Summary
Slaaptekort is een krachtig hulpmiddel om de slaapfunctie en -regulatie te onderzoeken. We beschrijven een protocol om Drosophila te ontnemen met behulp van het Slaapvernietigend Apparaat en om de mate van rebound slaap veroorzaakt door deprivatie te bepalen.
Abstract
Slaaphomeostase, de toename van slaap waargenomen na slaapverlies, is een van de bepalende criteria die worden gebruikt om slaap in het hele dierenrijk te identificeren. Als gevolg hiervan zijn slaapgebrek en slaapbeperking krachtige hulpmiddelen die vaak worden gebruikt om inzicht te geven in de slaapfunctie. Niettemin zijn slaapgebreksexperimenten inherent problematisch omdat de deprivatieprikkel zelf de oorzaak kan zijn van waargenomen veranderingen in fysiologie en gedrag. Dienovereenkomstig moeten succesvolle slaapgebrekstechnieken dieren wakker houden en idealiter resulteren in een robuuste slaaprebound zonder ook een groot aantal onbedoelde gevolgen te veroorzaken. Hier beschrijven we een slaaptekorttechniek voor Drosophila melanogaster. Het Sleep Nullifying Apparatus (SNAP) dient elke 10s een stimulus toe om negatieve geotaxis te induceren. Hoewel de stimulus voorspelbaar is, voorkomt de SNAP effectief >95% van de nachtrust, zelfs bij vliegen met een hoge slaapdrift. Belangrijk is dat de daaropvolgende homeostatische respons sterk lijkt op die bereikt met behulp van handdeprivatie. De timing en afstand van de stimuli kan worden aangepast om slaapverlies te minimaliseren en zo niet-specifieke effecten van de stimulus op fysiologie en gedrag te onderzoeken. De SNAP kan ook worden gebruikt voor slaapbeperking en om opwindingsdrempels te beoordelen. De SNAP is een krachtige slaapverstoringstechniek die kan worden gebruikt om de slaapfunctie beter te begrijpen.
Introduction
Slaap is bijna universeel bij dieren, maar de functie ervan blijft onduidelijk. Slaaphomeostase, de compenserende toename van slaap na slaapgebrek, is een bepalende eigenschap van slaap, die is gebruikt om slaaptoestanden te karakteriseren bij een aantal dieren1,2,3,4,5.
Slaap in de vlieg heeft veel overeenkomsten met de menselijke slaap, waaronder een robuuste homeostatische reactie op slaapverlies4,5. Talrijke studies van slaap in de vlieg hebben slaapgebrek gebruikt, zowel om de slaapfunctie af te leiden door de nadelige gevolgen van langdurig ontwaken te onderzoeken, als om slaapregulatie te begrijpen door de neurobiologische mechanismen te bepalen die de homeostatische regulatie van slaap regelen. Zo werd aangetoond dat slaaparme vliegen beperkingen vertonen in leren en geheugen6,7,8,9,10,11,12,structurele plasticiteit13,14,15,visuele aandacht16,herstel van neuronaal letsel17,18,paring en agressief gedrag19, 20,celproliferatie 21, en reacties op oxidatieve stress22,23 om er maar een paar te noemen. Verder hebben onderzoeken naar de neurobiologische mechanismen die de reboundslaap regelen kritische inzichten opgeleverd in de neuronale machinerie die de slaaphomeostat8,9,23,24,25,26,27,28,29 vormt . Ten slotte hebben slaapgebreksstudies, naast het onthullen van fundamentele inzichten in de slaapfunctie bij gezonde dieren, ook inzichten verkregen in de slaapfunctie in zieke toestanden30,31.
