üç Rs (3R) kılavuz prensibinin (Küçült/İyileştir/Değiştir) bir çerçevesi ile çevrilidir. Mevcut gelişim düzeyinde sistemik yanıtları (yani kardiyovasküler hastalıkları) içeren karmaşık patolojilerin anlaşılması durumunda, ana seçenek mevcut yöntemleri iyileştirmektir. Arıtma ayrıca, daha az değişkenlik nedeniyle gerekli hayvan sayılarının azaltılmasına yol açacak ve bu da analiz ve sonuçların gücünü artıracaktır. Ek olarak, kardiyak kontrtinaklık ölçümlerinin nörohumoral stimülasyon veya aort bandı gibi basınç aşırı yüklenmesi de dahil olmak üzere kalp hastalığının hayvan modelleri ile kombinasyonu, örneğin değiştirilmiş katekolamin / β-adrenerjik seviyeleri1,2,3,4, klinik öncesi çalışmalar için güçlü bir yöntem sağlar. Kateter bazlı yöntemin kardiyak kontrtinaks derinlemesine değerlendirilmesi için en yaygın kullanılan yaklaşım olmaya devam ettiğini göz önünde bulundurarak5, bu yaklaşımın belirli parametrelerinin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere önceki deneyime dayanarak β-adrenerjik stimülasyon sırasında basınç hacmi döngüsü (PVL) ölçümleri ile farelerde in vivo kardiyak fonksiyonun rafine bir ölçümünü sunmayı amaçladık6, 7.
Görüntüleme veya kateter bazlı teknikler içeren kardiyak hemodinamik parametre yaklaşımlarını belirlemek için mevcuttur. Her iki seçeneğe de ilgili bilimsel soru için dikkatle düşünülmeleri gereken avantajlar ve dezavantajlar eşlik eder. Görüntüleme yaklaşımları ekokardiyografi ve manyetik rezonans görüntülemeyi (MRG); her ikisi de farelerde başarıyla kullanılmıştır. Ekokardiyografik ölçümler, farelerin yüksek kalp atış hızı için gerekli olan yüksek hızlı bir probdan yüksek başlangıç maliyetlerini içerir; nispeten basit, invaziv olmayan bir yaklaşımdır, ancak ideal olarak kardiyak yapıları tanıma ve görselleştirme deneyimi yaşaması gereken operatörler arasında değişkendir. Ayrıca doğrudan basınç ölçümü yapamayan ve boyut büyüklükleri ile akış ölçümlerinin birleşiminden hesaplamalar elde edilmektedir. Öte yandan, aynı hayvan üzerinde birkaç ölçüm yapılabilmesi ve örneğin hastalığın ilerlemesi sırasında kardiyak fonksiyonun izlenebilmesi avantajına sahiptir. Hacim ölçümü ile ilgili olarak, MRI altın standart prosedürdür, ancak ekokardiyografiye benzer şekilde, doğrudan basınç ölçümü mümkün değildir ve sadece ön yüke bağımlı parametreler elde edilebilir8. Sınırlayıcı faktörler aynı zamanda kullanılabilirlik, analiz çabası ve işletme maliyetleridir. Burada kardiyak fonksiyonu ölçmek için kateter tabanlı yöntemler, ayrıca intra kardiyak basıncın doğrudan izlenmesine ve önceden yük işe alınabilen inme çalışması (PRSW)9gibi yükten bağımsız sözleşme parametrelerinin belirlenmesine izin veren iyi bir alternatiftir. Bununla birlikte, basınç iletim kateteri ile ölçülen ventrikül hacimleri (iletkenlik tayini yoluyla) MRI'dan daha küçüktür, ancak grup farklılıkları aynı aralıkta korunur10. Güvenilir hacim değerlerini belirlemek için, PVL ölçümleri sırasında kritik bir adım olan ilgili kalibrasyon gereklidir. Hacim kalibreli cuvettelerde kan iletkenliğinin ex vivo ölçümlerini (iletkenliğin hacme dönüştürülmesi) hipertonik salin11,12'ninbolus enjeksiyonu sırasında miyokardın paralel iletkenliği için in vivo analiz ile birleştirir. Bunun ötesinde, kateterin ventrikül içinde konumlandırılması ve elektrotların ventrikülün boyuna ekseni boyunca doğru yönlendirilmeleri, kendileri tarafından üretilen çevredeki elektrik alanının algılama kabiliyeti için kritik öneme sahiptir. Hala fare kalbinin küçültülmüş boyutu ile kateterin intraventrikül yöneliminde değişikliklerle üretilen eserlerden kaçınmak mümkündür, hatta genişlemiş ventriküllerde5,10, ancak eserler β-adrenerjik stimülasyon altında gelişebilir6,13. İlan yöntemlerine ek olarak, kalibrasyon adımlarını önlemek için kabul tabanlı yöntemin geliştirilmesi ortaya çıktı, ancak burada hacim değerleri oldukça fazla tahmin edildi14,15.
Fare kardiyovasküler araştırmalarda en önemli klinik öncesi modellerden biri olduğundan ve β-kalbin adrenerjik rezervi kardiyak fizyoloji ve patolojide merkezi bir ilgi alanı olduğundan, burada β-adrenerjik stimülasyon sırasında PVL ölçümleri ile farelerde in vivo kardiyak fonksiyonu belirlemek için rafine bir protokol sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Karlsruhe Bölge Konseyi ve Heidelberg Üniversitesi yönetmeliklerine göre onaylanmış ve gerçeklendirilmiştir (AZ 35-9185.82/A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63/AB sayılı Bilimsel Amaçlarla Kullanılan Hayvanların KorunmasıNa İlişkin Direktifi'ne uygundur. Bu protokolde gösterilen veriler, vahşi tip C57Bl6/N erkek farelerden (17 ± 1,4 haftalık) türetilmiştir. Fareler, Heidelberg Tıp Fakültesi'nin hayvan tesisinde (IBF) belirtilen patojensiz koşullar altında muhafaza edildi. Fareler, 12 saatlik açık-karanlık bir döngüde, % 56-60 arasında bağıl nem, saatte 15 kat hava değişimi ve 22 ° C +/ - 2 ° C oda sıcaklığı ile yerleştirildi. Zenginleştirme olarak hayvan yatakları ve doku kağıtları ile sağlanan geleneksel kafesler tip II veya tip II'de tutuldular. Ad libitumtüketmek için standart otoklavlı gıda ve otoklavlı su mevcuttu.
1. Aletlerin ve ilaç çözeltilerinin hazırlanması
- Merkezi venöz kateter: Mikro tüpü (0,6 mm dış çap) ~20 cm uzunluğunda kateter tüpleri halinde kesin. Tüpün bir ucunu 23 kalibrelik bir canülün ucuna çekmek için tokalar kullanın. Uyluk damarını delebilecek keskin bir uç oluşturmak için borunun diğer ucunu çapraz olarak kesin.
- Endotrakeal tüp: Entübasyon tüpü için şırıng ataşmanını çıkarmak için 3 cm uzunluğunda 20 kalibrelik bir venipuntür-kavun kesin.
- Entübasyon tüpü ventilatör bağlantısına mükemmel uymuyorsa, parafilm havalandırma cihazının bağlı olduğu tüpün ucuna sarın. Bağlantı sabit olmalı ve kalınlaşma ile kapatılmalıdır (Şekil 1A). 20 kalibrelik venipuntür-canülün metal kılavuz pimini 2,7 cm'ye kısaltın ve entübasyon yardımı olarak kullanın. Trakeanın görselleştirilmesini kolaylaştırmak için hafif lifler de dahil olmak üzere entübasyon için rafine yaklaşımlar da iyi tanımlanmıştır, örneğin Das ve işbirlikçileri tarafından16.