Hoewel slaapgebrek ontegenzeggelijk een krachtig hulpmiddel is, is het bij elk slaapgebreksexperiment belangrijk om fenotypen te onderscheiden die het gevolg zijn van langdurig wakker worden, van fenotypen die worden veroorzaakt door de stimulus die wordt gebruikt om het dier wakker te houden. Slaaptekort door handgebrek of zachte behandeling, wordt over het algemeen beschouwd als het bepalen van de norm voor minimaal verstorend slaapgebrek. Hier beschrijven we een protocol voor slaaprovende vliegen met behulp van het Sleep Nullifying Apparatus (SNAP). De SNAP is een apparaat dat elke 10s een mechanische stimulus aan vliegen levert, waardoor vliegen wakker blijven door negatieve geotaxis te induceren(figuur 1). De SNAP berooft vliegen efficiënt van >98% van de nachtrust, zelfs bij vliegen met een hoge slaapaandrijving8,32. De SNAP is gekalibreerd op banggevoelige vliegen, agitatie van vliegen in de SNAP is niet schadelijk voor vliegen; slaapgebrek met de SNAP induceert een rebound vergelijkbaar met die verkregen door handdeprivatie7. De SNAP is dus een robuuste methode om vliegen te slapen en tegelijkertijd de effecten van de prikkelende stimulus te beheersen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Experimentele voorbereiding
- Verzamel vliegen terwijl ze in flesjes eclose komen en mannelijke en vrouwelijke vliegen scheiden.
OPMERKING: Slaapexperimenten worden vaak uitgevoerd met vrouwelijke vliegen. Het is belangrijk om maagdelijke vrouwtjes te verzamelen. Gepaarde vrouwtjes leggen eieren die uitkomen in larven die de analyse van de gegevens bemoeilijken. - Huisvliegen van een enkel geslacht in groepen van <20.
OPMERKING: Huisvestingsvliegen in een sociaal verrijkte omgeving (groepen van >50) moduleert slaapaandrijving6,13 potentieel verstorende metingen van rebound-slaap. Verder zal na sociale verrijking de slaap gedurende een paar dagen afnemen6. De basisslaap is dus niet stabiel, wat de analyse van de reboundslaap bemoeilijkt. Het houden van vliegen in groepen van <20 voorkomt deze potentiële verwarring. - Bewaar vliegen in injectieflacons gedurende 3-5 dagen in een licht- en vochtigheidsgecontroleerde omgeving.
OPMERKING: Leeftijd en volwassenheid van vliegen hebben een sterke invloed op de slaap. Slaap is hoog in een dag oude vliegen en stabiliseert op 3-5 dagen oud4. Vliegen worden meestal gehandhaafd op een licht van 12 uur: 12 uur donker schema bij 50% luchtvochtigheid.
2. Voorbereiding van buizen voor slaapregistratie
OPMERKING: De slaap wordt bewaakt met behulp van bewegingsmonitoren. Een monitor kan 32 vliegen afzonderlijk in buizen met een diameter van 5 mm bevatten. Meestal worden genotypen geanalyseerd in groepen van 16 of 32 vliegen.
- Bereid een passend aantal buizen voor met vliegenvoer aan één uiteinde.
OPMERKING: Van dieet en metabolisme is bekend dat ze de slaapbeïnvloeden 33,34, daarom is het bijzonder belangrijk om vliegen op hetzelfde voedsel te plaatsen waarop ze zijn grootgebracht. - Sluit het uiteinde van de buizen af met was.
OPMERKING: Slaapgebrek en rebound is een vijfdaags experiment en voedsel kan uitdrogen als het niet goed is afgesloten. In goed afgesloten buizen kan voedsel 10 dagen of langer worden bewaard. Het is dus van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de uiteinden van de buizen goed worden afgedicht. Vliegen kunnen echter ook vast komen te zitten aan natvoer. Het helpt dus om buizen 1-2 dagen voor het begin van het experiment te maken. - Plaats individueel wake, gedragende vliegen in 65 mm lange glazen buizen voor slaapregistratie met behulp van een aspirator en sluit het uiteinde van de buizen aan met een schuimstop.
OPMERKING: Vliegen worden nooit opnieuw blootgesteld aan CO 2-anesthesie bij het plaatsen van vliegen in buizen voor slaapregistratie. De aspirator is gemaakt van rubberen buizen met één uiteinde bedekt met kaasdoek en ingebracht in een pipetpunt van 1 ml.
3. Slaap opnemen
- Load vliegt in buizen in activiteitsmonitoren om de slaap te controleren.