- Entübasyon için kullanılan anestezik karışım: 200 μL heparin (1000 IU/mL) ile %0,9 NaCl 50 μL ve sudaki yağ emülsiyon bazlı bir üründen 750 μL 2 mg/mL etomidat karıştırın. Her fare için 7 μL/g vücut ağırlığı (BW) kullanın (0,1 mg/kg BW Buprenorfin 10 mg/kg BW etomidat).
- Kas gevşetici: 100 mg Pancuronium-bromürü 100 mL'de% 0.9 NaCl çözün. Her fare için 1,0 μL/g vücut ağırlığı (1 mg/kg BW) kullanın.
- İzoproterenol çözeltileri: 100 mg izoproterenolün 100 mL'lik %0,9 NaCl'de (1 μg/μL) çözün. Aşağıdaki seyreltmeleri hazırlayın (Tablo 1) ve her birini 1 mL şırıng içinde aktarın.
- Seyreltme 1 elde etmek için, stoku seyreltin 1:1.8. Seyreltme 2 elde etmek için, stoku 1:6 seyreltin. Seyreltme 3 elde etmek için seyreltme 1'i 1:10'a seyreltin. Son olarak, seyreltme 4'ü 1:10 seyreltme 2 ile elde edin.
- %15 Hipertonik NaCl (w/v): 10 mL çift damıtılmış H2O'da 1,5 g%0,9 NaCl çözün.
- %12,5 albümin çözeltisinin hazırlanması (w/v): 1,25 gr sığır serum albüminini %0,9 NaCl'nin 10 mL'sinde çözün. Çözeltiyi 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. Oda sıcaklığına kadar soğutun ve çözeltiyi 0,45 μm gözenek şırınna filtresi ile filtreleyin.
- Kurulumun hazırlanması: önce ısıtma plakasını değiştirin ve 39-40 °C'ye ayarlayın. Isıtma yastığına tuzlu su dolu bir şırınna yerleştirin ve basınç hacmi döngüsü (PVL) kateterini şırınna aktarın. Stabilizasyon için kullanmadan önce kateteri en az 30 dakika önceden kuluçkaya yatırın. Kullandığımız kurulum 1.4-F basınç iletim kateteri, bir kontrol ünitesi ve ilgili yazılımdan oluşur ve Şekil 1B'de grafiksel olarak açıklanmıştır ve sağlayıcı referansları Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
2. Anestezi
- Entübasyondan 30 dakika önce buprenorfin (0.1 mg/kg BW intraperitoneally) enjekte edin.
- Fareyi% 2,5 izofluran ile önceden doymuş ve odanın tabanına yerleştirilmiş bir ısıtma yastığı ile önceden ısıtılmış akrilik bir cam hazneye yerleştirin.
- Fare uyur uyumaz (refleks eksikliği), 10 mg/kg etomidat ve heparin (1.200 IU/kg BW) içeren anestezik karışımı (7 mL/kg BW) intraperitoneal olarak enjekte edin.
3. Havalandırma
- Hayvanı anestezi enjeksiyonundan3-4dakika sonra entübasyon platformuna ( Şekil 1C ) aktarın. Fare, operatöre bakan sırt görünümü ile dişlerden sarkır.
- Dili yavaşça tostlarla kaldırın. Glottileri tanımlamak için, farenin alt çenesini ikinci tokmaklarla hafifçe kaldırın.
- Endotrakeal tüpü (Şekil 1A) nefes borusuna dikkatlice yerleştirin ve kılavuz çubuğu çıkarın.
- Hayvanı ısıtma plakasına aktarın, arkaya yerleştirin ve entübasyon tüpünü küçük hayvan solunum cihazına bağlayın.
- Solunum hızını 53,5 x (Gram olarak vücut ağırlığı)-0,26 [dk-1],diğerleri tarafından açıklandığı gibi12ve gelgit hacimlerini 11 ± 1 cmH2O'luken yüksek inspiratuar basınçlara ayarlayın.
- Farenin ekstremitelerini yapışkan şeritlerle ısıtma plakasına dikkatlice sabitleyin ve kuruluğu önlemek için her iki göze de göz merhemi uygulayın.
- Bir rektal sıcaklık probu yerleştirin ve çekirdek vücut sıcaklığını 37 ± 0,2 °C'de koruyun.
- 1 kurşunlu bir EKG takın ve anestezi derinliği ve stabilitesi için bir gösterge olarak kalp atış hızını çevrimiçi izleyin.
- Interdigital reflekslerin yokluğunda, kas gevşetici panküronyum-bromürün intraperitoneal olarak 1 mg / kg BW enjekte edin. Bu, PVL ölçümleri sırasında solunum yapıtlarını önler.
4. Cerrahi
- Genel öneriler
- Ameliyat sırasında, O2ile buharlaşan ~% 1.5-2 izofluran ile havalandırın. Izofluran konsantrasyonu fare zorlanması, cinsiyet, yaş ve hayvanların ağırlığı gibi değişkenlere de bağlı olabilir, ancak bireysel ve deneysel olarak belirlenmesi gerekir ve buradaki değerler C57BL6 / N fare zorlanması için referanstır. Daha da önemlisi, ventilatör operatörün izofluran solumasını önlemek için bir ekstraksiyon sistemine bağlanır.
- Cerrahi işlemler için stereo mikroskoptan 1,5-4x arasında bir büyütme kullanın.
NOT: Hayvanın sağkalımsız ameliyatlara hazırlanması konusunda kurumsal/yerel rehberliğe bakın.
- Femoral kanülasyon
- Hindlimb'i% 70 etanol ile durulayın, sol kasık bölgesini inkütün ve sol femoral damarı ortaya çıkar.
- Epigastrik arteri ve damarı bir koterle patlatın.
- Femoral damarı kateter erişimine distal yerleştirilmiş bir dikişle lige edin.
- Femoral damarın altına bir dikiş geçirin ve delinme bölgesinin bir düğüm kranialini hazırlayın. 1 mL şırıngaya bağlı hazırlanan mikro tüple (bkz. adım 1.1) uyluk damarını delin.
- Damarın içindeki tüpü sabitlemek için düğümü bağlayın.
- Otomatik şırıng pompası ile 15 μL/dk infüzyon oranında %12,5 albümin ile desteklenmiş %0,9 NaCl infüzyonu ile sıvı kaybına karşı koyma. Ayrıca, önceden ısıtılmış% 0.9 NaCl kullanarak maruz kalan doku nemli tutun.
- Torakotomi
- Toraksı% 70 etanol ile durulayın.
- Ksifoid işleminin hemen altındaki cildi inklüzy edin ve pektoral kasları göğüs duvarından sert bir şekilde önps veya koter ile ayırın.
- Ksifoid işlemini uzunlatır ve diyafram aşağıdan tamamen görünene kadar bir koterle her iki tarafta yanal olarak hareket eden göğüs duvarını kesin.
- Diyaframı aşağıdan inşize edin ve kalp apeksini açığa çıkarın. Daha sonra perikardiyumups ile dikkatlice çıkarın.
- Daha önce açıklandığı gibi sol tarafta sınırlı bir costotomi gerçekleştirin6.
- Daha sonraki aşamalarda ön yük azaltma yapmak için alt kaval damarın altına bir dikiş geçirin.
- Kalp apeksini 25 kalibrelik bir kavunla (maksimal 4 mm) hafifçe delin. Tüm elektrotlar ventrikül içinde olana kadar kalıbını çıkarın ve PV kateterini yerleştirin.
- Kateterin konumunu yumuşak hareketlerle ayarlayın ve dikdörtgen şekilli döngüler elde edilene kadar döner (Şekil 2A).
- Önceden ısıtılmış % 0.9 NaCl kullanarak her zaman maruz kalan tüm doku nemli tutun.
5. Ölçümler
- Genel öneriler
- Ölçümler sırasında % 100 O 2 ile buharlaştırılmış ~% 1.5-2 izofluran ile havalandırın.
- Doz yanıt protokolünün her adımında 2 taban çizgisi ölçümünün yanı sıra 2 vena kava tıkanıklığı gerçekleştirin.
NOT: Birinci ve ikinci vena kava tıkanıklığından sonra hem basınç hem de hacim değerlerinin ilk tıkanıklık öncesinde olduğu gibi sabit hal değerlerine dönmesi önemlidir. Bu gözlem, intraventriküler hacimdeki seri azalmalar nedeniyle kateter pozisyonundaki bir kaymayı tanımak için gereklidir. Kateter pozisyonunda bir kayma söz konusuysa, özellikle hacim değerleri kaydırılır.
- Parametrelerin (kalp atış hızı, inme hacmi, dP/dtmax)on-line analizini yapın ve sabit durum kardiyak fonksiyon elde edilene kadar bekleyin. C57Bl6/N farelerde burada kullanılan ayar ile beklenen parametre aralığı için lütfen yayınlanan sonuçlara bakın6.
- Solunum cihazını son ekspirasyon pozisyonunda durdurun ve temel parametreleri kaydedin. 3 ila 5 saniye sonra, ön yükleme bağımsız parametreler elde etmek için alt kaval damarın altındaki dikişi ön yükleme bağımsız parametreler elde etmek için alt kaval damarının altındaki sütürlerips ile kaldırarak kardiyak pre yükü azaltın (Şekil 2B). Solunum cihazını açın. Hemodinamik parametreler stabilize olana kadar ikinci tıkanıklık için en az 30 saniye bekleyin.
- Bazal koşullarda ölçümleri aldıktan sonra hazırlanan şırınnalara geçerek izoproterenol doz-tepkisine geçin. Burada kardiyak ön yükün değiştirilmesini önlemek için infüzyon oranı değişmeden kalır. Şırındıcı değiştirirken hava kabarcıkları demlememeye dikkat edin.
- Yeni sabit durum kardiyak fonksiyon elde edilene kadar en az 2 dakika bekleyin, solunum cihazını son ekspirasyon pozisyonunda durdurun ve temel parametreleri kaydedin. 3 ila 5 saniye sonra, ön yükleme bağımsız parametreler elde etmek için alt kaval damarın altındaki dikişi kaldırarak kardiyak ön yükü azaltın.
- İkinci tıkanıklık için en az 30 saniye bekleyin. Daha sonra bir sonraki izoproterenol konsantrasyonu ile hazırlanan şırınnaya geçmek ve taban çizgisi kayıtlarını tekrarlamak ve bağımsız parametreleri önceden yüklemek.
NOT: Son sistolik basınç-ani yükselişi (ESPS, Şekil 2C)gibi yapılar, kateter tuzaklarından kaynaklanan izoproterenol dozajındaki artış sırasında ortaya çıkabilir. Bazal parametreler başlamadan önce ortaya çıkan eserler kateterin yeniden konumlandırılmasıyla kolayca düzeltilebilir.
6. Kalibrasyon
NOT: Kalibrasyon prosedürleri kullanılan PVL sistemine bağlı olarak değişebilir.
- Paralel iletkenlik kalibrasyonu
- İzoproterenol doz-yanıttan son ölçümden sonra femoral kanüle% 15 NaCl çözeltisi içeren bir şırıngan bağlayın. PVL çevrimiçi görselleştirme sırasında hafifçe sağa kayana kadar tüpte kalan 5 μL'lik hipertonik çözeltiyi dikkatlice demleyin. O zaman döngüler sabit duruma gelene kadar bekleyin.
- Solunum cihazını son kullanma tarihinde durdurun ve 2 ila 3 saniye içinde% 15 NaCl'nin 10 μL'lik bir bolusunu enjekte edin. Çevrimiçi görselleştirme sırasında PVL'nin büyük ölçüde genişleyip genişlemey olduğunu ve sağa kaydırılıp kaydırıldığını kontrol edin.
- Conductance-to-volume kalibrasyonu
- 5 dakika bekleyin, daha az değil, böylece hipertonik salin bolus tamamen seyreltilir. Daha sonra kateteri çıkarın ve 1 mL şırıngam ve 21 kalibrelik bir kanül kullanarak atan kalbin sol karıncıktan en az 600 μL kan alın. Bu noktada hayvan, derin anestezi ve analjezi altında, büyük kanama ile, havalandırmayı durdurarak ve kalbin çıkarılması ile ötenaziye tabir edilir.
- Kanı önceden ısıtılmış (37 °C'de bir su banyosunda) bilinen hacimli silindirlere sahip kalibrasyon cuvette içine aktarın. PV kateteri her silindire merkezi olarak yerleştirin ve iletkenliği kaydedin. Her hayvan için standart bir eğri hesaplanarak, iletkenlik birimleri mutlak hacim değerlerine dönüştürülebilir.
7. Analiz
- Bazal koşullar ve izoproterenol stimülasyonu altında başarılı PVL ölçümlerinden sonra, uygun bir PVL analiz yazılımı kullanarak kardiyak fonksiyonu karakterize eden parametreleri (PRSW, dP/dt, end-diyastolik basınç ve hacim, uç sistolik basınç ve hacim, gevşeme sabiti Tau gibi) görselleştirin, dijitalleştirin, hesaplayın ve ayıklayın. Standart analiz yazılımı ile daha fazla istatistiksel analiz ve grafiksel gösterimler yapılabilir.
- Ön yük bağımsız parametrelerinin analizi
NOT: Bu adım için prosedürü standartlaştırmak çok önemlidir.- Ön yükten bağımsız parametrelerin analizi için tüm ölçümler boyunca azalan ön yükü gösteren ilk 5-6 PVC'yi seçin (Şekil 2D). Ön yük azaltma sırasında analiz için seçilen sabit sayıda PVC, elde edilen parametrelerin ölçümleri arasındaki değişkenliği azaltacaktır.
- protokolün her adımındaki iki ölçümün ortalama değerini hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Basınç hacim döngüsü (PVL) ölçümü, ilaçların kardiyak farmakodinamiklerini analiz etmek ve genetiği değiştirilmiş fare modellerinin kardiyak fenotipini normal ve patolojik koşullar altında araştırmak için güçlü bir araçtır. Protokol, yetişkin fare modelinde kardiyak β-adrenerjik rezervin değerlendirilmesine izin verir. Burada, izoproterenol konsantrasyonlarını femoral ven kateteri ile aşılayarak β-adrenerjik stimülasyona kardiyak yanıta odaklanan buprenorfin (analjezik) ve panküronyum (kas gevşetici) ile birlikte izofluran anestezisi altında bir açık göğüs yöntemini açıklıyoruz. Bu protokolde gösterilen bazı temsili veriler C57Bl6/N tipi yetişkin erkek farelerden türetilmiştir (Şekil 3 ve Tablo 2). PVL analizimizle ölçülen bazı önemli parametrelerin değişkenliğinin göstergesi olarak, WT grubundan ve ücretsiz kullanılabilir G * Power yazılımı17'denelde edilen sonuçları kullanarak bir güç analizi (0.05 hata olasılığı ve 0.8 gücü α) gerçekleştirdik. Tablo 3'te kalp atış hızı, PRSW, inme hacmi, gevşeme sabiti Tau, dP/dtmax ve dP/dtmin için hesaplanan efekt boyutları ve gerekli örnek boyutları, 0, 0,825 ve 8,25 ng/min isoproterenol altındaki her parametre için %10 ila %30 arasında değişiklikler varsayarak gösterilmektedir.