OPMERKING: De SNAP-rotsen monitoren heen en weer van -60 ° tot +60 ° elke ~ 10 s. De monitoren worden op -60° gehouden voor ~5.9s; het duurt ~2,9 s voordat de lade met de monitoren van -60° naar +60° beweegt en ~1 s terug van +60° naar -60°. De cycluslengte kan naar behoefte worden gewijzigd door de spanning die aan de motor wordt geleverd aan te passen.- Zorg ervoor dat buizen in de juiste richting in activiteitsmonitoren worden geplaatst. In de juiste richting bevindt het uiteinde van de buis met voedsel zich aan de bovenkant van de SNAP om ervoor te zorgen dat vliegen niet in het voedsel worden geduwd. Bovendien bevindt het uiteinde met voedsel zich aan de zijkant van de monitor met de slaapopname-aansluiting. Hierdoor kunnen activiteitsmonitoren correct worden georiënteerd in de SNAP voor efficiënt slaapgebrek en tegelijkertijd de activiteit bewaken.
- Plaats activiteitsmonitoren in de opnamekamer om de slaap te controleren.
- Controleer de slaap gedurende ten minste twee volledige dagen om de basisslaap te schatten.
OPMERKING: De dagvliegen die in activiteitenmonitoren worden geladen, wordt meestal uitgesloten als een aanpassingsdag om vliegen in staat te stellen zich aan te passen aan het feit dat ze in buizen worden gehuisvest. Baseline slaap wordt geregistreerd gedurende ten minste twee volledige dagen (48 uur), te beginnen met de ochtend na de dag vliegen worden geladen. - Sla locomotorische activiteittellingen van vliegen op in bakken van 1 minuut vanaf het moment van verlichting op een bepaalde dag tot lichten op de vorige dag met behulp van activiteitsregistratiesoftware (bijvoorbeeld van 8 uur 's ochtends tot 8 uur 's ochtends).
- Schat de slaap op de locomotorische activiteitsgegevens met aangepaste macro's met behulp van 5 minuten inactiviteit als drempel voor een slaapbui35.
OPMERKING: Een aantal slaapstatistieken worden berekend op basis van de locomotorische activiteitstellingen. Deze omvatten slaap in min / h meer dan 24 uur, totale slaaptijd in 24 uur, gemiddelde en maximale dag- en nacht slaaplengtes36.
4. Slaaptekort en herstel
- Aangezien vliegen slaapgebrek kunnen hebben voor variabele tijdsduur (bijv. 12 h, 24 h en 36 h) en herstelslaap ook met verschillende intervallen kan worden geëvalueerd (bijv. 6 h, 12 h, 24 h en 48 h), bepaal de duur van herstel door experimentele behoefte. Slaapherstel kan worden gevisualiseerd met behulp van een slaapwinst / verlies-plot of door het percentage slaap hersteld te onderzoeken gedurende een vooraf bepaald interval (bijv. 6 uur).
- Als de slaap stabiel is gedurende de twee basislijndagen, plaatst u op de derde dag activiteitsmonitoren in de SNAP voor slaapgebrek 's nachts.
OPMERKING: Vliegen vertonen een robuuste slaaprebound over een reeks slaaptijden8,32,37,38,maar de slaap moet stabiel zijn om de rebound-slaap betrouwbaar te evalueren. De slaap is stabiel wanneer het verschil in slaap tussen de basislijndagen ± 100 minuten is. - Zorg ervoor dat activiteitenmonitoren op hun plaats zijn bevestigd met monitorhouderpennen, monitorkabels aangesloten en monitoren correct zijn georiënteerd met het uiteinde met voedsel aan de achterkant en plastic barrières aan de voorkant(figuur 1).
OPMERKING: De SNAP is zo ontworpen dat de nok eenmaal per 10 s draait(figuur 1). Het plastic inzetstuk reset de buizen door de buizen terug te duwen wanneer het apparaat zich in de "up" -positie bevindt. Het resetten van de buizen is belangrijk om ervoor te zorgen dat alle buizen aan het begin van elke cyclus het volledige bewegingsbereik hebben. - Koppel activiteitsmonitoren los en haal monitoren uit de SNAP onmiddellijk wanneer het licht brandt na slaapgebrek 's nachts.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat slaapgebrek wordt beëindigd en dat vliegen onmiddellijk in herstel worden geplaatst wanneer de lichten aan gaan na 12 uur slaapgebrek .... Zelfs een vertraging van 20-30 minuten bij het plaatsen van vliegen in herstel kan de mate van rebound-slaap verstoren. - Plaats vliegen in een opnamekamer waar ze twee dagen (48 uur) ongestoord zijn om de herstelslaap te controleren.
OPMERKING: Als de opnamekamer voor andere experimenten wordt gebruikt, moet extra voorzichtig worden vermeden dat herstellende vliegen worden gestimuleerd. - Bereken de hoeveelheid verloren slaap. Bereken voor elke individuele vlieg het uurverschil tussen slaap verkregen tijdens slaapgebrek en het overeenkomstige uur tijdens baseline; tel de verschillen per uur op om het totale slaapverlies te berekenen.
- Bereken de hoeveelheid herstelde slaap. Bereken voor elke individuele vlieg het uurverschil tussen de slaap die tijdens het herstel wordt verkregen en het overeenkomstige uur tijdens de basislijn; tel de uurverschillen op om de totale gewonnen slaap te berekenen.
OPMERKING: Of een vlieg daadwerkelijk slaapgebrek heeft, is empirisch. De experimentator moet dus het percentage verloren slaap onderzoeken. Als de vlieg niet voldoende slaap heeft verloren, kan deze worden uitgesloten van de analyse. Hoewel dit nodig kan zijn voor andere slaapgebreksbenaderingen, is het zelden of nooit vereist voor de SNAP. Vaker is de slaap mogelijk niet stabiel in een bepaalde vlieg voorafgaand aan het begin van slaapgebrek. Als de slaap niet stabiel is, kan homeostase niet worden berekend. We accepteren een maximaal verschil van ± 100 minuten slaap berekend voorafgaand aan de start van slaapgebrek als kandidaten voor opname. Soms wordt de slaap van een individuele vlieg ongelijk verdeeld over de 24-uursdag (sommige personen kunnen bijvoorbeeld overdag 60-70% van hun slaapquotum verkrijgen en verliezen dus slechts een klein deel van hun 24-uurs slaapquotum wanneer ze 's nachts 12 uur worden beroofd). Deze vliegen kunnen afzonderlijk worden geëvalueerd. - Bereken het gemiddelde percentage herstelde slaap (ten opzichte van baseline) gedurende 12 uur, 24 uur en 48 uur van de herstelperiode voor elk genotype.
- Bereken op basis van slaapgegevens de gemiddelde en maximale lengte van de slaappartij overdag op baseline en hersteldagen voor elk genotype.
OPMERKING: Rebound slaap in vliegen wordt gekenmerkt door verhoogde slaaphoeveelheid en verhoogde slaapdiepte in de hersteldagen. Slaapconsolidatie wordt gebruikt als maat voor slaapdiepte. Opwindingsdrempels kunnen ook worden gebruikt als een maat voor de slaapdiepte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Canton S (Cs) werd gebruikt als een wild-type stam. Vliegen werden gehouden op een 12 uur licht: 12 uur donker schema, en slaap beroofd voor 12 uur 's nachts. Inspectie van de slaapprofielen van Cs-vliegen op de baselinedag (bs), slaapgebreksdag (sd) en twee hersteldagen (rec1 en rec2) (Figuur 2A) suggereert dat vliegen effectief slaapgebrek hadden in de SNAP en overdag herstelden in overeenstemming met waargenomen rapporten in de literatuur4,5. De effectiviteit van de SNAP bij het wakker houden van vliegen wordt ook gezien in de hoge activiteit (300-350 tellen / h) die vliegen vertonen tijdens slaapgebrek(figuur 2B). Inderdaad, het monitoren van de activiteitstellingen van vliegen tijdens slaapgebrek kan een nuttige barometer zijn van de effectiviteit van het deprivatieprotocol en / of een indirecte meting van slaapdrift. Wanneer het slaaptekort niet effectief is, zijn vliegen niet zo actief tijdens de periode van ontbering. Vliegen die in de hoge slaap zijn, vallen na elke stimulus snel in slaap en doorkruisen de buis niet zoveel35. Zowel de hoek van kantelen van het apparaat als de snelheid van de druppel zijn van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat vliegen effectief wakker worden gehouden zonder ze te schaden. Elk lab kan de hoek en snelheid optimaliseren door de veer(figuur 1B)en/of de grootte en vorm van de nok aan te passen(figuur 1C en figuur 1D,rechts).