Basınç hacmi ilişkilerinin grafik analizi, X eksenindeki Y ve basınç (mmHg) üzerindeki hacim (μL) çizilerek yapılır. Kateter ventrikül içine doğru bir şekilde yerleştirilirse, tam bir kardiyak döngü dikdörtgen şekilli bir PVL (Şekil 2A ve Şekil 3A)ile temsil edilir. Kısa bir süre sonra, systole, her iki kardiyak kapakçığın da kapatıldığı (sağ dikey kenar) izovolumetrik kasılma aşaması (dP / dtmaxile karakterize edilir) ile başlar. Ventrikül basıncı aort basıncını aştığında, aort kapağı açılır ve ejeksiyon aşamasında (üst yatay) aort içine kan pompalanır. Daha sonra, aort basıncı ventrikül basıncını aştığında, aort kapağı kapanır ve diyastole başlar. İsovolumetrik gevşeme sırasında (dP/dtmin ve Tau parametreleri ile karakterize edilir) ventrikül basıncı, atriyal basınç ventrikül basıncını aşana ve mitral kapak açılana (sol dikey kenar) kadar düşer. Şimdi, son diyastolik basınç hacmi ilişkisi (EDPVR) ile karakterize pasif diyastolik dolgu, bir sonraki kardiyak döngü başlayana kadar gerçekleşir (alt yatay) (Şekil 2A-B).
PVL analizi, kardiyak pre yükten bağımsız olarak kardiyak fonksiyonu belirleyebildiğinden, kardiyak fonksiyon hakkında ayrıntılı içgörüler sağlar. Bu nedenle, deneysel kurulumlarda kardiyak fonksiyonun belirlenmesinde altın standart olarak tanımlanmıştır5. C57Bl6/N fareler kullanılarak açıklanan protokolde kalp atış hızı, kardiyak çıkış, inme hacmi ve inme çalışması gibi kardiyak fonksiyonun genel parametreleri üzerinde üretilen izoproterenol yanıtını değerlendirdik. Izoproterenolün her parametre üzerinde önemli bir etkisi, doz yanıtında farklı izoproterenol konsantrasyonları altında gözlenir (Şekil 3B). PRSW ve dP/dtmax gibi kardiyak kontrtinaklık parametreleri izoproterenol infüzyonu altında doz yanıtında beklenen artışı göstermiştir (Şekil 3A-B). Öte yandan, diastolik parametrelerde (gevşeme tau ve dP / dtmin sabiti)artan izoproterenol konsantrasyonları ile bir azalma kaydedildi (Şekil 3C) sağlıklı kalpte katekolaminler tarafından üretilen pozitif bir lusitropik etkiden beklendiği gibi. Şekil 3'te gösterilen diğer parametreler (yani, son sistolik basınç ve hacim, uç-diyastolik basınç ve hacim, maksimal basınç, diğerleri arasında) PVL analizinden de elde edilir ve bilimsel soruya, genetik veya hastalık modeline ve elde edilen gözlemlere bağlı olarak da analiz edilebilir. PVL'deki en yaygın kardiyak fonksiyon parametreleri için ek ve ayrıntılı değerler, art artımlı β-adrenerjik stimülasyon sırasında, kardiyak hacim parametrelerini ve aynı zamanda kardiyak inotropi ve gevşemeyi de yüksek oranda etkileyen hipertonik salin ile paralel iletim için kalibrasyon zaman noktası da dahil olmak üzere, daha öncebildirilmiştir 1,6.
Şekil 1. Anestezi ve basınç hacmi döngü kurulumu. (A) Fare entübasyonu için uyarlanmış 20-gauge venipuncture-cannula. (B) Anestezik gazın akış yönü de dahil olmak üzere kullanılan basınç hacmi ölçüm kurulumunun farklı bileşenlerinin organizasyonununu ve bağlantısını gösteren diyagram. (C) Hızlı ve güvenli bir entübasyon için fareleri asmak için kullanılan entübasyon platformu. Fare ağırlığına bağlı olarak tehdidi sıkılaştırmak için asılı ipliğin (ii) sonundaki her iki taraftaki vidalar (i) dahil edilir. Ok, izofluran maruziyeti için bir bağlantı olasılığını gösterir. Sıcaklık: Sıcaklık; EKG: Elektrokardiyogram; MinPexp: Minimal ekspirasyon basıncı; MaxPexp: Maksimal ekspiratuar basınç; BD: Basınç hacmi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Temsili basınç hacmi analizi. (A) Bazal ölçüm sırasında analiz edilen parametrelerin gösterildiği ve kardiyak döngü sırasındaki ana olayların gösterildiği örnek basınç hacmi kayıtları. (B) Espvr, EDPVR ve PRSW parametreleri ön yük azaltma sırasında tasvir edilir. (C) Bazal ölçümler (üst panel) veya tıkanma manevrası (alt panel) sırasında her ikisi de izoproterenol stimülasyonu altında uç sistolik basınç artışları sunulmuştur. LV: Sol ventrikül; dP/dtdk: Minimum dP/dt; dP/dtmax: Maksimum dP/dt; Ves: Son sistolik hacim; Ved: Son diyastolik hacim; ESPVR: Son sistolik basınç-hacim ilişkisi; PRSW: İşe alınabilen inme işini önceden yükleyin; EDPVR: Son diyastolik basınç-hacim ilişkisi. Şekil önceki çalışmamızın ekinden uyarlandı 20196. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. C57BL6/N farelerde PVL ölçümlerinin analizi. (A) C57BL6/N kontrol farelerinden gelen ve artan izoproterenol konsantrasyonlarına maruz kalan düşük kaval damar tıkanıklığı sırasında temsili PVC'ler. (B) Bazal durumlar sırasında ve izoproterenol sırasında genel kardiyak fonksiyon, kalp atış hızı, kardiyak çıkış, inme hacmi ve inme çalışmasının analizi ile tanımlanır. (C) PRSW gibi kardiyak kontrtiyak ve diyastolik fonksiyonu, gevşeme sabiti Tau (WeissDenklemi 18)ve maksimal ve minimal dP/dt'yi değerlendirmek için ek parametreler analiz edildi. Veriler standart sapmanın ortalaması ± olarak sunulur. BPM: Dakika başına vuruş; PRSW: İşe alınabilen inme işini önceden yükleyin; n: fare sayısı. **p < 0.01: Eşleştirilmiş Öğrencinin bazal duruma karşı t testinden elde edilen p değerleri (izoproterenol = 0 ng/dk). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| İzoproterenol | Konsantrasyon (pg/μL) | infüzyon oranı (μL/dak) | Dozlar (ng/dk) |