Om de effectiviteit van slaapgebrek en van herstel kwantitatief te schatten, werd slaap verloren tijdens deprivatie en vervolgens herwonnen in de hersteldagen berekend voor elke individuele vlieg (Figuur 2C). Belangrijk is dat er geen significante verandering was in de basisslaap tussen de deprivatiedag en de basislijndag (zie 0-12 h in figuur 2C),wat aangeeft dat de slaap stabiel is bij deze vliegen. Een groot verschil in slaap in deze periode van 12 uur (bijvoorbeeld ± 100 min) zou suggereren dat de slaap niet stabiel was. De SNAP beroofde vliegen effectief van >98% van hun nachtrust. Vliegen herstelden ~ 20% van hun slaap in de eerste 12 uur en herstelden 's nachts geen extra slaap, zoals eerder gemeld. Vliegen begonnen echter de volgende dag de slaap te herstellen, zodat ze ~ 36% van hun slaap herstelden gedurende 48 uur herstel(figuur 2D). 30 - 40% herstelde slaap gedurende 48 uur is vrij typisch voor wild-type vliegen slaapgebrek met behulp van de SNAP.
Slaaphomeostase wordt zowel gekenmerkt door een verhoogde slaapduur als door een verhoogde slaapdiepte tijdens de herstelperiode na deprivatie. Slaapconsolidatie overdag wordt vaak gebruikt als een uitlezing van de slaapdiepte. Slaapconsolidatie kan worden beoordeeld als de gemiddelde duur van de slaapperiode over de hele dag(figuur 2E). Naarmate de slaapdruk tijdens het herstel verdwijnt, zal de gemiddelde duur van de slaapperiode echter worden verminderd naarmate de dag vordert. Het is dus vaak nuttig om ook veranderingen in de maximale slaapperiode te onderzoeken, wat een meer gevoelige metriek kan opleveren(figuur 2F).
| Methode van slaapgebrek | Totaal aantal papers | % papier / techniek | Avg-herstel geëvalueerd |
| MODULE | 52 | 37.14% | 33 ± 3 |
| Vortexer/Willekeurig schudden | 49 | 35.00% | 18 ± 3 |
| Hand-Deprivatie | 9 | 6.43% | 36 ± 11 |
| Thermogenetische SD | 15 | 10.71% | 36 ± 12 |
| Onbepaald | 15 | 10.71% | 29 ± 10 |
Tabel 1: Overzicht van verschillende methoden van slaapgebrek die in de literatuur worden gebruikt. Slechts 116 /254 papers gebruikten slaapgebrek. Het aantal papers dat elke methode gebruikt = "Total # of papers". De fractie van papier met behulp van elke methode = "% papier / techniek". De gemiddelde duur van het geëvalueerde herstel voor elke methode = "Avg-herstel geëvalueerd". SD - Slaaptekort. SNAP - Slaapvernietigend apparaat
| Lengte van SD | Totaal studies |
| < 6 u | 12 |
| 6 u | 23 |
| >6 u & < 12 u | 17 |
| 12 u | 69 |
| >12 u & <24 uur | 7 |
| 24 uur | 19 |
| > 24 uur | 9 |
| Chronische SD | 4 |
| Elke SD | 160 |
Tabel 2. Lengte van slaapgebrek uitgevoerd in verschillende studies. SD - Slaaptekort
Figuur 1. De Sleep Nullifying Apparatus (SNAP). A) Vooraanzicht van het apparaat. De SNAP biedt plaats aan 8 activiteitenmonitoren in twee rijen; houderpennen houden de monitoren op hun plaats. De poten kunnen worden aangepast om het apparaat in de juiste richting te positioneren. B) Close-up van de motor en veer die het apparaat heen en weer wiegen. De motor draait een nok die het apparaat terug kantelt naar de "up" -positie en de veer samendrukt. Het loslaten van de veer van de compressie klikt het apparaat terug naar de "down" -positie. C) Links - Zijaanzicht van het apparaat in de "down"-positie. Houder pinnen beperken monitoren; een monitorkabelsleuf zorgt ervoor dat monitorkabels op hun plaats worden gehouden. Pads helpen de impact van het apparaat dat naar de 'down'-positie knapt te dempen. Rechts - Close-up van de cam. D) Linker zijaanzicht van het apparaat in de "omhoog"-positie. Rechts - De tegenwijzerlingse rotatie van de nok kantelt het apparaat in de 'up'-positie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Experimentele resultaten. A) Slaapplots van Cs vliegt voor de vier dagen van het experiment: de baseline dag (bs), slaapgebrek dag (sd) en twee dagen van herstel (rec1 en rec2). B)Gemiddelde