| Stok | 1000 | ||
| Seyreltme 1 | 550 | 15 | 8.25 |
| Seyreltme 2 | 165 | 15 | 2.475 |
| Seyreltme 3 | 55 | 15 | 0.825 |
| Seyreltme 4 | 16.5 | 15 | 0.2475 |
Tablo 1. β-adrenerjik stimülasyonu artırmak için izoproterenol seyreltilmesi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
| İzoproterenol (ng/dak) | |||||
| 0 | 0.2475 | 0.825 | 2.475 | 8.25 | |
| Genel Parametreler ve Birimler | |||||
| Kalp Atış Hızı (bpm) | 470 ± 19,6 | 490 ± 19,3 | 542 ± 20,6 | 605 ± 20,5 | 638 ± 20,5 |
| Kontur Hacmi (μl) | 16.2 ± 2.6 | 17.6 ± 2.1 | 20.3 ± 2.8 | 22.3 ± 2.2 | 23,9 ± 2,5 |
| Kardiyak Çıkış (μl/dak) | 7627 ± 1210 | 8609 ± 1097 | 11000 ± 1616 | 13502 ± 1494 | 15291 ± 1761 |
| Son sistolik Hacim (μl) | 13 ± 3.1 | 10,5 ± 3,5 | 4,81 ± 2,3 | 1,94 ± 1,9 | 1,5 ± 1,7 |
| Son diyastolik Hacim (μl) | 27.4 ± 3 | 26.6 ± 3.0 | 24.1 ± 3.1 | 23.8 ± 2.6 | 24.8 ± 2.7 |
| Ortalama Basınç (mmHg) | 27,4 ± 2,2 | 28,6 ± 2,2 | 29.2 ± 1.9 | 29.7 ± 1.9 | 30,5 ± 1,9 |
| Arteriyel Elastance (mmHg/μl) | 4,44 ± 0,6 | 4.18 ± 0.7 | 3,46 ± 0,5 | 2,78 ± 0,9 | 2,91 ± 1 |
| Sistolik Parametreler | |||||
| İşe Alınabilen İnme çalışmasını önceden yükle | 67,8 ± 7,62 | 76,3 ± 9,85 | 96.1 ± 14.62 | 108 ± 14.56 | 113 ± 13.02 |
| ESPVR | 4,96 ± 1,29 | 5,15 ± 1,16 | 7.2 ± 2.28 | 17.3 ± 42.04 | 40 ± 107,55 |
| Çıkarma Kesir (%) | 52,59 ± 9,57 | 60,9 ± 9,94 | 80,23 ± 8,65 | 92.16 ± 7.2 | 94.18 ± 6.15 |
| Strok Çalışması (mmHg x μl) | 1007 ± 244,26 | 1153 ± 193 | 1399 ± 261 | 1582 ± 234 | 1720 ± 216 |
| Maksimum dP/dt (mmHg/s) | 6128,7 ± 1398,39 | 7087 ± 1401 | 8982,4 ± 1481 | 11422 ± 1477 | 13256 ± 1165 |
| Minimum dV/dt (μl/s) | - 523 ± 105.58 | - 613 ± 102 | - 835 ± 151 | - 1103 ± 165 | - 1273 ± 177 |
| Son sistolik Basınç (mmHg) | 70.8 ± 6.98 | 72,5 ± 7,42 | 69 ± 6,28 | 61.2 ± 17.36 | 68.2 ± 19.72 |
| Maksimum Güç (mmHg x μl/s) | 3009 ± 955,31 | 3541 ± 1188 | 4185 ± 1058 | 4272 ± 959 | 4918 ± 1418 |
| Diyastolik Parametreler | |||||
| EDPVR | 1 ± 0,93 | 1,23 ± 0,88 | 1,5 ± 0,86 | 1,87 ± 0,92 | 1,96 ± 0,99 |
| Tau (ms, Weissdenklemi) | 6,14 ± 0,64 | 5,67 ± 0,44 | 4,92 ± 0,44 | 4,83 ± 0,55 | 4,96 ± 0,65 |
| Minimum dP/dt (mmHg/s) | - 7272 ± 1403 | - 8119 ± 1295 | - 8998 ± 1240 | - 8618 ± 1129 | - 8648 ± 1468 |
| Son diyastolik Basınç (mmHg) | 5,29 ± 1,01 | 5,74 ± 1,07 | 5.6 ± 1.51 | 5,37 ± 1,13 | 5,76 ± 1,15 |
| Maksimum dV/dt (μl/s) | 765 ± 174 | 817 ± 178 | 972 ± 156 | 1158 ± 163 | 1264 ± 153 |
Tablo 2. C57BL6/N farelerde PVL ölçümlerinin analizi. Bazal koşullarda ve izoproterenol infüzyonu sırasında kardiyak fonksiyonun PVL parametreleri. Veriler, 18 erkek yetişkin fareden ortalama ± standart sapma olarak sunulmaktadır. BD: Basınç hacmi; BPM: Dakika başına vuruş; ESPVR: End-sistolik PV-İlişki eğimi, düşük ventrikül içi hacimlerde yetersiz hesaplama (2.475 ve 8.25 ng/dk İzoproterenol); EDPVR: End-diyastolik PV-İlişki, üstel regresyon (alfa katsayısı). Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
| Delta (%) | Efekt boyutu | Grup başına örnek boyutu | ||||
| İzoproterenol ng/dak | İzoproterenol ng/dak | |||||
| 0 | 0.825 | 8.25 | 0 | 0.825 | 8.25 | |
| Kalp atış hızı | ||||||
| 10 | 2.4 | 2.6 | 3.1 | 4 | 4 | 3 |
| 15 | 3.6 | 3.9 | 4.6 | 3 | 3 | 3 |
| 20 | 4.8 | 5.3 | 6.2 | 3 | 3 | 3 |
| 25 | 6.0 | 6.6 | 7.8 | 3 | 3 | 3 |
| 30 | 7.2 | 7.9 | 9.3 | 3 | 3 | 3 |
| Kontur hacmi | ||||||
| 10 | 0.6 | 0.7 | 1.0 | 42 | 30 | 18 |
| 15 | 0.9 | 1.1 | 1.5 | 20 | 15 | 9 |
| 20 | 1.2 | 1.5 | 2.0 | 12 | 9 | 6 |
| 25 | 1.5 | 1.8 | 2.4 | 8 | 6 | 4 |
| 30 | 1.8 | 2.2 | 2.9 | 6 | 5 | 4 |
| İşe alınabilen strok işini önceden yükle | ||||||
| 10 | 0.9 | 0.7 | 0.9 | 21 | 38 | 22 |
| 15 | 1.3 | 1.0 | 1.3 | 10 | 18 | 11 |
| 20 | 1.8 | 1.3 | 1.7 | 7 | 11 | 7 |
| 25 | 2.2 | 1.6 | 2.2 | 5 | 7 | 5 |
| 30 | 2.7 | 2.0 | 2.6 | 4 | 6 | 4 |
| dP/dtmaks. | ||||||
| 10 | 0.4 | 0.6 | 1.1 | 83 | 44 | 14 |
| 15 | 0.7 | 0.9 | 1.7 | 38 | 20 | 7 |
| 20 | 0.9 | 1.2 | 2.3 | 22 | 12 | 5 |
| 25 | 1.1 | 1.5 | 2.8 | 15 | 8 | 4 |
| 30 | 1.3 | 1.8 | 3.4 | 11 | 6 | 3 |
| Tau | ||||||
| 10 | 1.0 | 1.1 | 0.8 | 19 | 14 | 28 |
| 15 | 1.4 | 1.7 | 1.2 | 9 | 7 | 13 |
| 20 | 1.9 | 2.2 | 1.5 | 6 | 5 | 8 |
| 25 | 2.4 | 2.8 | 1.9 | 4 | 4 | 6 |
| 30 | 2.9 | 3.4 | 2.3 | 4 | 3 | 5 |
| dP/dtdk | ||||||
| 10 | 0.5 | 0.7 | 0.6 | 60 | 31 | 47 |
| 15 | 0.8 | 1.1 | 0.9 | 27 | 15 | 22 |
| 20 | 1.0 | 1.4 | 1.2 | 16 | 9 | 13 |
| 25 | 1.3 | 1.8 | 1.5 | 11 | 6 | 9 |
| 30 | 1.6 | 2.2 | 1.8 | 8 | 5 | 7 |
| Son sistolik basınç hacmi ilişkisi | ||||||
| 10 | 0.4 | 0.3 | 0.04 | >100 | >100 | >100 |
| 15 | 0.6 | 0.5 | 0.06 | 48 | 73 | >100 |
| 20 | 0.8 | 0.6 | 0.07 | 28 | 41 | >100 |
| 25 | 1.0 | 0.8 | 0.09 | 19 | 27 | >100 |
| 30 | 1.2 | 1.0 | 0.11 | 13 | 19 | >100 |
| Son diyastolik birim | ||||||
| 10 | 0.9 | 0.8 | 0.9 | 20 | 27 | 20 |
| 15 | 1.4 | 1.2 | 1.4 | 10 | 13 | 10 |
| 20 | 1.8 | 1.6 | 1.8 | 6 | 8 | 6 |
| 25 | 2.3 | 2.0 | 2.3 | 5 | 6 | 5 |
| 30 | 2.8 | 2.4 | 2.8 | 4 | 5 | 4 |
Tablo 3. C57BL6/N erkek farelerde gözlenen değerlere göre seçilen parametreler için tahmini etki boyutu ve gerekli örnek boyutu. Delta, bir kontrol (yani vahşi tip) ve bir tedavi grubu arasındaki parametrede hipotetik bir farkı tasvir eder. Etki boyutu ve grup başına gerekli örnek boyutu, G * Power 19aracılığıyla kontrol verileri (ortalama ve standart sapma), alfa hatası (0,05) ve güç (0,8) kullanılarak hesaplanır. Kalın değerler (tablonun çevrimiçi sürümündeki yeşil arka planlar), her izoproterenol dozunda her parametre için önerilen eşik efekt boyutunu (1≤) ve örnek boyutunu gösterir. dP/dtdk: Minimum dP/dt; dP/dtmaks:Maksimum dP/dt. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, artan β-adrenerjik stimülasyon altında farelerde in vivo kardiyak fonksiyonu analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Prosedür, genetiği değiştirilmiş farelerde veya müdahaleler üzerine hem kardiyak fonksiyonun temel parametrelerini hem de adrenerjik rezervi (örneğin, inotropi ve kronotropi) ele almak için kullanılabilir. Basınç hacmi döngüsü (PVL) ölçümlerinin diğer kardiyak fonksiyon belirleme araçlarına göre en belirgin avantajı içsel, yük bağımsız kardiyak fonksiyonun analizidir. Diğer tüm yöntemler (örneğin, MRG ve ekokardiyografi) sadece kardiyak fonksiyonun yüke bağlı parametrelerini değerlendirebilir ve özellikle kardiyak kontrtilite güvenilir bir şekilde belirlenemez. Bu, PVL ölçümlerini kardiyak fonksiyonun derinlemesine analizinin uç nokta ölçümleri için altın standart haline getirir5. Bununla birlikte, daha önce isimlendirilen yöntemler kardiyak fonksiyonun sıralı analizine izin vererek boyuna gözlemler için ön plana çıkarır (örneğin, hastalığın ilerlemesi sırasında). Ayrıca, intraventriküler hacimler ve daha sonra inme hacmi ve diğer türetilmiş parametreler, farelerde MRI ile karşılaştırıldığında PVL ölçümlerinde hafife alınabilir20.
Protokol sırasında geçerli PVL verileri elde etmek için çok önemli olan dört kritik adım vardır: 1) Entübasyon, 2) femoral ven kateterinin yerleştirilmesi, 3) basınç iletim kateterinin yerleştirilmesi ve 4) periprokedural rejim. Farelerin invaziv olmayan entübasyonu biraz deneyim gerektirir ve entübasyon için zaman aralığı dar olduğu için izofluran kullanırken karmaşıktır (20 - 40 s). Bu nedenle entübasyon sonrası ventilatörlerin solunum hızı değiştirilirken murine göğüs hareketleri incelenerek doğru tüp yerleşimi dikkatle kontrol edilmelidir. Entübasyon penceresini genişletmek için, burada kısa etkili hipnotik etomidatın birlikte kullanımını tanımladık. Ayrıca, glottis görselleştirme kolaylaştırmak için hafif lifler mevcuttur16. Femoral ven kateterinin uygun şekilde yerleştirilmesi, daha sonraki aşamalarda izoproterenol uygulanması için gereklidir. Bu adım sırasında, hava embolisi pulmoner emboli indükleyen hayvanlara ciddi şekilde zarar verebilir. Femoral kateterin doğru yerleştirilmesi başlangıçta venöz kanın dikkatli bir aspirasyonu ile kontrol edilebilir. Daha sonraki aşamalarda uygun kateter yerleşimi belirsiz olduğunda, PVL'yi çevrimiçi olarak görselleştirirken en ufak boluslara yanıt olarak artması gereken son diyastolik hacim incelenebilir. Diğer araştırmacıların aksine, burada femoral damarın kavunmasını tanımlarken, diğerleri en sık şahdamarını merkezi venöz erişim için hedef damar olarak kullandı12,21. Bu yaklaşım, şahdayı hazırlandığında yakın göğüs yaklaşımında olduğu gibi vagal sinire yakın manipüle etmeme avantajına sahiptir ve bu nedenle sinire dokunarak / zarar vermek suretiyle parasempatik sistemin potansiyel uyarılmasından kaçınıldığını varsayarız. PV kateterin ventrikül içine uygun şekilde yerleştirilmesi, özellikle hacim parametreleriyle ilgili anlamlı veriler elde etmek için çok önemlidir. Elektrotlar tamamen ventrikül içinde olmadığında veya kateter ventrikülün boyuna ekseni boyunca düzgün bir şekilde yerlendirilmediğinde, hacim parametreleri oldukça hafife alınmaktadır. Ayrıca, endokardyum ve basınç dönüştürücü arasındaki temas, taban çizgisi ölçümleri sırasında tolere edilmemesi gereken uç sistolik basınç artışlarına neden olur6. Son olarak, anestezi derinliği ve sıvı yönetimi de dahil olmak üzere periprokedral rejimin farelerde PVL verilerinin güvenilirliği üzerinde önemli bir etkisi vardır. Anestezik az veya aşırı doz hemodynamik parametreleri ciddi şekilde etkileyebilir, hem de çoğu zaman kardiyak fonksiyonun azalmasına neden olabilir. Daha çok kan kaybı ve buharlaşmaya bağlı olan sıvı kaybı, önerdiğimiz %0,9 NaCl'de çözünen %12,5 albümin gibi uygun çözeltilerin sürekli infüzyonu ile karşılanmalıdır. Yaklaşımın çok invaziv olması nedeniyle, daha az önemli olmayan, yetersiz ağrıdan kaçınmanın uyandırdığı kardiyovasküler fonksiyonlar üzerindeki etkileri en aza indirmek için Buprenorfin gibi güçlü bir analjezik içermesidir. Analjezik ilacı entübasyondan önce enjekte ediyoruz. Enjeksiyonun tüm prosedüre başlamadan ~ 30 dakika önce, özellikle operatör deneyimliyse ve böylece hızlı bir şekilde, inceleme aşamasında herhangi bir ağrıdan kaçınarak uygun bir analjezik etkiye ulaşmak için yapılması önemlidir. Ek olarak, obez modellerle çalışırken, bu maddenin yüksek lipofililiği nedeniyle muhtemelen daha yüksek dozlar düşünülmelidir. Son olarak, bu protokol dobutamin veya epinefrin gibi diğer katekolaminerjik uyaranlara yanıtın belirlenmesinde de değiştirilebilir; Örneğin Calligaris ve meslektaşları tarafından yapıldığı gibi22 kim dobutamin stimülasyonu sırasında intraventriküler basınç analizi tarif etti.