locomotorische activiteit telt van vliegen op de dag van slaapgebrek. Vliegen hadden slaapgebrek van uren 12-24. C) Tijdsloop van slaapgebrek en herstel. Cs-vliegen hadden slaapgebrek van uren 12 - 24 en mochten herstellen van uur 24 - 72. De SNAP beroofde vliegen effectief van >98% slaap, die gedeeltelijk werd hersteld gedurende 48 uur (n = 12 vliegen, herhaalde metingen ANOVA voor tijd, F [70.1470]= 12,97, p < 10-15). D) Percentage van de slaap hersteld gedurende 48 uur. Vliegen herstelden ~ 20% van hun slaap gedurende 12 uur en ~ 36% van hun slaap meer dan 48 h. E) Slaapconsolidatie voor elke dag van het experiment, gemeten aan de hand van de gemiddelde duur van de slaapperiode gedurende de dag. De slaap is meer geconsolideerd op de eerste hersteldag in vergelijking met baseline (p <0,05, t-test). F)Slaapconsolidatie voor elke dag van het experiment, gemeten aan de hand van de maximale duur van de slaapperiode gedurende de dag. De slaap is meer geconsolideerd op de eerste hersteldag in vergelijking met baseline (p <0,05, t-test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Slaap in Drosophila werd onafhankelijk gekenmerkt in 2000, door twee groepen4,5. In deze baanbrekende studies werden vliegen beroofd van slaap door zachte behandeling (d.w.z. handgebrek) en bleek ze een robuuste homeostatische reactie op nachtelijk slaapgebrek te vertonen. Belangrijk is dat het bij elk slaapgebreksexperiment cruciaal is om te controleren op mogelijke verstorende effecten van de methode die wordt gebruikt om het dier wakker te houden. Handdeprivatiestudies zetten de maatstaf voor studies naar vliegenhomeostase als een minimaal verstorend middel om vliegen slaap te ontnemen. De SNAP berooft vliegen efficiënt van de slaap van >98% van de nachtrust en induceert een slaaprebound die vergelijkbaar is met die verkregen met handgebrek4,7.
Sinds de fundamentele studies die slaap bij vliegen definiëren, zijn er een aantal methoden ontwikkeld om slaaphomeostase bij vliegen op een manier met hoge doorvoer te evalueren7,9,39,40,41. We onderzochten ~ 250 artikelen over slaap bij vliegen en vonden ~ 46% van deze gepubliceerde artikelen meldden dat slaapgebrek werd gebruikt om slaapregulatie of -functie te evalueren(tabel 1). Een aantal verschillende methoden veroorzaakte effectief een slaaprebound bij vliegen. Interessant is dat van de studies die slaaprebound hebben geëvalueerd, de protocollen die werden gebruikt voor slaapgebrek en slaaprebound verschilden. In het bijzonder varieerden zowel de duur van slaapgebrek (tabel 2) als de duur waarvoor de rebound werd geëvalueerd (tabel 1) aanzienlijk, wat vergelijkingen van resultaten verkregen met verschillende protocollen mogelijk bemoeilijkte. Het is bekend dat slaaprebound bij vliegen tot 48 uur aanhoudt na slaapgebrek5. Dienovereenkomstig denken we dat een grondige beschrijving van de effecten van een bepaalde slaapmanipulatie op homeostase het best kan worden verkregen wanneer homeostatische rebound wordt geëvalueerd gedurende een herstelperiode van 48 uur.
Het is belangrijk op te merken dat het beroven van vliegen van slaap gedurende de dag niet consequent de slaapdrift verhoogt4. Vandaar dat het starten van een 24-uurs slaaptekortprotocol bij licht aan en doorgaan tot de volgende dag de herstelslaap niet extra zou verbeteren in vergelijking met een 12-uurs slaapgebreksprotocol dat begint bij het uitschakelen van de lichten. In feite kan de berekende slaaprebound lager zijn, omdat deze naast de nachtrust ook niet-homeostatisch gereguleerde slaap overdag omvat. De observatie dat slaapgebrek overdag geen homeostatische rebound induceert, kan echter worden gebruikt om mogelijke verstorende effecten van de methode van slaapgebrek te beheersen. Zo worden vliegen die 's nachts slaapgebrek hebben in de SNAP vergeleken met vliegen die overdag een vergelijkbare stimulus ontvangen7.
Naast het feit dat het wordt gebruikt voor totaal slaapgebrek, door de frequentie van de stimulus te veranderen, kan de SNAP ook worden gebruikt om de slaap7,42chronisch te beperken en te fragmenteren , waardoor aandoeningen van chronisch slaapverlies bij mensen worden nagebootst. Verder kan de SNAP, door stimuli te leveren in stappen van toenemende frequentie, ook worden gebruikt om opwindingsdrempels te meten8. De SNAP is dus een gemakkelijke manier om de slaap van vliegen effectief te beroven en te beperken, de homeostatische respons te evalueren en andere slaapkenmerken te meten.
De SNAP past in een standaard laboratoriumvliegincubator, maar zal zeker vliegen in de incubator verstoren die geen deel uitmaken van het experiment. Gelukkig kan de SNAP op een geïsoleerde locatie worden geplaatst om vliegen te slapen zonder andere lopende experimenten te verstoren. Aangezien de herstelslaap kwetsbaar is, moet ervoor worden gezorgd dat de herstelslaap op een rustige locatie plaatsvindt.
Als aanvulling op studies naar slaapgebrek zijn genetische en farmacologische hulpmiddelen ontwikkeld om de slaap bij vliegen te verbeteren8,43,44. Het vermogen om slaap gemakkelijk bidirectioneel te moduleren, zal vliegslaaponderzoek dus in staat stellen om diepe inzichten te blijven bieden in slaapregulatie en -functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies 5R01NS051305-14 en 5R01NS076980-08 aan PJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Locomotor activity tubes | |||
| Fisher Tissue Prep Wax | Thermo Fisher | 13404-122 | Wax used for sealing tubes |
| Glass tubes | Wale Apparatus | 244050 | We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased. |
| Nutri Fly Bloomington Formulation fly food | Genesee Scientific | 66-113 | Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in. |
| Rotary glass cutting tool | Dremel Multi Pro | 395 | Used to cut 65mm long glass tubes |
| Monitoring Sleep | |||
| DAM System and DAMFileScan software | Trikinetics | Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format | |
| Data acquisition computer | Lenovo | Idea Centre AIO3 | A equivalent computer from any manufacturer can substitute |
| Drosophila Activity Monitors | Trikinetics | DAM2 | These monitors are used to record flies' locomotor activity |
| Environment Monitor | Trikinetics | DEnM | Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded |
| Light Controller | Trikinetics | LC4 | A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off |
| Power Supply Interface Unit for DAM | Trikinetics | PSIU-9 | Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data |
| RJ11 connector | 7001-64PC | Multicomp | DAM monitors accept RJ11 jacks |
| Splitters | Trikinetics | SPLT5 | Used to connect upto 5 DAM monitors |
| Telephone cable wire | Radioshack | 278-367 | Phone cables to acquire data from DAM monitors |
| Sleep Deprivation | |||
| Power supply | Gw INSTEK | GPS-30300 | Power supply for the SNAP |
| Sleep Nullifying Apparatus | Washington University School of Medicine machine shop |
References
- Nath, R. D., et al. The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State. Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).
- Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C.
- Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P.
- Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
- Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. Waking experience affects sleep need in Drosophila. Science. 313 (5794), 1775-1781 (2006).
- Seugnet, L., Suzuki, Y., Vine, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. D1 receptor activation in the mushroom bodies rescues sleep-loss-induced learning impairments in Drosophila. Current Biology. 18 (15), 1110-1117 (2008).
- Donlea, J. M., Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Inducing sleep by remote control facilitates memory consolidation in Drosophila. Science. 332 (6037), 1571-1576 (2011).
- Seidner, G., et al. Identification of Neurons with a Privileged Role in Sleep Homeostasis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 25 (22), 2928-2938 (2015).
- Li, X., Yu, F., Guo, A. Sleep deprivation specifically impairs short-term olfactory memory in Drosophila. Sleep. 32 (11), 1417-1424 (2009).
- Melnattur, K., et al. A conserved role for sleep in supporting Spatial Learning in Drosophila. Sleep. , 197 (2020).
- Seugnet, L., Suzuki, Y., Donlea, J. M., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Sleep deprivation during early-adult development results in long-lasting learning deficits in adult Drosophila. Sleep. 34 (2), 137-146 (2011).