PVL ölçümlerinin kaydedilmesi ve analizi ile ilgili olarak dikkate alınması gereken birkaç adım vardır. İlk olarak, deneysel bir veri kümesi boyunca PVL kayıtlarını tutarlı bir şekilde analiz etmek çok önemlidir. Mekanik ventilasyon sırasında alternatif kardiyak pre yük ile sonuçlanan alternatif pulmoner basınç nedeniyle gelişen solunum yapıtlarının, kayıtlar sırasında ventilatörü kapatarak önlenilmesi gerekir. Solunum yapıtlarını daha da ortadan kaldırmak için, izofluran anestezisi sırasında sıklıkla görülen diyafram kasılmalarını önlemek için kas gevşetici panküronyum kullanmanızı öneririz. Ek olarak, 8-10 döngü seçmeyi öneren ve daha sonra analiz edilen 5-6 uç ekspirasyon döngülerini tanımlayan diğer protokollerin aksine, havalandırmanın son anda durdurulması ve seçilen döngülerin tümünü analiz etmek mümkün kılar23. Daha da önemlisi, hiperkapni ve solunum asidozu ile sonuçlanan hipovingi önlemek için apne dönemleri kısa tutulmalıdır. Oksijenlenmeyi iyileştirmek ve atelektaz oluşumunu önlemek için, daha önce farelerde PVL ölçümleri sırasında PEEP-havalandırma kullanımını inceledik6. Ön yükleme bağımsız verilerin analizi için döngüleri seçerken, azalan son diyastolik hacmi gösteren ilk 5-6 döngüyü seçin ve yalnızca basıncın azaldığı, ancak birimin sabit olduğu döngüleri dahil etmekten kaçının. Ayrıca, PVL parametrelerini önemli ölçüde etkiledikleri için ekstra atımlar analize dahil edilmelidir. Dikkat çekici bir şekilde, çoğu zaman aritmik atımlar tıkanıklık dikişi ve murine kalbi arasındaki temas nedeniyle meydana gelir. Hipertonik salinin infüzyonu yoluyla paralel iletim için kalibrasyon, kardiyak fonksiyon parametreleri üzerinde muazzam bir etkiye sahiptir ve anlayışımıza göre, bir deneyin sonunda yapılmalıdır6. Özellikle, kardiyak fonksiyon üzerindeki etkisi nedeniyle, paralel iletkenlik için kalibrasyon protokol sırasında sadece bir kez gerçekleştirilir. Bununla birlikte, paralel iletim protokol sırasında biraz değişir, adrenerjik stimülasyon üzerine ventriküller şeklindeki değişiklikler nedeniyle. Farelerde PVL değerlendirmeleri için salin kalibrasyonlarına ihtiyaç duymayan ve paralel iletkenliği PVL kayıtları boyunca dinamik olarak hesaplayabilen kabul sistemleri mevcuttur. Ancak, bu yöntemin doğruluğu hala tartışılıyor5,8,24,25.
Gözlemlerimizden, bu protokolü yetişkin sağlıklı vahşi tip erkek farelerde (yani C57Bl6/N) kullanırken sistolik basıncın taban çizgisiyle 70 mmHg ila 90 mmHg aralığında ve β-adrenoreceptor agonist izoproterenol ile maksimum stimülasyon sırasında 80 ila 100 mmHg arasında olduğunu belirledik. Aynı şekilde, inme hacminin taban çizgisi 13 μL ila 20 μL aralığında ve maksimum stimülasyon sırasında 20 μL ile 35 μL arasında olduğu gözlenmiştir. Kalp atış hızı taban çizgide dakikada yaklaşık 450 ila 520 atımdı ve maksimum stimülasyon sırasında dakikada 650 atım aşabilir. Ön yükten bağımsız kardiyak kontrtinaklık ile ilgili olarak, en sağlam parametre ön yük işe alınabilen inme çalışması (PRSW), taban çizgisiyle 60 mmHg ila 80 mmHg arasında ve maksimum stimülasyon sırasında 100 mmHg ile 140 mmHg arasında yeterli olarak kabul edildi. Temel parametreler genellikle elde edilenlerden önemli ölçüde ayrılırsa veya kardiyak fonksiyon β-adrenerjik stimülasyona uygunsuz bir şekilde tepki verdiğinde, komplikasyonlar (örneğin, göz ardı edilmemiş kan kaybı, vücut ısısında düşme / artış veya anestezik aşırı / alt doz) dikkate alınmalıdır.
Ayrıca, farelerde PVL ölçümleri sırasında bazı eserler ortaya çıkabilir. En yaygın yapıt, kateter tuzaklarından kaynaklanan son sistolik basınç yükselmesidir (ESPS, Şekil 2C), ve 0 ng/dk izoproterenol bazal ölçümlerden önce kateterin yeniden konumlandırılmasıyla kolayca düzeltilebilir. ESPS, kardiyak fonksiyon6'nınçeşitli parametrelerini etkileyebileceğinden, anlamlı veriler elde etmek için ESPS'ler temel koşullarda yok olmadan önce ölçümler başlamamalıdır. Bununla birlikte, bir ESPS, taban çizgisi etkilenmeyen ölçümlerde değiştirilmiş ventrikül morfolojisi nedeniyle izoproterenol ile artımlı stimülasyon sırasında meydana geldiğinde, kateter yeniden konumlandırması doz yanıt protokolü sırasında paralel iletkenliği değiştireceğinden, bu düzeltilemez. Bunu yakından incelemek gerekir, çünkü aynı şekilde tabandakiler, bu ESPS'lerin sadece önemli ölçüde artan maksimum basınç13,26, iledeğil,aynı zamanda azaltılmış hacim algılama6ile kardiyak fonksiyon parametrelerini önemli ölçüde değiştirdiği gösterilmiştir.
PVL ölçümleri ile temel koşullar altında ve farelerde izoproterenol ile artımlı stimülasyon sırasında elde edilen hemodinamik parametreler için temsili değerler, farklı metodolojik yaklaşımlarla ve farklı fare suşlarında büyük ölçüde değişir27,28. Bunun ötesinde, genetik olarak değiştirilmiş farelerin fenotiplerinin de farklı genetik geçmişlerle sınırlı olabileceğinin farkında olmak gerekir. Metodolojik olarak, farelerde basınç hacmi analizi yapmanın iki önemli yaklaşımı vardır. Her yöntemin (dis) avantajları vardır ve seçim yöntemi genellikle laboratuvarın ve araştırmacılarının deneyimlerine bağlıdır. Burada kateterin tepedeki bir delinme yoluyla yer aldığı açık göğüs prosedürüne odaklanıyoruz. Bu yaklaşım, farelerde anlamlı kardiyak fonksiyon verilerinin kaydedillenmesi için önemli bir tahmin edici olan hassas kateter konumlandırmasına izin veren görme altında kateter yerleşiminin ilerlemesine sahiptir. Bu özellikle mikrolitre aralığında hacim parametrelerinin kaydedilmesinde geçerlidir. Buna karşılık, bu yaklaşımın kritik bir yönü fizyolojik torasik basınç kaybıdır, bu da akciğerlerin çökmesine ve atelektaz oluşumuna ve vücut sıvısının daha yüksek kaybına neden olur. Bununla birlikte, pozitif uç ekspiratuar basınç (PEEP) havalandırması kullanarak, burada farelerde açık göğüs PVL sırasında akciğer hasarını önlediği kanıtlanmış bir strateji açıklıyoruz6. İkinci deneysel yaklaşım, kateteri şahdamarı üzerinden ve daha sonra aort kapağından geriye doğru yapıştırmaktır. Bu tekniği kullanarak, torasik basınçlar oldukça normal tutulabilir, ancak mekanik havalandırma hala gereklidir, bu da bu avantajı zayıflatır. Ayrıca, kapalı göğüs yaklaşımı, araştırmacıların hassas kateter konumlandırma olanaklarını sınırlar. Ayrıca, farelerde kullanılan PV kateterlerin çapları 1 ila 1,4 Fransızca (0,33 mm ila 0,47 mm) arasındadır, bu da yetişkin farelerin aortaları tipik olarak 0,8 mm ila 1,2 mm29,30arasında çaplara sahip olduğu için kapalı göğüs yaklaşımını kullanırken murin çıkış yolunun önemli bir tıkanıklığı anlamına gelir. Kalp yetmezliği modellerinde PVL kullanımı ile ilgili olarak, açık göğüs yaklaşımı, daralmanın innominat arter ve sol şahdamar arasında bulunduğu enine aort daralma modelleri için özel bir öneme sahiptir. Burada kateter şahdamarı ile yerleştirilemez. Öte yandan, kapalı göğüs yaklaşımı, apeksin delinmesinin mümkün olmadığı miyokard enfarktüsünün indüksiyonu gibi genişlemiş ventriküllerin murin modellerini araştıran araştırmacılar için ilgi çekicidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan edilmesine gerek yok.