- Donlea, J. M., Ramanan, N., Shaw, P. J. Use-dependent plasticity in clock neurons regulates sleep need in Drosophila. Science. 324 (5923), 105-108 (2009).
- Bushey, D., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila. Science. 332 (6037), 1576-1581 (2011).
- Huang, S., Piao, C., Beuschel, C. B., Götz, T., Sigrist, S. J. Presynaptic Active Zone Plasticity Encodes Sleep Need in Drosophila. Current Biology. 30 (6), 1077-1091 (2020).
- Kirszenblat, L., et al. Sleep regulates visual selective attention in Drosophila. Journal of Experimental Biology. 221, Pt 24 (2018).
- Singh, P., Donlea, J. M. Bidirectional Regulation of Sleep and Synapse Pruning after Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1063-1076 (2020).
- Stanhope, B. A., Jaggard, J. B., Gratton, M., Brown, E. B., Keene, A. C. Sleep Regulates Glial Plasticity and Expression of the Engulfment Receptor Draper Following Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1092-1101 (2020).
- Kayser, M. S., Yue, Z., Sehgal, A. A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila. Science. 344 (6181), 269-274 (2014).
- Kayser, M. S., Mainwaring, B., Yue, Z., Sehgal, A. Sleep deprivation suppresses aggression in Drosophila. Elife. 4, 07643 (2015).
- Szuperak, M., et al. A sleep state in Drosophila larvae required for neural stem cell proliferation. Elife. 7, (2018).
- Vaccaro, A., et al. Sleep Loss Can Cause Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species in the Gut. Cell. 181 (6), 1307-1328 (2020).
- Kempf, A., Song, S. M., Talbot, C. B., Miesenböck, G. A potassium channel β-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep. Nature. 568 (7751), 230-234 (2019).
- Donlea, J. M., Pimentel, D., Miesenböck, G. Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila. Neuron. 81 (4), 860-872 (2014).
- Liu, S., Liu, Q., Tabuchi, M., Wu, M. N. Sleep Drive Is Encoded by Neural Plastic Changes in a Dedicated Circuit. Cell. 165 (6), 1347-1360 (2016).
- Pimentel, D., et al. Operation of a homeostatic sleep switch. Nature. 536 (7616), 333-337 (2016).
- Sitaraman, D., et al. Propagation of Homeostatic Sleep Signals by Segregated Synaptic Microcircuits of the Drosophila Mushroom Body. Current Biology. 25 (22), 2915-2927 (2015).
- Foltenyi, K., Greenspan, R. J., Newport, J. W. Activation of EGFR and ERK by rhomboid signaling regulates the consolidation and maintenance of sleep in Drosophila. Nature Neuroscience. 10 (9), 1160-1167 (2007).
- Seugnet, L., et al. Notch signaling modulates sleep homeostasis and learning after sleep deprivation in Drosophila. Current Biology. 21 (10), 835-840 (2011).
- Seugnet, L., Galvin, J. E., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Persistent short-term memory defects following sleep deprivation in a Drosophila model of Parkinson disease. Sleep. 32 (8), 984-992 (2009).
- Tabuchi, M., et al. Sleep interacts with aβ to modulate intrinsic neuronal excitability. Current Biology. 25 (6), 702-712 (2015).
- Melnattur, K., Zhang, B., Shaw, P. J. Disrupting flight increases sleep and identifies a novel sleep-promoting pathway in Drosophila. Science Advances. 6 (19), 2166 (2020).
- Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Seugnet, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. The perilipin homologue, lipid storage droplet 2, regulates sleep homeostasis and prevents learning impairments following sleep loss. PLOS Biology. 8 (8), (2010).
- Keene, A. C., et al. Clock and cycle limit starvation-induced sleep loss in Drosophila. Current Biology. 20 (13), 1209-1215 (2010).
- Shaw, P. J., Tononi, G., Greenspan, R. J., Robinson, D. F. Stress response genes protect against lethal effects of sleep deprivation in Drosophila. Nature. 417 (6886), 287-291 (2002).
- Andretic, R., Shaw, P. J. Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time. Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).
- Seugnet, L., et al. Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).
- Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory. Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).
- Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026 (2017).
- Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Scientific Reports. 5, 8454 (2015).
- Huber, R., et al.
- Klose, M., Shaw, P. Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression. bioRxiv. , (2019).
- Dissel, S., et al. Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants. Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).
- Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila. PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).