Acknowledgments
Manuela Ritzal, Hans-Peter Gensheimer, Christin Richter ve Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung (IBF) ekibine uzman teknik yardım için minnettarız.
Bu çalışma DZHK (Alman Kardiyovasküler Araştırmalar Merkezi), BMBF (Alman Eğitim ve Araştırma Bakanlığı), bir Baden-Württemberg federal eyaleti Innovation fonds ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) Project-ID 239283807 - TRR 152, FOR 2289 ve İşbirlikçi Araştırma Merkezi (SFB) 1118 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.4F SPR-839 catheter | Millar Instruments, USA | 840-8111 | |
| 1 ml syringes | Beckton Dickinson, USA | REF303172 | |
| Bio Amplifier | ADInstruments, USA | FE231 | |
| Bridge-Amplifier | ADInstruments, USA | FE221 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth, Germany | 8076.2 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Bayer, Germany | 4007221026402 | |
| Calibration cuvette | Millar, USA | 910-1049 | |
| Differential pressure transducer MPX | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 39912 | |
| Dumont Forceps #5/45 | Fine Science tools Inc. | 11251-35 | |
| Dumont Forceps #7B | Fine Science tools Inc. | 11270-20 | |
| Graefe Forceps | Fine Science tools Inc. | 11051-10 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Ver. 8.3.0 | |
| EcoLab-PE-Micotube | Smiths, USA | 004/310/168-1 | |
| Etomidate Lipuro | Braun, Germany | 2064006 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Heparin | Ratiopharm, Germany | R26881 | |
| Hot plate and control unit | Labotec, Germany | Hot Plate 062 | |
| Isofluran | Baxter, Germany | HDG9623 | |
| Isofluran Vaporizer | Abbot | Vapor 19.3 | |
| Isoprenalinhydrochloride | Sigma-Aldrich, USA | I5627 | |
| Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID | Smiths Medical International Ltd, UK | Ref. 800/100/100 | |
| MiniVent ventilator for mice | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 845 | |
| MPVS Ultra PVL System | Millar Instruments, USA | ||
| NaCl | AppliChem, Germany | A3597 | |
| NaCl 0.9% isotonic | Braun, Germany | 2350748 | |
| Pancuronium-bromide | Sigma-Aldrich, USA | BCBQ8230V | |
| Perfusor 11 Plus | Harvard Apparatus | Nr. 70-2209 | |
| Powerlab 4/35 control unit | ADInstruments, USA | PL3504 | |
| Rechargeable cautery-Set | Faromed, Germany | 09-605 | |
| Scissors | Fine Science tools Inc. | 140094-11 | |
| Software LabChart 7 Pro | ADInstruments, USA | LabChart 7.3 Pro | |
| Standard mouse food | LASvendi GmbH, Germany | Rod18 | |
| Stereo microscope | Zeiss, Germany | Stemi 508 | |
| Surgical suture 8/0 | Suprama, Germany | Ch.B.03120X | |
| Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge | Beckton Dickinson, USA | 393224 | |
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science tools Inc. | 00574-11 | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| Syringe filter (Filtropur S 0.45) | Sarstedt, Germany | Ref. 83.1826 |
References
- Bacmeister, L., et al. Inflammation and fibrosis in murine models of heart failure. Basic Research in Cardiology. 114 (3), 19 (2019).
- Hartupee, J., Mann, D. L. Neurohormonal activation in heart failure with reduced ejection fraction. Nature Reviews Cardiology. 14 (1), 30-38 (2017).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovascular Research. 39 (1), 60-76 (1998).
- Lefkowitz, R. J., Rockman, H. A., Koch, W. J. Catecholamines, cardiac beta-adrenergic receptors, and heart failure. Circulation. 101 (14), 1634-1637 (2000).
- Cingolani, O. H. K. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 2198-2206 (2011).
- Bacmeister, L., et al. Assessment of PEEP-Ventilation and the Time Point of Parallel-Conductance Determination for Pressure-Volume Analysis Under beta-Adrenergic Stimulation in Mice. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 36 (2019).
- Segin, S., et al. Cardiomyocyte-Specific Deletion of Orai1 Reveals Its Protective Role in Angiotensin-II-Induced Pathological Cardiac Remodeling. Cells. 9 (5), (2020).
- Clark, J. E., Marber, M. S. Advancements in pressure-volume catheter technology - stress remodelling after infarction. Experimental Physiology. 98 (3), 614-621 (2013).
- Glower, D. D., et al. Linearity of the Frank-Starling relationship in the intact heart: the concept of preload recruitable stroke work. Circulation. 71 (5), 994-1009 (1985).
- Winter, E. M., et al. Left ventricular function in the post-infarct failing mouse heart by magnetic resonance imaging and conductance catheter: a comparative analysis. Acta Physiologica. 194 (2), 111-122 (2008).
- Krenz, M. Conductance, admittance, and hypertonic saline: should we take ventricular volume measurements with a grain of salt. Journal of Applied Physiology. 107 (6), 1683-1684 (2009).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nature Protocols. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Wei, A. E., Maslov, M. Y., Pezone, M. J., Edelman, E. R., Lovich, M. A. Use of pressure-volume conductance catheters in real-time cardiovascular experimentation. Heart, Lung and Circulation. 23 (11), 1059-1069 (2014).
- van Hout, G. P., et al. Admittance-based Pressure-Volume Loops versus gold standard cardiac magnetic resonance imaging in a porcine model of myocardial infarction. Physiological Reports. 2 (4), 00287 (2014).
- Wei, C. L., Shih, M. H. Calibration Capacity of the Conductance-to-Volume Conversion Equations for the Mouse Conductance Catheter Measurement System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 56 (6), 1627-1634 (2009).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
- Weiss, J. L., Frederiksen, J. W., Weisfeldt, M. L. Hemodynamic determinants of the time-course of fall in canine left ventricular pressure. Journal of Clinical Investigation. 58 (3), 751-760 (1976).
- Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavioral Research Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
- Jacoby, C., et al. Direct comparison of magnetic resonance imaging and conductance microcatheter in the evaluation of left ventricular function in mice. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 87-95 (2006).
- Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Estimation of parallel conductance by dual-frequency conductance catheter in mice. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 443-450 (2000).
- Calligaris, S. D., Ricca, M., Conget, P. Cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50050 (2013).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e52942 (2015).
- Pearce, J. A., Porterfield, J. E., Larson, E. R., Valvano, J. W., Feldman, M. D. Accuracy considerations in catheter based estimation of left ventricular volume. Conference proceedings - IEEE engineering in medicine and biology society. 2010, 3556-3558 (2010).
- Nielsen, J. M., et al. Left ventricular volume measurement in mice by conductance catheter: evaluation and optimization of calibration. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (1), 534-540 (2007).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (111), e53810 (2016).
- Barnabei, M. S., Palpant, N. J., Metzger, J. M. Influence of genetic background on ex vivo and in vivo cardiac function in several commonly used inbred mouse strains. Physiological Genomics. 42 (2), 103-113 (2010).
- Oosterlinck, W., Vanderper, A., Flameng, W., Herijgers, P. Glucose tolerance and left ventricular pressure-volume relationships in frequently used mouse strains. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 281312 (2011).
- Guo, X., Kono, Y., Mattrey, R., Kassab, G. S. Morphometry and strain distribution of the C57BL/6 mouse aorta. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (5), 1829-1837 (2002).
- Weiss, R. M., Ohashi, M., Miller, J. D., Young, S. G., Heistad, D. D. Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice. Circulation. 114 (19), 2065-2069 (2006).
